C.I. MEDICINA DI LABORATORIO

MICROBIOLOGIA CLINICACL MEDICINA E CHIRURGIA – AA 2014-2015

Modulo 6: Diagnosi microbiologica delle

infezioni del sistema nervoso

Giovanni Di Bonaventura, PhD

Università “G. d’Annunzio” di Chieti-Pescara

Nuovo Polo Farmacia, corpo D, III livello (tel 0871 3554812)

Centro Scienze dell’Invecchiamento (Ce.S.I.), V livello (tel 0871 541519)

E-mail: gdibonaventura@unich.it

Sistema nervosoOrganizzazione

• Sistema Nervoso Centrale (SNC): encefalo e

midollo spinale

• Sistema Nervoso Periferico (SNP): nervi periferici

• Fisiologicamente sterile:

– assenza di flora “autoctona”

• Difese naturali del SN:

– cranio e vertebre

– cellule di microglia e macrofagi

– presenza di una Barriera Emato-Encefalica (BEE) e

della Barriera Emato-fluido cerebrospinale (BECS)

che impediscono l’accesso cerebrale/meningeo a:

• microrganismi

• farmaci (es. antibiotici)

• sistema immune

Sistema NervosoInfezioni

• Infezioni del SNC:

– Meningiti (acute o croniche)

– Encefaliti (acute o croniche)

– Ascessi cerebrali

• Infezioni del SNP:

– Tetano

– Sindrome Guillian-Barrè

– Botulismo

MeningiStruttura ed organizzazione

3 membrane connettivali (nell’insieme

costituiscono la barriera emato-encefalica) a

rivestimento del cervello e della colonna

vertebrale:

– Dura madre

• doppio strato: il primo a contatto con il

periostio; l’altro, a contatto con le meningi

(decorre attraverso il foramen magnum,

copre CN’s)

– Aracnoide

• tesa a ponte sopra i solchi cerebrali

• granulazioni aracnoidali che si proiettano nei

seni venosi, (dove il liquor diffonde verso il

torrente ematico)

• spazio subaracnoidale occupato dal liquor

cefalo-rachidiano

– Pia madre

• delicata, altamente vascolarizzata

• a contatto con il cervello e la colonna

vertebrale

Con il rachide, le meningi delimitano tre spazi:

vertebra < spazio EPIDURALE < dura madre

dura madre < spazio SUBDURALE < aracnoide

aracnoide < spazio SUBARACNOIDALE < pia madre (contiene il liquor; sede

specifica di esordio della meningite)

Ciascuno di questi spazi è sede di infezioni distinte

MeningiSpazi meningei

I villi estremamente vascolarizzati della pia

madre si proiettano in 4 ventricoli

all’interno dell’encefalo e sono rivestiti da

cellule epiteliali ependimali.

Queste proiezioni, note come plessi

coronoidei, sono i siti nei quali la

componente fluida del sangue è

modificata attraverso secrezione e

assorbimento di certi soluti e convogliata

all’interno dei ventricoli sotto forma di

liquido cefalorachidiano (LCR) o liquor

(adulti: 400-600 ml/die; volume totale: 40-

60 ml nei neonati e 100-160 ml negli

adulti).

Il liquor circola nei ventricoli e nello

spazio subaracnoidale, attorno

all’encefalo ed alla corda spinale e ritorna

al sistema circolatorio sanguigno

attraverso i villi subaracnoidali che

proiettano nel seno sagittale superiore

nella volta interna del cranio.

Meningite: definizione e tipologia

Definizione

La meningite è definita come l’infiammazione delle meningi: pachimeningite

(dura madre), leptomeningite (pia madre, aracnoide). Se severa, può evolvere in

encefalite, stato infiammatorio del cervello. Può essere causata da agenti infettivi,

metastasi, agenti chimici e/o farmaci.

Tipologia

FULMINANTE: evoluzione rapida (coma, shock), quasi sempre irreversibile.

ACUTA: esordio e sviluppo nel corso di ore o di pochi giorni.

SUBACUTA: decorso lento e insidioso, con segni meningei sfumati (solitamente

causata da bacillo tubercolare oppure da miceti).

RICORRENTE: ripetuti episodi anche a distanza che sono espressione

generalmente di un difetto dell'ospite, o dell'anatomia locale oppure delle difese

antibatteriche immunologiche (trauma cranico, pazienti HIV+, ecc).

DECAPITATA: forma il cui decorso è attenuato per il precoce intervento con

terapia antibiotica (N. meningitidis; alta frequenza di falsi negativi al colturale).

