Bio-MS lezione 1 1

Spettrometria di massa La spettrometria di massa e’ una tecnica che consente di misurare il peso di atomi o molecole. La determinazione della massa, o del peso molecolare e’ sempre utile per individuare l’identita’ di una sostanza.

Per effettuare questa analisi bisogna impartire una carica elettrica alla molecola di interesse, cioe’ l’analita, e successivamente misurare come le traiettorie degli ioni risultanti rispondano nel vuoto a varie combinazioni di campi elettrici e magnetici.

Per piccole specie molecolari, la ionizzazione e’ facilmente ottenibile bombardando l’analita con un fascio di elettroni.

Negli ultimi anni, gli sforzi di molti ricercatori hanno portato alla scoperta di nuove tecniche di ionizzazione in grado di caricare elettricamente molecole estremamente grandi, altrimenti impossibili da ionizzare con metodi tradizionali senza ottenere una totale distruzione del campione

John Fenn, Premio Nobel per la chimica 2002

Bio-MS lezione 1 2

Spettrometria di massa

Per effettuare un’analisi mediante spettrometria di massa bisogna impartire una carica elettrica alla molecola di interesse, cioe’ l’analita, e successivamente misurare come le traiettorie dello ione risultante rispondono nel vuoto a varie combinazioni di campi elettrici e magnetici.

Le traiettorie degli ioni dipendono dal loro

rapporto massa/carica m/z

Bio-MS lezione 1 3

•  Generazione di ioni

•  Separazione delle componenti

•  Rilevamento delle componenti

separate

Lo spettrometro di massa: un prisma molecolare

Bio-MS lezione 1 4

Componenti di uno spettrometro di massa

Camera di ionizzazione

Analizzatore

Rivelatore

Analizzatore a tempo di volo(TOF), quadrupolo (Q)

Fotomoltiplicatore, elettromoltiplicatore

EI, MALDI, ESI

Bio-MS lezione 1 5

Ionizzazione

Condizione necessaria all’analisi spettrometrica e’ la generazione di specie cariche in fase gassosa. Tale processo e’ detto ionizzazione.

Il processo richiede energia

1900 1925 1950 1975 2000

1984 1966 1985 1907

Costruito il primo spettrometro di massa

EI

ESI MALDI

CI

Bio-MS lezione 1 6

Metodi di ionizzazione (1)

Protonazione

Deprotonazione

M + H+ à [M+H]+

M - H+ à [M-H]-

-

O

O

+ NH3

Proteine, peptidi, ammine

Oligonucleotidi, acidi carbossilici

Bio-MS lezione 1 7

Espulsione di elettroni

Addizione cationica

M à M+.

M + Na+ à [M+Na]+

- e-

Metodi di ionizzazione (2)

CH3

+.

OH

OH Na+

Piccole molecole organiche

Carboidrati

Bio-MS lezione 1 8

Come scegliere la modalità di ionizzazione?

Individuare la modalità di ionizzazione più appropriata per l’analisi di un determinato composto è una procedura che si basa essenzialmente su tre fattori

•  Osservazione delle proprietà chimiche della molecola (e.g. proprietà acido-base, presenza di gruppi funzionali, volatilità, etc.)

•  Esperienza (confronto con molecole analizzate con successo nel passato o con dati di letteratura).

•  Verifica pratica (confronto sperimentale tra due o più tecniche di ionizzazione ritenute potenzialmente le più efficaci nella ionizzazione dell’analita in questione).

Bio-MS lezione 1 9

Principali tecniche di ionizzazione

Ionizzazione “hard”

•  EI (electron impact)

Ionizzazioni “soft”

•  MALDI (matrix-assisted laser desorption ionisation)

•  ESI (electrospray ionization)

•  APCI (atmospheric pressure chemical ionization)

Bio-MS lezione 1 10

EI: Ionizzazione per impatto elettronico

Filamento di tungsteno

Fascio di elettroni ad alta energia

Repulsore

All’analizzatore M+. M+. M+.

