TOSSICOLOGIA-5

CITOTOSSICITA’

JeanJeanJeanJean----FranFranFranFranççççois DESAPHY ois DESAPHY ois DESAPHY ois DESAPHY

Farmacologia e Tossicologia, 2015Farmacologia e Tossicologia, 2015Farmacologia e Tossicologia, 2015Farmacologia e Tossicologia, 2015

citotossicità

2008© J.F. DESAPHY

CELLULA NORMALE(equilibrio-omeostasi)

CELLULAADATTATA

Aumentata richiestaStress

Stimolo dannoso

DANNO

MORTE

Incapacità di

adattamento

Citotossici sono gli effetti dei composti chimici che portano ad un’alterazione

delle funzioni cellulari che non rientra nei limiti fisiologici.

Citotossicità

Il danno citotossico può essere

�locale o sistemico

effetti gastroenterici di sostanze caustiche

effetti cutanei da materiale corrosivo

effetti respiratori da gas e vapori irritanti

effetti sistemici della sostanza assorbita e distribuita dai flussi

liquidi corporei (linfa, sangue)

�immediato / ritardato

effetto immediato in tempi brevi da singola esposizione

effetto ritardato dopo latenza da esposizione singola o ripetuta

�reversibile / irreversibile

2008© J.F. DESAPHY

Il danno citotossico può condurre alla morte cellulare

�apoptosi

morte cellulare programmata (suicidio cellulare)

�necrosi

morte cellulare non programmata

L’entità del danno cellulare dipende

�dalla funzione e dall’importanza del componente cellulare colpito

�dall’entità e reversibilità del danno

�dalla capacità di riparazione del danno da parte della cellula

�dalla capacità di rigenerazione di un tessuto

2008© J.F. DESAPHY

Citotossicità

La cellula

Cellula totipotente

Cellule pluripotenti

Cellule differenziati (200 tipi)

2008© J.F. DESAPHY

Membrana cellulare doppio strato di lipidi polari semi-permeabile ...

molecole apolari e piccole molecole polari

molecole neutre e polari, molecole cariche... in cui sono inserite delle proteine

colesterolo

glicolipidi

glicoproteine

oligosaccaridi

proteine integrali

proteine periferiche

fibre delcitoscheletro

Ione

Na+

K+

Mg2+

Ca2+

Cl-

Fuori

145

5

1-2

1-2

120

Dentro

5-15

140

30

<10-3

5-15

Concentrazioni (mmol·L-1)di alcuni ioni inorganici

2008© J.F. DESAPHY

Componenti Intracellulari •Citosol (frazione solubile del citoplasma)

enzimi del metabolismo (sintesi degli acidi grassi, glicolisi …)sintesi delle proteine solubili

•Reticolo endoplasmatico (rete di canali)sintesi di lipidi, di proteine di membrana e secretorieorigine degli organuli cellulari

•Apparato di Golgi (sacchetti sovrapposti)maturazione delle proteine di membrana e secretorie

•Lisosomi (vescicole)catabolismo enzimatico, neutralizzazione di ROS

•Mitocondri (circondati da due membrane, genoma proprio) ciclo dell’acido citrico, dell’ureadegradazione degli acidi grassi, gluconeogenesifosforilazione ossidativa (sintesi di ATP)

•Nucleo (circondato da due membrane con numerosi pori, genoma)trascrizione del DNA in mRNA

2008© J.F. DESAPHY

Siti cellulari bersagli delle sostanze tossiche In linea di principio, tutte le funzioni e le strutture cellulari possono costituire siti d’attacco per gli agenti tossici.

•Membrane cellulari

•Perossidazione lipidica

•Sistemi Redox

•Funzione delle proteine

•Sintesi di ATP

•Omeostasi cellulare dello ione calcio

•DNA (alterazione della replicazione e trascrizione, mutazioni,distruzione, ecc...)

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genotossicità

Membrane cellulari

Accumulo nelle membrane di sostanze lipofile e amfipatiche

Alterazione della fluidità di membrana

Alterazione funzionaledi proteine di membrana(enzimi, trasporti)

Disgregazione della membrana

Morte cellulareper necrosi

concentrazioni elevate

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Solventi

Saponi

Farmaci

Ecc...