Meningitepatogenesi

I microrganismi debbono superare la barriera morfo-funzionale (emato-liquorale,

emato-encefalica, meningo-encefalica) posta a protezione di LCR e SNC:

– via ematogena (batteriemia, viremia): la più frequente

– per contiguità:

• da focolai infettivi parameningei (otiti, sinusiti, mastoiditi, ascessi cerebrali) attraverso la

lamina cribrosa etmoidea, la guaina olfattoria, plessi corioidei, i vasi ematici/linfatici;

• comunicazioni anomale post-chirurgiche e traumatiche fra gli spazi subaracnoidali e siti

colonizzati (naso e seni paranasali, secondaria a frattura della base cranica);

• drenaggio di LCR;

– per contagio diretto: rachicentesi, ferite penetranti, traumi cerebrali aperti, fratture,

interventi neurochirurgici

Site all’interfaccia tra circolo sistemico e parenchima cerebrale, le leptomeningi - ed in

particolare gli spazi di Virchow-Robin - rappresentano il principale sito di

ingresso dei microrganismi.

Il liquor è veicolo di diffusione dell’infezione che, se non contrastata, si estende al

parenchima cerebrale (meningo-encefaliti).

Le forme PRIMARIE, si sviluppano in assenza di infezioni extra-cerebrali.

Nelle forme SECONDARIE, l’infezione diffonde per contiguità dai foci infettivi

parameningei, o per metastasi da foci situati a distanza (tifo, polmonite,tubercolosi).

Photomicrograph (original magnification, x20; hematoxylin-eosin stain) of a

coronal section through the anterior perforated substance shows two arteries

(straight arrows) with surrounding VR spaces (curved arrows).

Epitelio mucosale

IgA seceretorie

Attività ciliare

Abs anti-capsulari

Complemento

Abs specifici

BEE

ridotti livelli di fagociti e IgG

ridotta attività opsonizzante

Fimbrie (pili)

Capsula

Proteasi vs IgA

(pneumococco)

Endocitosi (menigococco)

Rottura tight-junctions epitelio

colonnare (H. influenzae)

Recettori specifici (H.

influenzae, N. meningitidis)

Fimbrie (pili)

Associazione con

monociti

Capsula

Meningite batterica: patogenesi

Meningite batterica: patogenesi

Meningiteeziologia

• Le meningiti batteriche vengono indicate con il termine “meningiti

purulente” (a liquor purulento)

• Le meningiti non batteriche, ad esempio quelle virali, vengono

indicate come “meningiti asettiche” (a liquor trasparente)

– Il liquor risulta trasparente anche in caso di infezione da M. tuberculosis, Funghi,

Leptospira

• La causa più frequente di meningite è una infezione virale che

generalmente si risolve in assenza di trattamento.

• Le meningiti batteriche sono meno frequenti ed estremamente più

gravi (vs virali); possono causare exitus o danno cerebrale anche in

presenza di trattamento.

• Altri agenti eziologici: parassiti, Chlamydia spp, Mycoplasma spp,

Spirochete, Rickettsiae.

Meningite batterica epidemiologia Incidenza: 1 milione di casi/anno (mondo); 3-12 casi/100.000 persone/anno (Italia)

Mortalità: 5% negli adolescenti, 25% nei neonati e negli adulti

Fattori di rischio: età, gravidanza, ambienti comunitari, immunocompromissione

Trattamento disponibile: terapia antibiotica (“mirata” vs l’agente eziologico)

Reservoir: uomo

Eziologia: dipendente dall’età del paziente; tuttavia, le meningiti pneumococciche sono le più

comuni (6.000 casi/anno) ed associate al più alto tasso di mortalità (20-30%):

1. neonati (< 1 mese):

bacilli Gram-negativi (E. coli K1) (50-60%)

streptococchi gruppo B (Streptococcus agalactiae) (20-40%)

Listeria monocytogenes (2-10%)

2. bambini e ragazzi fino a 15 anni:

Neisseria meningitidis (25-40%; max incidenza nel 1° anno di vita)

Streptococcus pneumoniae (10-20%)

Haemophilus influenzae tipo b (25-40%; in declino, per vaccinazione)

3. adulti (anziani, immunocompromessi):

Streptococcus pneumoniae (30-50%)

Neisseria meningitidis (10-35%) (causa principale di fenomeni epidemici)

Staphylococcus aureus (5-15%)

bacilli Gram-negativi (anziani) (1-10%)

Meningite da anaerobi: associata a foci contigui di infezione (otite, sinusite, faringite, ascesso

cerebrale, tumori testa/collo, interventi chirurgici o ferite infette, post-trauma, post-operatorio

neurochirurgico).