M

M M

M

M+.

• Funziona su specie volatili, gia’ presenti allo stato gassoso all’atto della ionizzazione

•  Genera ioni ad alta energia, i quali spesso frammentano molto velocemente in seguito alla ionizzazione

•  Adatta alla ionizzazione di piccole molecole ( < 400 Da)

Bio-MS lezione 1 11

EI: Ionizzazione per impatto elettronico

m/z

Inte

nsita

’ •  EI produce ioni ad alta energia.

•  L’elevata energia interna causa una facile frammentazione dello ione molecolare.

•  I frammenti sono rivelati dallo spettrometro di massa. Essi sono comunque utili per caratterizzazione strutturale (identificazione).

Bio-MS lezione 1 12

Spettri EI

Gli spettri di massa generati da ionizzazione EI sono altamente riproducibili. E’ stato quindi possibile generare banche dati di spettri EI ottenuti sperimentalmente da decine di migliaia di composti organici.

L’identificazione di un composto incognito in un campione, quindi, molto spesso si riduce ad una semplice ricerca in banca dati dello spettro EI ottenuto sperimentalmente.

Bio-MS lezione 1 13

MALDI: Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization

•  La tecnica e’ basata su un’analisi in fase solida, anche se il campione di partenza e’ in genere in soluzione.

•  L’energia necessaria alla ionizzazione del campione e’ fornita

sotto forma di radiazione elettromagnetica.

•  La radiazione e’ inviata in pacchetti ad alta intensita’ tramite un

impulso laser

Bio-MS lezione 1 14

MALDI: Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization

Matrice

Campione (proteina,peptide, acido nucleico, zucchero)

Laser ad azoto, emissione a 337 nm (UV)

OH

HO

COOH

H CN

COOH

DHB CHCA Acido 2,5-diidrossi benzoico Acido α-cian-4- idrossicinnamico

Bio-MS lezione 1 15

MALDI- preparazione del campione

Piastra metallica per la deposizione del campione e l’analisi

Soluzione di matrice Soluzione campione

Miscelare (la matrice e’ in forte eccesso)

Depositare sulla piastra metallica (1 µL)

Lasciare cristallizzare

Piastra metallica

Piastra metallica

Bio-MS lezione 1 16

+

+

+

MALDI: Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization

+

+

+

+

+

+ +

+

+

Proteina

Matrice

Impulso laser + 20 kV

All’analizzatore Piastra m

etallica

Bio-MS lezione 1 17

MALDI: Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization

-

-

-

-

-

- -

-

-

DNA/RNA

Matrice

Impulso laser - 20 kV

All’analizzatore Piastra m

etallica

-

-

-

Bio-MS lezione 1 18

MALDI: meccanismo di ionizzazione

Il processo di ionizzazione MALDI sembra non essere basato su un singolo meccanismo. A seconda delle condizioni sperimentali,

possono avvenire differenti processi di ionizzazione.

•  La esistenza di ioni pre-esistenti nei cristalli di matrice è stata dimostrata sperimentalmente. La sublimazione della matrice con conseguente liberazione in fase gassosa degli ioni pre-formati è una delle vie di ionizzazione del MALDI.

•  Il trasferimento di protoni dalla matrice all’analita negli istanti immediatamente successivi al desorbimento è ritenuto un altro meccanismo responsabile della ionizzazione di analiti basici.

•  Nel caso di sostanze capaci di assorbire la luce UV, è anche possibile la fotoionizzazione diretta del campione, con la formazione di ioni radicalici (generalmente non di interesse nel caso delle biomolecole).

Bio-MS lezione 1 19

MALDI: Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization

10700 20000 24000 m/z

0

100

% In

tens

ity

20900

10451

•  Genera per lo piu’ specie monocarica

•  Buona tolleranza a contaminanti e sali

•  Capace di ionizzare proteine (> 300 kDa)

6966

Bio-MS lezione 1 20

MALDI: Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization

10700 20000 24000 m/z

0

100

% In

tens

ity

20900

10451

•  Genera per lo piu’ specie monocarica

•  Buona tolleranza a contaminanti e Sali

•  Capace di ionizzare proteine (> 300 kDa)

6966

[M+H]+

[M+2H]2+

[M+3H]3+

Bio-MS lezione 1 21

Elettrospray - ESI

•  La tecnica e’ basata sulla nebulizzazione di una soluzione contenente il campione da analizzare.