Interazioni con la struttura lipidica della membrana

Membrane cellulari Interazioni dirette con le proteine di membrana

Tossine animali e vegetaliTetrodotossina tossina algale canali al sodio ineccitabilità neuronale, paralisiSaxitossina tossina algale (blocco) muscolare

batracotossina tossina animale canali al sodio ipereccitabilità, convulsioni, aritmie(attivazione)

picrotossina tossina vegetale Rc GABAA ipereccitabilità, convulsioni

Digitossina tossina vegetale Na+/K+ ATPasi aritmia cardiaca e neuronale

Composti chimiciDDT pesticida canali al sodio ipereccitabilità, convulsioni, aritmie

Ca2+-ATPasiNa+/K+ ATPasi

piretroidi pesticida canali al sodio ipereccitabilità, convulsioni, aritmieCa2+-ATPasiRc GABAA

tributilstagno pesticida Ca2+-ATPasi morte cellulare

Sostanze endogeniglutammato neurotrasmettitore Recettore-canale morte cellulare

per il calcio

2008© J.F. DESAPHY

Conseguenze dello stress ossidativo

• Perossidazione lipidica• Alterazione dei sistemi redox• Perdita dell’attività di alcune proteine• Idrossilazione delle basi e rottura della catena del DNA

Stress Ossidativo

Rimozione dei radicali liberi

• superossido dismutasi• catalasi• glutatione perossidasi

• β-carotene (vit A)• α-tocoferolo (vit E)• acidi grassi insaturi

enzimi

anti-ossidanti

Lo stress ossidativo descrive una condizione nella quale le difese cellulari non riescono a detossificare la cellula dai ROS prodotti durante le normale reazioni fisiologiche, in condizioni patologiche (ischemia), o dopo esposizione ad agenti tossici. (Esistono anche i RNS: specie reattive del nitrogeno)

ROS: specie reattive dell’ossigeno

anione superossido: •O2-

perossido di idrogeno: H2O2radicale idrossilico: •OH

2013© J.F. DESAPHY

più tossico

Stress Ossidativo: formazione di radicali liberi

2007© J.F. DESAPHY

LOO·: radicale lipoperossido

O2-·: radicale superossido

NO·: radicale nitrossido

Stress Ossidativo: formazione di radicali liberi

2011© J.F. DESAPHY

Lo ione superossido non è solo un prodotto di scarto ma può svolgere funzioni

fisiologiche; per esempio è coinvolto nella difesa contro i patogeni

patogeno

fagocita

fagocitosi Produzione

di •O2-

•O2-

destruzione

del patogeno

Burst respiratorio

La malattia granulomatosa cronica (CGD) è una malattia genetica dovuta a mutazioni nell’enzima NADPH-ossidasi. L’enzima non funziona in questi pazienti, esponendoli a infezioni ricorrenti

NADPH-ossidasi2•O2

- + NADP+ + H+2O2 + NADPH

Stress Ossidativo: formazione di radicali liberi

� Materiali solidi: silice cristallina (amianto), biomateriali polimerici (protesi)

Reazioni ossidative in superficie

� Accumulo di ferro o rame nei lisosomi epatici, processi infiammatori

� Materiali gassosi a livello polmonare(fumo di tabacco, ozono O3, biossido d’azoto NO2)

2008© J.F. DESAPHY

reazione di Haber Weiss

Fe3+ + •O2- Fe2+ + O2

•O2- + H2O2 O2 + •OH + OH-

Perossido di ossigeno Radicale idrossilico

Ione superossido

Fe2+ + H2O2 Fe3+ + •OH + OH-reazione di Fenton

riduzione da superossido

Stress Ossidativo: formazione di radicali liberi

� ciclo redox di composti chimici (catecolo, chinone, nitrocomposti aromatici)

R-NO2-•

R-NO2

e-

reduttasiO2

O2-•

H2O21O2•OH

ossidazione di molecola organica X + H-:-R XH + •R

acido grasso insaturo

radicale pentadienilico dell’acido grasso

CCl4 Cl- + •CCl3P450

CHCl3NADPH2 NADP+

� CCl4 negli epatociti

� amianti

2008© J.F. DESAPHY

radicale libero organico

(solvente)

SO: Perossidazione lipidica COOH

acido grasso insaturo

COOH

radicale pentadienilico dell’acido grasso

COOH

•OO perossiradicale dell’acido grasso

+ O2

•X

HX

COOH

HOOidroperossido dell’acido grasso

a.g. insaturo

radicale dell’a.g.