A

B

C

D

E

F

Principali agenti eziologici di

meningite batterica:

A. Escherichia coli K1

B. Streptococcus agalactiae

C. Listeria monocytogenes

D. Neisseria meningitidis

E. Haemophilus influenzae

F. Streptococcus pneumoniae

Meningiti virali (“asettiche”)

• Decorso meno grave della meningite batterica: benigno a

risoluzione spontanea

• Sindrome caratterizzata da comparsa acuta di sintomi

meningei (febbre, cefalea, fotofobia) ma senza rigidità nucale

• La meningite asettica può avere varia eziologia, sebbene più

frequentemente causata da un agente virale:

– M. tuberculosis

– Funghi

– Leptospira

• Aspetto del liquor: trasparente, mai purulento

• Cellularità del liquor: pleiocitosi (inizialmente mista neutrofilo-

mononucleare, quindi linfomonocitica)

Meningite viraleepidemiologia

Incidenza: 1 milione di casi/anno (mondo); 5-35 casi/100.000 persone/anno (Italia)

Mortalità: decorso meno grave della meningite batterica: benigno a risoluzione

spontanea

Fattori di rischio: età, gravidanza, ambienti comunitari, immunocompromissione

Trasmissione: principalmente interpersonale, ma anche vettori animati (artropodi) per

Arbovirus.

Incubazione: Variabile: 3-6 gg (Enterovirus), 2-15 giorni (Arbovirus)

Trattamento disponibile: generalmente ad autorisoluzione.

Reservoir: uomo (Enterovirus, Adenovirus, Morbillivirus, Herpes Simplex, Varicella) o

naturale (uccelli per Arbovirus)

Eziologia: le meningiti da Enterovirus sono le più comuni (85%):

Enterovirus (Poliovirus, Coxsackievirus, Echovirus)

Herpesvirus (HSV 1/2, Varicella-zoster, Epstein Barr, ytomegalovirus).

Togavirus (Eastern equine, Western equine, Venezuelan equine; St. Louis,

Powasson, California, West Nile)

Mixo/paramyxovirus (Influenza/parainfluenza, Parotite, Morbillo)

Miscellaneous (Adenovirus, LCM, Rabbia, HIV)

Gli Enterovirus rappresentano la forma più frequente di

meningite asettica stagionale

Meningite viraleepidemiologia

Meningite virale: patogenesi

Colonizzazione

mucosa nasale

Sede

intracellulareviremia nervi

olfattivi

BEE

Sopravvivenza

nel SNC

• Fattori virali:

– Dimensione inoculo

– Virulenza del

microrganismo

– Neurotropismo

(rabbia, HSV tipo I)

Infezioni del SNCMeningite: diagnosi clinica

Insieme di segni/sintomi presenti indipendentemente dalla

natura eziologica dell’infezione:

Infezioni del SNCMeningite: diagnosi di laboratorio

• Il sistema nervoso attua strategie atte a limitare l’infiammazione, perché i suoi

effetti potrebbero essere più deleteri dell’agente patogeno che l’ha innescata.

• Le infezioni del SNC, la meningite in particolar modo, rappresentano una vera

emergenza medica. Debbono quindi essere:

– riconosciute tempestivamente

– correlate, possibilmente, con l’agente patogeno

– trattate immediatamente sulla base della eziologia

• Il maggior contributo alla diagnosi eziologica è sicuramente dato dallo

studio microbiologico del LCR. L’esame microbiologico si basa sulla ricerca

diretta dell’agente infettivo (esame microscopico, ricerca di antigeni

batterici/fungini, amplificazione genica), sugli esami colturali del liquor che

vanno di norma associati alla contemporanea esecuzione dell’emocoltura ed

alla ricerca della risposta anticorpale antimicrobica.

• Il sospetto di meningite richiede quindi il prelievo di LCR mediante esecuzione

della puntura lombare, anche in presenza di sintomatologia sfumata.

• L’analisi di base del LCR si effettua in urgenza ed il laboratorio svolge

un ruolo fondamentale.

Analisi del liquor cefalorachidianoPercorsi pre-analitici

• LCR è un materiale biologico molto prezioso: il prelievo, l’utilizzo e la

sua conservazione debbono essere previamente ed accuratamente

concordati tra il Clinico ed il Laboratorio per fare in modo che le procedure

analitiche abbiano inizio immediatamente dopo il prelievo del campione.

• La raccolta andrebbe effettuata, quando possibile, prima dell’inizio della

terapia antibiotica poiché essa:

– modifica il significato diagnostico di varie tecniche

– interferisce con l’isolamento colturale: false negatività

In caso contrario, bisogna avvertire il Laboratorio affinchè si possano

mettere in atto procedimenti in grado di minimizzare gli effetti inibitori sui

microrganismi (resine che rimuovono gli antibiotici, aumento dei volumi

colturali e di liquor per diluire l’effetto inibente)

• E’ necessario segnalare la sede di prelievo (lombare, ventricolare,

cistico), poiché i valori di riferimento sono, di norma, attribuiti al liquor

lombare.