•  L’energia di ionizzazione e’ fornita da un campo elettrico generato tra l’ago di introduzione del campione e lo spettrometro di massa.

www.newobjective.com

Bio-MS lezione 1 22

- + +

+ +

+ +

+

+ + +

+ - - -

-

- - - + +

+ +

-

- -

MS inlet

Alimentatore

Menisco

Elettrospray - ESI Nessun campo elettrico tra l’ago e lo spettrometro

Ionizzazione assente

Bio-MS lezione 1 23

-

Polo positivo

- + +

+ +

+ +

+

+ + +

+ -

- -

-

- - - + +

+ +

-

- -

+ +

+

+

+

+ +

+

+ + + + -

+

+

- -

+

Polo negativo

MS inlet

Alimentatore

Campo elettrico insufficiente Ionizzazione assente

+ - Modalita’ ionizzazione positiva

+ - + 500 V + 50 V

Elettrospray - ESI

Bio-MS lezione 1 24

-

+

+

+

+

+ + + + + +

MS inlet +

+ + +

+

+ +

+ + + +

+

+

+

+ +

+ + + +

+ + + +

+ + + + - +

+ +

+ + +

+ + + -

- - - - + + -

+ +

+ +

+ + -

- +

- + + + +

+ + - -

+ - - +

Alimentatore

Polo positivo Polo negativo

Campo elettrico sufficiente Ionizzazione

+ - + 1000-5000 V + 50 V

+ -

Elettrospray - ESI

Si chiude un vero e proprio circuito elettrico

Bio-MS lezione 1 25

L’elettrospray genera ioni multicarica

+

+

+

+

+

+

+ +

+

+

+

+ +

+ + +

+ +

+

+

+

+

+ +

+ + +

+

La ionizzazione mediante elettrospray di una soluzione contenente una singola proteina generera’ un segnale multiplo allo spettrometro di massa, dovuto al fenomeno della formazione di ioni multicarica.

Goccia generata da elettrospray

La goccia evapora lungo il tragitto che porta allo spettrometro. La proteina ionizzata entra

nello spettrometro di massa

Bio-MS lezione 1 26

Ioni multicarica ++

+

++ + +

++

m/z

Intensita’ relativa (%)

0

100

5000

Massa 8000 8002 8003 8004

Carica 0 2 3 4

m/z 4001 2667 2001

M2+

M3+ M4+

Bio-MS lezione 1 27

500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800 1900 2000 m/z

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

220

Inte

nsity

, cou

nts

996.48 909.86

872.01 1046.40 951.19

805.03

775.27 1101.28

1162.39

1230.61 747.63

1307.49

1394.65 1494.14

1609.01

ESI di una proteina intatta

Bio-MS lezione 1 28

500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800 1900 2000 m/z

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

220

Inte

nsity

, cou

nts

996.48 909.86

872.01 1046.40 951.19

805.03

775.27 1101.28

1162.39

1230.61 747.63

1307.49

1394.65 1494.14

1609.01

ESI : interleuchina-6

+20

+25

+15

La proteina ha un peso molecolare di circa 21 kDa. La ionizzazione ESI impartisce da 10 a 30 cariche alla molecola

1230.61 =

1162.39 =

M+n

M+n+1 n+1

n

Bio-MS lezione 1 29

MALDI & ESI: interleuchina 6

600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800 1900 2000 m/z

0

100

% in

tens

ity

996.48 909.86 872.01 1046.40 951.19

805.03

775.27 1101.28 1162.39

1230.61 747.63 1307.49

1394.65

10700 20000 24000 m/z 0

100

% In

tens

ity

20900

10451

MALDI

ESI

Mw=20904

Mw=20899

Bio-MS lezione 1 30

ESI: sommario

•  Capace di generare complessi molecolari ionizzati in fase gassosa (very soft)