Fe2+

Fe3+

alcossiradicale

a.g. idrossilati

endoperossido ciclico

dialdeide malonica

alcano, alchene

Attacco ossidativo

sui lipidi di membrana insaturi

da parte dei radicali liberi

Incremento fluidità e

permeabilità di membrana

Distruzione della membrana

Necrosi cellulare

2008© J.F. DESAPHY

Reazione a catena

Indicatori dello SO

Alcuni dei quali

anche misurabili

nell’aria espirato

���� diagnosi

SO: Sistemi redox • coenzimi trasportatori di idrogeno: NAD, NADP, riboflavina

• coppie substrato-prodotto: lattato/piruvato

acetaldeide/acido acetico

acido ascorbico/acido deidroascorbico

• sistema glutatione e gruppi tiolici di proteine

per sovraccarico della

glutatione reduttasi,

si riduce il rapporto

GSH/GSSG

Inibizione

sintesi proteica

e

divisione cellulare

ROOH ROH + H2O H2O2 2H20

glutatione perossidasi

2 GSH GSSG

glutatione reduttasi

NADP+ NADPH + H+

se aumenta la frazione di

GSSG e NADP+

maggior

efflusso di Ca2+

dai mitocondri

2008© J.F. DESAPHY

detossificazioneidroperossido alcol

SO: effetti sulle proteine

proteina-SH + proteina-SH proteina-S-S-proteinao o

proteina-SH + GSH proteina-S-SG

ROSspecie ossigenate reattive

Inibizione della

funzione della proteine

e

riduzione

dei livelli di GSH

proteina-SH proteina-S-Ro oGSH GS-R

R-X+

X

composto chimico elettrofilo

NH CH3

O

OH

N CH3

O

O

NH CH3

O

OH

SG

paracetamolo N-acetil-p-benzochinone imina

Tioetere coniugati

NH CH3

O

OH

SPglucuronide

solfato

cytP450 GSH

proteina-SH

2008© J.F. DESAPHY

Gruppo tiolico

Eliminazionerenale

tossicità

Sintesi di ATP •Glicolisi nel citosol

•Fosforilazione ossidativa mitocondriale

Glucosio + 2 Pi + 2 ADP + 2 NAD+ 2 piruvato + 2 ATP + 2 NADH + 2 H+ + 2H2O

2e-½ O2H2O

H+ H+ H+

H+

ADP + Pi

ATP

+ + +- - - -

+ + +- - - -

+ + +

- - - -

+ + +----

+ +

+

----

+ + +

- - - -

+ + +

- - - -

2e-½ O2H2O

H+ H+ H+

2e-½ O2H2O

H+ H+ H+

H+

ADP + Pi

ATP

+ + +- - - -

+ + +- - - -

+ + +

- - - -

+ + +----

+ +

+

----

+ + +

- - - -

+ + +

- - - -

Ciclo di Krebs

2008© J.F. DESAPHY

Inibizione totale necrosiRiduzione parziale dell’ATP ridotta capacità protettiva e riparatrice

Inibitori della sintesi di ATP Tossine

antimicina A inibizione trasporto elettroni mitocondriali al citocromo b/c1(Streptomyces griseus)(batterio)

atrattiloside inibizione scambio ADP/ATP nella membrana mitocondriale (Atractylis gummifera) interna(vegetale)

Composti chimici

acido cianidrico inibizione trasporto elettroni

fluoroacetato Il fuoroacetil-CoA entra nel ciclo di Krebs dove è convertito in fluorocitrato che blocca l’aconitasi

iodoacetato inibizione della glicolisi per carbossilazione del gruppo SHdella gliceraldeide fosfato deidrogenasi

Disaccoppianti

pentaclorofenolo riduzione del potenziale elettrochimico mitocondriale per i protoni

bifenile policlorurato con conseguente inibizione della ATP-sintetasi(in vitro)

.2008© J.F. DESAPHY

Danno cellulare indotto da ATP riduzione

2008© J.F. DESAPHY

Pompa Na/KTrasporti attivi Glicolisi anaerobica altri

pHglicogeno

Addensamentocromatina nucleare

Alterazioneattività enzimatica

Acidosi lattica

Distacco ribosomiecc...

