MICROBIOLOGIA AMBIENTALE

Roditori e Lagomorfi

Dott.ssa Piera Anna Martino DBS, PhD, Specialista in Scienza degli animali da laboratorio

DIMEVET - Università degli Studi di Milano

Corso di Perfezionamento

«Benessere dell’animale da laboratorio ed Animal Care (Roditori-Lagomorfi-Specie Acquatiche)»

Milano, 23 marzo 2018 1

Il monitoraggio microbiologico all’interno

di un’animal facility è molto importante e, in

genere, è associato al controllo dello stato

sanitario degli animali stabulati

superfici

aria

acqua

lettiera

mangime

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Valutazione microbiologica associata alla valutazione

di altri parametri quali temperatura, ventilazione, UR,

ecc.

Variazioni/fluttuazioni possono influenzare la

comparsa di patologie ad eziologia infettiva e

condizionare fortemente le risposte degli animali

Ad esempio per roditori e lagomorfi

Valori ottimali di temperatura: 15 - 24°C

Valori dell’umidità relativa: 40 - 60%

Valori medi ricambi d’aria: 10 - 15 cambi/h

Valori medi fotoperiodo: 12 ore di luce e 12 ore di buio

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QUALITÀ DELL’ARIA E SUA INFLUENZA

SULLA STABULAZIONE

Natura del gas Provenienza Limite tollerato

(% del volume)

Proprietà Problemi

(se superato il

limite tollerato)

Anidride

Carbonica

metabolismo

animale,

decomposizione

materie fecali

0,35 Asfissiante -

Ammoniaca decomposizione

materie fecali

0,01 Irritante Irritazione mucose

oculo-congiuntivali

e respiratorie

Idrogeno

Solforato

decomposizione

materie fecali

0,002 Tossico Irritazione mucose,

eccitazione SNC

Metano decomposizione

materie fecali

Tracce Tossico -

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OTU ID

(Silva)

# reads Kingdom Phylum Class Order Family Genus

VrvSpe79 7 Bacteria Proteobacteria Betaproteobacteria Burkholderiales Comamonadaceae Variovorax

Unc69015 3 Bacteria Firmicutes Clostridia Clostridiales Lachnospiraceae Lachnospiraceae_

NK4A136_group

Unc00gqv 3 Bacteria Firmicutes Bacilli Lactobacillales Streptococcaceae Streptococcus

UncO4293 3 Bacteria Firmicutes Bacilli Bacillales Staphylococcaceae Staphylococcus

ShcSp185 1 Bacteria Cyanobacteria Chloroplast o f g

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Nessuna linea guida sulla frequenza di

monitoraggio microbiologico ambientale

… molto dipende dalle caratteristiche stesse della

struttura di stabulazione

Sistema convenzionale Individually ventilated cages

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Nella normale stabulazione …

Gli animali possono essere esposti a molte fonti di potenziali agenti infettivi

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Nella routine dell’animal facility

Se esiste un Fornitore

Valutazione periodica delle loro norme di biosicurezza

e altre misure di quality assurance per ridurre al massimo

la possibilità di contaminazioni a partire

da loro prodotti (audit)

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CIBO

• Portato ad elevate temperature durante

la produzione del pellettato con

diminuzione della carica microbica

• Autoclavato

• Irradiato con raggi gamma

• Maggior attenzione nel caso di diete

particolari non autoclavabili

LETTIERA • Autoclavata

• Irradiata con raggi gamma

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ARIA

• Utilizzo di filtri HEPA, con drastica

riduzione della concentrazione di

microrganismi a trasmissione aerogena

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• Filtrata; ozonizzata; trattata con UV

• Iperclorinata

• Autoclavata

• Osmosi inversa (!!! reservoir di batteri)

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ACQUA

GABBIE E

ALTRE

SUPERFICI

• Trattamenti di disinfezione

– pavimenti

– banconi

• Perossidazione/fumigazione degli

ambienti comprese le suppellettili

• Sanitizzazione/Autoclavaggio delle

gabbie

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IMPORTANTE !

Il primo punto fondamentale è il controllo dei sistemi di

sterilizzazione, come autoclave, stufe a secco, sistemi a

perossido

• Uso di spore strips (indicatori biologici) per la validazione -

efficacia del processo di sterilizzazione/decontaminazione

• spore di:

• Geobacillus stearothermophilus (calore umido)

• Bacillus atropheus (calore secco/ossido di etilene)

• Bacillus pumilus (perossido)

– controlli ogni 3 – 6 mesi

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www.starkamerica.com

www.sgmbiotech.com

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Ma se le condizioni vengono alterate?

Edvard Munch, L'urlo, 1885

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AD ESEMPIO …

Meier T.R. e coll. (2008): JAALAS, 47:2, 63

• Sistemi di abbeverazione automatica estremamente controllati

per mantenere acqua di alta qualità MA non sono ambienti

sterili

• Crescita di batteri plantonici in grado di formare biofilm nei

beccucci

• I batteri derivano dalla fonte di acqua e dalle linee che

forniscono l’acqua non sanitizzate routinariamente

Necessità di monitoraggio ambientale!