•  Facilmente interfacciabile con LC

•  Interfacciabile con analizzatori capaci di effettuare MS/MS

•  Nessuna interferenza da parte di matrici

•  Suscettibile alla presenza di sali

•  Miscele complesse possono ridurre la sensibilita’ dell’analisi

•  La presenza di ioni multicarica puo’ confondere, specialmente nel caso di miscele complesse

•  Il campione da analizzare deve essere puro (ma abbiamo spesso LC come introduzione del campione)

Pro Contro

Bio-MS lezione 1 31

MALDI: sommario

•  Capace di ionizzare biopolimeri fino a 1 MDa (1,000,000)

•  Piu’ tolleranza nei confronti di sali ed impurezze rispetto all’elettrospray

•  Spettro facile da interpretare.

•  Ioni background sotto i 700 m/z escludono l’applicabilita’ del MALDI a piccole molecole (ma…)

•  Condizioni acide possono causare degradazione del campione (raramente osservate in analisi di peptidi).

Pro Contro

Bio-MS lezione 2 32

Componenti di uno spettrometro di massa

Camera di ionizzazione

Analizzatore

Rivelatore

La biomolecola da analizzare viene ionizzata (i) mediante irraggiamento laser della biomolecola stessa dispersa in una matrice cristallina (MALDI); (ii) direttamente da una soluzione, nebulizzandola in presenza di un campo elettrico (ESI).

Gli ioni vengono separati in base al loro rapporto m/z. La separazione puo’ avvenire attraverso filtri di massa (quadrupoli), facendo viaggiare gli ioni in un tubo di volo (TOF), o confinandoli in trappole ioniche (IT, FTICR).

Gli ioni vengono inviati dall’analizzatore al detector, che amplifica la corrente ionica diversi ordini di grandezza, generando impulsi che compongono lo spettro di massa finale.

Bio-MS lezione 2 33

Esempio di rivelatore: moltiplicatore di elettroni

Uno ione dall’analizzatore 106 elettroni

Serie di dinodi

L’urto di un singolo ione proveniente dall’analizzatore causa una cascata di elettroni. L’impulso elettrico viene successivamente digitalizzato

Bio-MS lezione 2 34

Analizzatori: tipologie

•  Tempo di volo (TOF)

•  Quadrupolo (Q, triplo quadrupolo TQ)

•  Trappola ionica (IT, trappola lineare LT)

•  Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance (FTICR)

•  Orpitrap

Bio-MS lezione 2 35

Analizzatore a tempo di volo P

ushe

r, 10

-20

kV

Rivelatore

+

+ +

Ionizzazione

Campo elettrico

Campione

Assenza di campo elettrico

Ek= ½ mv2

Eel=ezU

Bio-MS lezione 2 36

Analizzatore a tempo di volo

•  In un analizzatore a tempo di volo (TOF), gli ioni vengono separati all’interno di uno spazio di 1-2 metri compreso tra la sorgente di ionizzazione ed il rivelatore, detto tubo di volo.

•  Ioni aventi una massa elevata viaggiano nel tubo di volo con velocita’ ridotta, arrivando con ritardo al rivelatore rispetto a ioni piu’ piccoli.

Bio-MS lezione 2 37

Quadrupolo

+ (U + (Vcos ωt))

- (U + (Vcos ωt))

Al rivelatore

Dalla sorgente

Bio-MS lezione 2 38

Quadrupolo

m/z 500

m/z 1500

m/z 100

Al rivelatore Dalla sorgente

Dalla sorgente

Dalla sorgente

A dati potenziali U e V solo ioni ad un preciso m/z attraverseranno il filtro a quadrupolo

Bio-MS lezione 2 39

Quadrupolo •  E’ l’analizzatore di massa piu’ comune. (molto utilizzato in strumenti da banco GC-MS relativamente economici).