IngressoCa2+, Na+, H2O

Fuoriuscita K+

ATP

Rigonfiamento cellularee subcellularePerdita microvilli

Sintesi proteica

Accumulodi lipidi

Lo ione calcio: Secondo messaggero universale

1882, Ringer: gli ioni Ca2+ sono necessari nel perfusato per fare contrarre

un cuore di rana

Contaction

proliferation

fertilization

learning and

memory

crosstalk with

other signaling

pathways

membrane

excitability

secretion

metabolism

vesicle traffiking

cell proliferation

cancer and metastasis

ATP synthesis

Steroid synthesis

apoptosis

TnC

CAM MLCK

CAMKs

calcineurin

transcription factors

Adenylate cyclase

cyclic AMP-PDE

NOS

PKC, IP3-kinase

Ion channels

synaptogamin

phosphorylase

kinase

annexin family

S100 family

mito enzymes

caspases

Berridge et al., Nat Rev Mol Cell Biol, 2000

1940, Heilbrunn: l'iniezione di Ca2+ nella fibra muscolare provoca

la contrazione

1960, Ebashi: il reticolo sarcoplasmatico, un vacuolo arricchito di Ca2+

la troponina, il Ca2+-sensore per la contrazione

canali ionici

scambiatore Na+/Ca2+

Ca2+-ATPasi

[Ca2+] = 10-7 mol/L

[Ca2+] = 10-3 mol/L

mitocondri reticoloendoplasmatico

proteine sequestrantisolubili

legami conla membrana

calbindina

parvalbumina

canali ionici

scambiatore Na+/Ca2+

Ca2+-ATPasi

[Ca2+] = 10-7 mol/L

[Ca2+] = 10-3 mol/L

mitocondrimitocondri reticoloendoplasmatico

proteine sequestrantisolubili

legami conla membrana

calbindina

parvalbumina

2008© J.F. DESAPHY

controllo dell’omeostasi del calcio

Estrusione dalla cellula:Ca2+-ATPasi e scambiatore Na+/Ca2+ del sarcolemma

Assorbimento dai compartimenti intracellulari:Ca2+-ATPasi e calsequestrina del RE

uniporto e scambiatore Ca2+/H+-Na+ dei mitocondri

Buffering dalle calcium-binding proteine citosoliche:parvalbumina, calretinina, calbindina

Ridotta estrusione:•ossidazione, arilazione, alchilazione dei gruppi –SH delle proteine di trasporto•ridotta produzione di ATP

Aumentato influsso:•apertura dei pori di transizione di permeabilità in seguito a

ossidazione dei nucleotidi pirimidinici e gruppi tiolici,elevata [Ca2+] mitocondriale, stress ossidativo

•danneggiamento della membrana cellulare•eccessiva eccitazione nei neuroni•attivazione canali del calcio (mercurio sui VOC)

Alterazione dell’omeostasi del calcio

2008@ J.F. DESAPHY

Lo ione calcio: messaggero di morte

[Ca2+]

endonucleasi

-frammentazionedel DNA

fosfatasi/chinasi(calcineurin)

-alterazione dellatrascrizione genica

-attivazione delleendonucleasi

proteasi(caspasi, calpaina)

-proteolisi

-produzione di •NO,•O2- e ONOO-

NO-sintetasi

-produzione di ROSe lisofosfatidi

-danneggiamentodelle membrane

fosfolipasi(PLA2)

MORTECELLULARE

-disorganizzazione citoscheletro

α-actininagelsolina

2008© J.F. DESAPHY

bersagli cellulari delle sostanze tossiche

2008© J.F. DESAPHY

ATPStress

Ossidativo

MembraneCa2+

intracellulare

mitocondrilisosomiplasmalema

Distruzione delle proteine

Danno al DNA

Perdita del

contenuto

cellulare

Digestione

enzimatica

del contenuto

cellulare

Morte

cellulare

Perdita di

funzioni

cellulari

ATP-dipendenti

FINE