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Come, dove e con quali strumenti

è possibile intervenire

con il monitoraggio ambientale?

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QUALI AGENTI BIOLOGICI

POSSONO ESSERE RICERCATI

NELL’AMBIENTE?

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GLI STRUMENTI A DISPOSIZIONE

sponge

tamponi

piastre a contatto

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LE LORO CARATTERISTICHE

Tipo di

campione

Descrizione Target Usi Agenti

biologici

SPONGE Garze/spugne

sterili 5 x 5 cm

Inumidire con

soluzione sterile

Campionamento

mediante

sagoma o su

un’area ben

definita

Campionamento

di un’area

piccola

Solo per

superfici non

porose

Screening di piccole

zone

Valutazione della

contaminazione

Valutazione

efficacia della

decontaminazione

Batteri

Virus

Tossine

biologiche

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LE LORO CARATTERISTICHE

Tipo di

campione

Descrizione Target Usi Agenti

biologici

TAMPONE Tamponi sterili

singoli

Inumiditi con

soluzione sterile

o in terreno di

trasporto

Campionamento

di un’area ben

definita

Campionamento

di un’area molto

piccola

Solo per

superfici non

porose, angoli e

piccole fessure

Screening di zone

molto piccole

Valutazione della

contaminazione di

punti critici

Valutazione

efficacia della

decontaminazione

Batteri

Virus

Tossine

biologiche

www.skcinc.com www.biocontrolsys.com

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LE LORO CARATTERISTICHE

Tipo di

campione

Descrizione Target Usi Agenti

biologici

PIASTRE A

CONTATTO

Raccolta del

campione

mediante

pressione

della piastra

sulla

superficie

identificata

Campionamento

di un’area piccola

Solo per superfici

non porose

Screening di zone

piccole

Valutazione della

contaminazione

Valutazione

efficacia della

decontaminazione

Batteri

• Non usare su superfici molto contaminate

• Breve shelf-life

• Scelta del terreno colturale

PBI

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BIOLUMINESCENZA

Questa tecnologia “sfrutta” l’ATP ovvero la fonte di energia

delle cellule viventi

La Bioluminescenza è più sensibile delle piastre RODAC e

permette di identificare la produzione di ATP da parte di

batteri, lieviti, muffe, biofilm, residui di cibo e organici, ecc.

I tamponi per bioluminescenza possono raggiungere anche

zone poco accessibili e possono servire anche per valutare la

potabilità dell’acqua

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La misurazione dell’ATP fornisce una stima diretta della

concentrazione microbica e della vitalità dei microrganismi

L’ATP viene quantificato misurando la luce prodotta

attraverso la reazione fra l’ATP e l’enzima luciferasi usando

un luminometro

La quantità di luce prodotta è direttamente proporzionale

alla quantità di organismi viventi presenti nel campione.

Maggiore è la carica, maggiore è la misura dell’ATP in

superficie (unità di misura: RLU - Relative Light Units)

La misura è rapidissima (< 1 min)

Nessun problema di smaltimento dei tamponi

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Biologia molecolare

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IL CONTROLLO DELLE SUPERFICI

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CAMPIONAMENTO DELLE SUPERFICI

Permette di determinare o confermare la presenza di

agenti biologici

È un supporto fondamentale:

All’attività di monitoraggio sanitario;

Nella determinazione dell’ampiezza della

contaminazione;

Nella valutazione dell’attività di disinfezione.

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Il campionamento necessita:

La scelta di una porzione della superficie da indagare

Superfici non porose (plastica, metallo, acciaio, …)

La scelta di uno strumento efficace per la raccolta

dei contaminanti microbici

Fase di indagine

Tipologia dell’agente

Dimensione e tipologia della/e superficie/i

Limiti del metodo di campionamento

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Gli elementi essenziali per ottenere un

campionamento “di successo” includono:

Personale adeguatamente istruito (job training)

Strategia di campionamento

Definizione degli obiettivi

Scelta del numero e dei tipi di campioni

ambientali da raccogliere

Scelta dei terreni colturali

Laboratorio qualificato di sostegno

Controllo di qualità

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CAMPIONAMENTO DELLE SUPERFICI

Tre possibili fasi del campionamento delle superfici:

1. Fase di screening iniziale

2. Fase di caratterizzazione/identificazione

3. Fase di pulizia e controllo post-disinfezione

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1. Fase di screening iniziale

Campionamento qualitativo

Presenza o assenza del microrganismo/i

nell’ambiente

Scelta di punti sicuramente o molto

probabilmente contaminati

Ad es., porzioni di filtri di

ventilazione/condizionamento

Attenzione alle dimensioni del campione

Fase rapida

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2. Fase di caratterizzazione/identificazione

Campionamento quantitativo

Importanza dell’area campionata in quanto i

risultati sono riportati come concentrazione/area

Identifica le zone da decontaminare/disinfettare

Fase più indaginosa

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3. Fase di pulizia e controllo post-disinfezione