Prelievo di LCRpuntura lombare (rachicentesi)

• Operare in asepsi: accurata disinfezione della cute

nella regione di prelievo

• Il paziente viene invitato a sdraiarsi su un fianco

incurvandosi in avanti per separare i processi spinosi

delle vertebre lombari

• Inserimento ago nel canale spinale generalmente tra

L3-L4, ma anche L4-L5 o L5-S1

• Il liquor può anche essere ottenuto dal ventricolo,

cisterna o fontanelle, o dal drenaggio di riserva

• Prelievo LCR (pressione > 600 mm Hg: fuoriuscita

“spontanea”)

Fase pre-analiticaRaccolta del LCR

E’ consigliabile prelevare 3 campioni, numerati sequenzialmente: #1 per chimica-

fisica, #2 per coltura e molecolare, #3 per microscopia e ricerca Ag.

• Standardizzare il volume da prelevare:

– media: 9-12 ml (3-4 ml/provetta; minimo 2 ml); max vol prelevabile (adulto): 15-20 ml

– raccolta in provette sterili, fondo conico, con tappo a vite (siliconate, per evitare

l’adesione dei monociti alle pareti), numerando i campioni in maniera sequenziale

– possibilità di confrontare diversi prelievi (intra- inter-paziente)

– volumi maggiori o campioni ripetuti per ricerca di M. tuberculosis o funghi

• Evitare contaminazione ematica e/o cutanea (principale causa di errore pre-analitico):

– contaminazione ematica: generalmente secondaria al trauma da puntura lombare

(diminuzione tracce ematiche dal 1o al 3o campione); non processare il campione in

presenza di massiccia contaminazione (inibitori di crescita batterica e/o PCR)

– il 3° campione è destinato al colturale (meno soggetto a contaminazioni cutanee)

• Seminare, al momento stesso del prelievo, parte del liquor in 2 flaconi (aerobi e

anaerobi) per emocoltura

Fase pre-analiticaRaccolta di altri campioni

• Prelevare contestualmente anche campioni di sangue per:

– indagini biochimiche e sierologiche (emocromo per leucocitosi neutrofila)

– emocoltura per ricerca di funghi/batteri indicanti una sottostante infezione sistemica

– diagnostica sieroimmunologica

• Tamponi: i tamponi (nasale, faringeo e vescicolare) devono essere trasportati tramite

apposito terreno per la ricerca dei virus e batteri.

• Feci: le feci, per l’eventuale ricerca di enterovirus, devono essere raccolte in contenitori

sterili.

Fase pre-analiticaTrasporto del campione

• Inserire i campioni in un contenitore rigido di plastica a chiusura ermetica

(trasporto in “sicurezza biologica”)

• Inviare i campioni in laboratorio entro 15-30 min (max 2 h) dal prelievo:

– ipotonicità del liquor causa la lisi dei neutrofili

– diminuzione della vitalità batterica: 32% dopo 1 h, 50% dopo 24 h

• Trasportare a temperatura ambiente, evitando la refrigerazione:

– N. meningitidis, H. influenzae, S. pneumoniae sono organismi “esigenti” che non

potrebbero sopravvivere a lunghi tempi di trasporto od a variazioni di temperatura

(microrganismi termosensibili)

– è consigliabile congelare il campione, residuo dalla esecuzione dell’esame colturale

e microscopico, per indagini successive (ricerca virus, mediante PCR)

– trasporto in contenitori privi di ossigeno per la ricerca/coltura di anaerobi (utilizzo

del flacone emocolturale per “anaerobi”)

Diagnosi di meningiteFase analitica

Il campione di LCR viene quindi sottoposto alle seguenti indagini:

Esame MACROSCOPICO (colore, aspetto, surnatante)

Esame MICROSCOPICO (colorazioni per microrganismi; citometria)

Esame CHIMICO-FISICO (protidorrachia, glicorrachia, pressione, etc.)

Se eziologia BATTERICA:

1. Ricerca di ANTIGENI BATTERICI

2. Isolamento COLTURALE ed ANTIBIOGRAMMA

Fase analitica Caratteristiche macroscopiche del LCR

ASPETTO:

Grado di torbidità: limpido (“acqua di roccia”), opalescente, torbido

Sulla base dell’aspetto del liquor, le meningiti sono classificate in:

meningiti a liquor limpido (opalescente, ma mai purulento,

smerigliato per pleiocitosi). Eziologia prevalentemente virale, ma

anche batterica (tubercolare, Brucella, Salmonella, Leptospira,

Listeria) o protozoaria (Toxoplasma, Trypanosoma).

meningiti a liquor torbido (purulento, fuoriesce ad alta

pressione). Indicativo di eziologia batterica, fungina (Candida,

Mucor), protozoaria (Naegleria, Acanthamoeba).