•  Separa gli ioni nello spazio a seconda del loro rapporto m/z.

•  Usando il voltaggio appropriato, e’ possibile fare si’ che solo ioni con un determinato m/z attraversino il quadrupolo e raggiungano il rivelatore.

•  Il quadrupolo può essere usato come filtro ionico: possiamo settare i potenziali in modo da fare passare solo ioni aventi un determinato m/z ad un secondo analizzatore di massa o ad una camera di collisione (vedi MS/MS)

Bio-MS lezione 2 40

Ionizzazione MALDI TOF

Piastra metallica

Laser

Tempo (m/z)

Inte

nsita’

Segnale amplificato

Spettrometro MALDI-TOF

Rivelatore

Bio-MS lezione 2 41

ESI-QqTOF analizzatore ibrido

pusher rivelatore ESI

m/z

Intensita’

0

100

1000

Quadrupolo Quadrupolo

Bio-MS lezione 2 42

Spettrometria di massa in tandem

•  La ionizzazione per EI produce frammentazione degli ioni molecolari. Tali frammenti sono essenziali per ricavare informazioni strutturali sulle molecole analizzate.

•  Al contrario, le tecniche di ionizzazione soft (MALDI, ESI, APCI) non producono frammentazione molecolare.

•  Per ottenere informazioni strutturali sulle biomolecole ionizzate, risulta quindi necessario effettuare MS/MS (spettrometria di massa in tandem).

Bio-MS lezione 2 43

Spettrometria di massa in tandem (MS/MS)

La spettrometria di massa in tandem consiste nell’effettuare una doppia analisi di massa su un determinato campione. Per fare cio’, e’ possibile utilizzare due analizzatori in serie, o utilizzare lo stesso analizzatore a tempi diversi.

m/z

Inte

nsita’

0

100

1000 m/z 0

100

1000

MS2: MS/MS su m/z 850.1

Inte

nsita’

MS1: spettro MS da 0 a 1000 m/z

650.4

850.1

401.3 80.4

198.6 678.8

466.7

850.1

Selezione del picco

Bio-MS lezione 2 44

MS/MS su QqTOF

pusher Rivelatore Da ESI

m/z

Relative intensity (%)

0

100

1000

Full scan MS

m/z

Relative intensity (%)

0

100

1000

MS/MS su

Q0: selezione

Q1: Camera di collisione

Free carnitine PKU

CV MSUD

CV

CV

CV

Homocystinuria

CV Citrullinemia

CV GA-I

CV CPT-I/II

CV VLCAD

CV SCAD

CV ASA

CV PMA/MMA

CV

CV CV

CV CV CV CV

CV

CV

CV CV

CV

CV

CV

Bio-MS lezione 2 46

MS/MS su triplo quadrupolo (QQQ)

• Permette esperimenti di MS/MS.

•  In modalita’ SRM (selected reaction monitoring) fornisce sensibilita’ elevatissime.

•  SRM = uno ione di interesse viene selezionato in continuo in Q1 (il filtro lascia sempre passare solo quello specifico ione), frammentato in Q2, ed uno o piu’ frammenti specifici vengono filtrati da Q3 e mandati al detector.

frammentazione frammenti

Q1 Q2 Q3

Bio-MS lezione 3 47

Colonna HPLC

Campione

ESI

Fase mobile

Spettrometro

di

massa

HPLC-ESI-MS

Bio-MS lezione 3 48

LC-MS/MS: SRM

Nel cromatogramma superiore, è riportato il segnale registrato dallo spettrometro in modalità

SIM (m/z 504)

Nel cromatogramma inferiore, lo stesso

campione è analizzato in modalità SRM. L’analisi è

più selettiva (viene rilevato solo il picco di interesse), ed aumenta notevolmente il rapporto segnale/rumore, pur diminuendo l’intensità

assoluta del segnale.

Q1 Q2 Q3

504 140, 380

SIM 504

SRM

504 à 380,

504à 140