Permette di controllare l’efficacia delle procedure

di disinfezione

Riduzione del numero dei microrganismi ~0 UFC o

al limite dello strumento/metodo utilizzato

Tre possibilità di campionamento:

Più campioni per avere un’area maggiore

Zone raggiungibili dal trattamento

Zone “difficili” da raggiungere

Attenzione alla presenza di residui di disinfettanti

Uso di terreni con neutralizzanti

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IL CONTROLLO DELL’ARIA

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CAMPIONAMENTO DELL’ARIA

Permette di raccogliere e valutare la concentrazione e la

composizione di agenti biologici aerosolizzati

Attenzione alla caratteristica dei bioaerosol di sedimentare

e ridisperdersi per movimenti dell’aria

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Limitazioni legate al posizionamento e al tempo di

campionamento (collection time) dello strumento utilizzato

Risultati negativi indicano solo che un determinato

agente non è presente in un certo sito in concentrazioni

evidenziabili al momento del campionamento

Raccolta di più campioni nel tempo

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1. Campionamento passivo

2. Campionamento attivo

“impattatori”/aspiratori

filtrazione

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TIPI DI CAMPIONAMENTO

CAMPIONAMENTO PASSIVO DELL’ARIA

Passivo o deposizionale

Deposizione per via gravitazionale delle bioparticelle su

una superficie

Poco costoso e facile da eseguire

Campionamento non quantitativo

Volume raccolto sconosciuto

Particelle più grandi si depositano prima e in maggior

numero rispetto alle piccole

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CAMPIONAMENTO ATTIVO DELL’ARIA

Campionamento forzato di aria su una superficie solida o

liquida mantenendo i microrganismi aerogeni vitali o

fisicamente inalterati

Metodo “impattometrico”

Microrganismi superficie solida o semisolida

L’aria viene aspirata e convogliata, attraverso fori circolari

o ugelli, direttamente

Terreno agarizzato

Agar-sangue, TSA, R2A

Superficie adesiva

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PBI International

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per batteri …

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per funghi …

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CAMPIONAMENTO ATTIVO DELL’ARIA

Sistema per filtrazione

Campionamento forzato di aria attraverso una

membrana filtrante

Efficienza di raccolta legata

Alle dimensioni delle particelle

Alle proprietà fisiche delle particelle

Alle forze inerziali ed elettrostatiche

Alle caratteristiche del campionatore

Vengono raccolte le particelle più piccole del diametro

dei pori del filtro

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Diverse tipologie di

filtri ma attenzione

alla disidratazione

del campione sul

filtro

Membrane in gelatina Sartorius Membrane in gelatina Sartorius

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IL CONTROLLO DELL’ACQUA

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CAMPIONAMENTO DELL’ACQUA

Drinking water

Ampio range di microrganismi

Coliformi, E. coli, Campylobacter, virus

Limite legato al bassissimo numero di organismi presenti

nell’acqua di bevanda

Procedure microbiologiche basate su:

Concentrazione/arricchimento del campione

Isolamento microrganismi

Quantificazione (UFC/mL)

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CAMPIONAMENTO DELL’ACQUA

METODI

MICRORGANISMI

VIRUS BATTERI

Concentrazione Adsorbimento/eluizione Filtrazione su

membrana

Identificazione/conta Colture

cellulari/CPE/unità

formanti placca

Crescita su terreni

selettivi/UFC

Necessità di un approccio multi-steps

CONCENTRAZIONE E IDENTIFICAZIONE

BATTERI

Filtri con diametro 47 mm e pori da 0.22 a 0.45 µm

Semina su terreni solidi o liquidi

Importante fare più repliche per ottenere una conta più

probabile (MPN)

Uso di tecniche di pre-arricchimento e arricchimento per

alcuni batteri

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IN ITALIA

Per l’acqua di bevanda (in bottiglia) i parametri sono:

Escherichia coli 0 UFC/250 mL

Enterococchi 0 UFC/250 mL

Pseudomonas aeruginosa 0 UFC/250 mL

Carica batterica mesofila a 22 °C 100 UFC/mL

Carica batterica mesofila a 37 °C 20 UFC/mL

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CAMPIONAMENTO DELL’ACQUA

CONCENTRAZIONE E CONTA

VIRUS

Adsorbimento ed eluizione su filtro

Uso di filtri in polisulfonato (0.02 µm)

Presenza/assenza (TC)

Tecnica delle placche

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STANDARDIZZAZIONE DEI METODI

Metodi standardizzati disponibili

International Organization of Standardization (ISO)

European Committee for Standardisation (CEN)

American Public Health Association (APHA)

French Standard (NF)

In continua revisione e aggiornamento

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ISO

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Biofilm

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LIMITI DEI METODI MICROBIOLOGICI

Metodi classici

Sensibili ma indaginosi nella caratterizzazione dei

microrganismi

Legati al volume di campione

Metodi molecolari

Sensibili ed affidabili

Non discriminano tra microrganismi vivi e “morti”

Non permettono di valutare la patogenicità

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Grazie per l’attenzione

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