PRESENZA DI SANGUE O COAGULO:

La presenza di globuli rossi nel LCR può essere conseguente a:

emorragia intra-cerebrale o sub-aracnoidea (presenza uniforme

dei globuli rossi in tutti i campioni sequenziali da 1 a 3);

traumatismo da rachicentesi con contaminazione di sangue

periferico (riduzione dei conteggi sequenziali)

presenza di coagulo (coagulo “a ragnatela” nella meningite

tubercolare)

Fase analiticaCaratteristiche macroscopiche del LCR

COLORE:

incolore

xantocromico: giallo-arancio (ricco di proteine, bilirubina)

eritrocromico: contaminazione ematica (lesione subaracnoidea)

ASPETTO SOPRANATANTE (a seguito di centrifugazione):

xantocromico, colorazione giallognola nel sopranatante del

centrifugato (indica emorragia subaracnoidea)

trasparente e privo di colorazione (indica rachicentesi

traumatica)

LCR eritrocromico

LCR xantocromico

Fase analiticaEsame microscopico

Conteggio cellulare, sul campione non centrifugato, preferibilmente sull’ultimo

prelevato, utilizzando una camera di conteggio. I conteggi non devono essere

eseguiti su campioni con coagulo:

conta dei leucociti totali

conta differenziale dei leucociti: polimorfonucleati (PMN) vs mononucleati (LINF),

eseguita su conteggio totale > di 5x106 leucociti/litro.

conta eritrociti eseguita su due campioni, in caso di sospetta emorragia

Una pleiocitosi polinucleata indica una eziologia batterica, mentre una pleiocitosi

mononucleata indica una eziologia virale.

La meningite virale o tubercolare, associate generalmente a linfocitosi del LCR,

presentano nelle fasi precoci dell’infezione una predominanza liquorale neutrofila.

Bisogna inoltre ricordare che: i pazienti neutropenici non sono in grado di produrre efficienti o caratteristici polimorfonucleati od una

risposta di tipo neutrofilo nel LCR

in pazienti con shock settico e complicanze sistemiche si hanno basse conte cellulari

Fase analiticaEsame microscopico

LCR, pleiocitosi neutrofila LCR, pleiocitosi mista neutrofila/linfocitaria

LCR, pleiocitosi linfocitaria

Fase analiticaEsame microscopico

Ricerca di microrganismi mediante osservazione microscopica, eseguita sul

pellet ottenuto dopo centrifugazione del liquor si basa sulle seguenti colorazioni:

Gram:

diplococchi Gram- (N. meningitidis), diplococchi Gram+ (S. pneumoniae), coccobacilli

Gram- (H. influenzae)

sensibilità: 60-80% in assenza di terapia antibiotica; 40-60% nei pazienti in

trattamento. Sensibilità ridotta (23-36%) in caso di L. monocytogenes per scarsa

carica batterica.47

specificità per N. meningitidis, H. influenzae e S. pneumoniae: 97-98.5%.

può essere l’unica evidenza laboratoristica per meningite: 4% di 875 pazienti in uno

studio danese.35

blu di metilene (morfologia cellulare)

inchiostro di china (capsula di C. neoformans)

Ziehl-Nielsen e auramina-rodamina (micobatteri)

arancio di acridina (batteri e miceti):

fluorocromo che si intercala nella struttura dell’acido nucleico

alta sensibilità ma non differenzia Gram+ vs Gram-

Fase analiticaEsame microscopico

LCR, colorazione Gram. A) Streptococcus pneumoniae; B) Neisseria

meningitidis; C) Haemophilus influenzae; D) Escherichia coli.

A B

C D

Fase analiticaEsame microscopico

LCR. A) Colorazione inchiostro India: capsula di Cryptococcus neoformans; B) Colorazione

auramina-rodamina: Mycobacterium tuberculosis; C) Colorazione arancio di acridina:

Staphylococcus aureus; D) Colorazione blue di metilene: Neisseria meningitidis.

A B

C D

Fase analiticaEsame chimico-fisico

L’esame chimico-fisico viene effettuato previa centrifugazione e rimozione del

surnatante, poiché le cellule - lisandosi con il tempo - libererebbero il loro

contenuto proteico in sospensione:

[glucosio]: (ipoglicorrachia), (iperglicorrachia)

Ipoglicorrachia (infezioni batteriche, fungine, tubercolari). L. monocytogenes:

ipoglicorrachia soltanto nel 20% dei casi.

[glucosio]liquor / [glucosio]sangue < 0.25 (infezioni batteriche).

Normoglicorrachia (infezioni virali)

[proteine]: (ipoprotidorrachia), (iperprotidorrachia)

Forte iperprotidorrachia, proteina C-reattiva (infezioni batteriche)

Moderata iperprotidorrachia (infezioni virali)

Aumentata iperprotidorrachia (infezioni fungine, tubercolari)

[LDH]liquor, LDH (infezioni batteriche)

Esame del sedimento: previa colorazione con May-Grunwald-Giemsa per lo

studio delle caratteristiche morfologiche e strutturali.

LCR: caratteri chimico-fisici e cellulari

Eziologia

Parametro

(valore fisiologico adulto)Batterica Virale

Fungina, Tubercolare,

Leptospira

Pressione

(35-45, seduto/15-20 cm H2O,

dec. laterale)

> 300 mm 200 mm 300 mm

GB

(0-5 x 106/L)200-20.000 100-1.000 < 500

%PMN

(0)> 80% 1-50% 1-50%

Glucosio

(45-85 mg/dL)< 45 ↓ 45-85 < 45 ↓↓

Proteine

(15-45 mg/dL)> 100 < 100 > 100

Lattato

(mg/dl)> 30 0 0

Gram + - -

Citologia - - +

Aspetto

(limpido, incolore)purulento limpido limpido/smerigliato

Fase analiticaRicerca di antigeni batterici Costosi e di controversa affidabilità, tali tests dovrebbero essere utilizzati su LCR

SOLO in caso di conteggi anomali di cellule (immunodeficienza con deficit GB), di

esame negativo al Gram e quando LCR e le emocolture permangono negative

per oltre 48 ore (pregressa antibiotico-terapia).

Il Clinico deve essere informato che sebbene una positività al lattice possa indicare la

presenza di un agente infettivo, un risultato negativo non può essere considerato

come “finale”.

Tests al lattice: consentono la diagnosi eziologia in quanto i batteri che comunemente

causano meningite presentano sulla loro superficie antigeni di natura polisaccaridica

che possono essere rilevati dal latex test. Vengono ricercati gli antigeni solubili

polisaccaridici specifici di:

– Streptococcus pneumoniae

– Haemophilus Influenzae di tipo b

– Neisseria meningitidis (gruppi A, B, C, Y/W135)

– Esherichia coli (gruppo K1)

– Streptococcus agalactiae (streptococco beta-emolitico di gruppo B)

– Cryptococcus neoformans

Test immunocromatografico: elevata sensibilità per la ricerca dell’antigene solubile di

S. pneumoniae nel liquor o nelle urine.

Fase analiticaEsame colturale

Rappresenta il gold standard per la diagnosi della meningite batterica.

Si effettua sul centrifugato di LCR, per la ricerca di:

– aerobi: N. meningitidis, H. influenzae,S. pneumoniae, stafilococchi

– la ricerca di anaerobi è importante nelle meningiti post-neurochirurgiche o shunt

cerebrali-related

– ricerche particolari: miceti (C. neoformans), M. tuberculosis, amebe

Sensibilità: 67-85%, in assenza di terapia antibiotica:35,50

La sensibilità viene ridotta in presenza di trattamento all’atto della rachicentesi:

– da 66 a 62% 35

– da 88 a 70% oppure 59% se in terapia da più di 1 giorno 235

– da 19 a 11% nella meninigite meingococcica 260

35. Bohr, V., et al. 1983. 875 cases of bacterial meningitis: diagnostic procedures and the impact of preadmission antibiotic therapy. Part III of a three-part series. J. Infect. 7:193–202.

50. Bryan, J. P., et al. 1990. Etiology and mortality of bacterial meningitis in northeastern Brazil. Rev. Infect. Dis. 12:128–135.

235. Nigrovic, L. E., et al. 2008. Effect of antibiotic pretreatment on cerebrospinal fluid profiles of children with bacterial meningitis. Pediatrics 122:726–730.

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1997 survey report. J. Infect.40:74–79.

Meningite battericadiagnosi microbiologica Amplificazione genica (PCR) su sangue e liquor: utilizzata per la ricerca diretta di batteri

(Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, Listeria

monocytogenes ) e virus.

• I saggi di PCR sono disponibili come possibilità diagnostica per alcuni microrganismi quali:

Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae e Streptococcus pneumoniae e particolarmente

utili quando l’esame colturale risulta negativo (ad esempio quanto il LCR risulti torbido e sia stata

somministrata chemioterapia). Allo stato attuale delle conoscenze tutte le metodiche molecolarI

basate su amplificazione genica per la messa in evidenza di target batterici in campioni di LCR

devono essere considerate di impiego esclusivamente epidemiologico, mancandone l’adeguata

validazione clinica.

• I test di amplificazione genica (PCR) sul liquor sono soprattutto utilizzati nella diagnosi di

meningite-encefalite virali. L’interpretazione del test deve tener conto di terapie virali precoci in

grado di determinare risultati falsamente negativi.

• Nei casi di probabile meningite/encefalite virale (Tabella 5) è raccomandata la ricerca nel liquor

del genoma di: enterovirus, HSV-1, HSV-2 e VZV.

• Nel caso in cui la ricerca del genoma di HSV risulti negativa in presenza di sospetto clinico e

risonanza magnetica positivi per encefalite erpetica è consigliata la ripetizione del LCR dopo 3-7

giorni per un’ulteriore valutazione molecolare. In presenza di vescicole cutanee o mucose

effettuare ricerche colturali o molecolari per HSV e VZV su tampone cutaneo/mucoso. Un risultato

positivo non indica necessariamente che il microrganismo isolato sia l’agente eziologico

dell’encefalite/meningite, così come un risultato negativo non lo esclude.

• Nel sospetto clinico di infezione da Enterovirus ricercare il virus nel tampone faringeo o nelle feci

mediante isolamento in coltura e metodiche molecolari. L’eventuale positività deve essere

interpretata con cautela: nei bambini piccoli la positività nelle feci può essere dovuta a ceppi

vaccinici.

Meningitediagnosi di laboratorio: ricerca diretta

PCR assay. Amplificazione gene

proteina b (419bp) di M. tuberculosis

su gel agarosio 1.5%.

Lane 1: 100bp DNA marker

Lane 2: CTRL +

Lanes 3,4,5: CSF positivi

Lane 5: CTRL -(Sharma et al, Neurol India 2010)

Colonie di N. meningitidis su

agar cioccolato

Ricerca rapida di antigeni. Tests

di agglutinazione.

Brouwer et al, Clin Microbiol Rev 2010

Costi e tempi di esecuzione

Test Tempo Costo (euro)

Glucosio

La puntura lombare non è esente da rischi: la complicanza più temuta è

‘l’incuneamento’, che si verifica quando le tonsille cerebellari erniano attraverso il

foramen magnum del cranio, comprimendo le strutture cerebrali vitali del peduncolo. Ciò

accade più facilmente in presenza di lesioni cerebrali espanse o di pressione

intracranica aumentata.

Pertanto, i pazienti con sospetto clinico di aumentata pressione intracranica non

dovrebbero essere sottoposti a puntura lombare, mentre quelli con segni neurologici di

lesioni localizzate dovrebbero essere sottoposti a TC prima di altre procedure volte ad

escludere una lesione.

Talvolta il paziente è in condizioni troppo instabili o presenta diatesi emorragica come

risultato di una sindrome settica ed anche in queste condizioni non può essere

sottoposto a puntura lombare.

Nei pazienti con controindicazione alla puntura lombare, si deve conseguire il massimo

impegno per definire la diagnosi microbiologica con ogni altra modalità:

Urine (antigeni batterici)

Markers infiammatori sierici: aumentati livelli di procalcitonina (>=0.5 ng/ml) e

proteina C-reattiva (>=20 mg/l) depongono a favore di una eziologia batterica.

Biopsia cutanea e tampone naso-faringeo: in caso di meningite meningococcica.

Diagnosi di meningite... in assenza di LCR

Markers infiammatori sierici:

Indicano la eziologia dell’infezione (batterica vs virale).84

PCT (0.5 ng/ml), proteina C-reattiva (20 mg/l): eziologia batterica.93

Elevate concentrazioni sono suggestive sebbene non sufficienti per porre diagnosi

di meningite batterica.

Biopsia cutanea:

Campione prelevato mediante biopsia, scraping o aspirazione

colorazione Gram: sensibilità 0.5%192-36%12

isolamento colturale

La accuratezza dell’esame delle lesioni cutanee non è inficiata dalla

presenza di una terapia antibiotica in atto. 12,325

Diagnosi di meningite... in assenza di LCR

12. Arend, S. M., et al. 2006. Prospective controlled study of the diagnostic value of skin biopsy in patients with presumed meningococcal disease. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 25:643–649.

84. De Cauwer, H. G., et al. 2007. Differential diagnosis between viral and bacterial meningitis in children. Eur. J. Emerg. Med. 14:343–347.

93. Dubos, F., et al. 2008. Serum procalcitonin level and other biological markers to distinguish between bacterial and aseptic meningitis in children: a European multicenter case cohort study.

Arch. Pediatr. Adolesc. Med. 162:1157–1163.

192. Levy, C., et al. 2008. Characteristics of meningococcal meningitis in children in France. Arch. Pediatr. 15(Suppl. 3):S105–S110.

325. van Deuren, M., et al. 1993. Rapid diagnosis of acute meningococcal infections by needle aspiration or biopsy of skin lesions. BMJ 306:1229–1232.

Meningite meningococcica.

Rash petecchiale

• ASPETTO: aspetto del LCR ed (eventuale) presenza di coaguli

• MICROSCOPIA

• Conteggio cellulare

– numero di GR (x106 per litro) e

– numero di PMN e linfociti (x 106 per litro), oppure

– numero di PMN e linfociti (% conteggio totale dei GB, riferito a x 106)

– in alcuni casi può essere opportuno fare riferimento al citocentrifugato per la

differenziazione delle cellule mononucleate e delle altre cellule

• Colorazione Gram

– descrizione del(dei) microrganismo(i) osservato(i)

– descrizione dei funghi dotati o meno di capsula (colorazione con inchiostro

d’India o nigrosina

– microscopia per specie Mycobacterium e parassiti

• COLTURALE

– descrizione microrganismi isolati, oppure

– indicazione di assenza di crescita

– risultati delle prove supplementari per ID

Esame LCRrefertazione

Meningiti fungine

Rare e di difficile diagnosi

Cryptococcus neoformans (causa più frequente), Coccidioides immitis

(Messico, America meridionale)

Invade il sangue e raggiunge il cervello soprattutto nell’ospite con immunità

cellulo-mediata compromessa (AIDS; immunosoppressi)

Quadro liquorale: pleiocitosi linfocitaria, aumento quoziente albumina

Identificazione mediante colorazione della capsula (India ink): solo per C.

neoformans

Isolamento colturale

E’ raccomandabile l’utilizzo di volumi maggiori di liquor (almeno 4 ml) per

l’allestimento del vetrino e per la coltura

Ricerca di antigeni + ricerca anticorpale nel LCR per monitorare l’efficacia

della terapia:

aumentati livelli di Abs specifici + ridotta presenza di antigeni = terapia efficace

Ricerca di materiale genico: PCR, non ancora standardizzata

C. neoformans su agar sangue: colonie

didimensioni piccole/medie, con aspetto

mucoide dovuto alla produzione di una

capsula polisaccaridica.

Round

capsulated

fungal organisms

Lymphocytic

infiltrate around

Meningite criptococcica:

sedimento liquorale colorato

con inchiostro di China

Meningite da protozoi

• Le amebe (Naegleria, Acantameba) possono moltiplicarsi in acque

stagnanti nei Paesi tropicali (scarichi fognari).

• Se inalate, raggiungono le meningi attraverso il nervo olfattivo e la

lamina cribrosa etmoidea

• Diagnosi: osservazione microscopica per evidenziare la

caratteristica motilità ameboide

Meningite amebica: sedimento liquorale

con trofozoiti di Naegleria fowleri

Meningite viraleRhabdovirus: diagnosi di laboratorio

• Campioni clinici: strisci corneali, biopsie

cerebrali, biopsie cutanee

• Ricerca di antigeni virali in IF o tramite

PCR

• Rilievo microscopico di cellule neuronali

cerebrali contenenti i corpi del Negri

(inclusioni intracitoplasmatiche)

Cervello rabbico: colorazione IF (in

alto); campione negativo (in basso)Cervello rabbico: colorazione

ematossilina-eosina. Indicati,

i Corpi del Negri.

Diagnosi microbiologica di meningiteEsami microbiologici effettuabili

Sospetto clinico Esame effetuabile Campione biologico Note

Meningite batterica Esame diretto e colturale per

batteri

Liquor (almeno 1 ml)

Trasportare immediatamente

Mantenimento: RT < 2 h

Inviare anche emocoltura (1

flacone x aerobi + 1 flacone x

anaerobi)

Ricerca antigeni batterici mediante

test di agglutinazione

Liquor (0.5-1 ml)

Trasportare immediatamente

Mantenimento: 4°C < 12 h

Lo stesso test può essere

eseguito anche su sangue od

urine

Ricerca antigene S. pneumoniae

(immunocromatografia)

Liquor (0.5 ml)

Mantenimento: RT

Diagnosi microbiologica di meningiteEsami microbiologici effettuabili

Sospetto clinico Esame effettuabile Campione biologico Note

Meningite virale Ricerca DNA virus erpetici (CMV,

ENV, VZV, HSV1, HSV2)

mediante PCR

Liquor (almeno 1 ml)

Mantenimento: