CAUSE GENETICHE DI TROMBOSI CAUSE GENETICHE DI TROMBOSI VENOSA PROFONDA: LA VENOSA PROFONDA: LA

DIAGNOSI DI LABORATORIODIAGNOSI DI LABORATORIO

Maria MessinaMaria MessinaMaria MessinaMaria Messina

Centro Di Riferimento Regionale Per Le Malattie Centro Di Riferimento Regionale Per Le Malattie Emorragiche E Trombotiche Ereditarie In Eta’ PediatricaEmorragiche E Trombotiche Ereditarie In Eta’ Pediatrica

Servizio Di Immunoematologia E Medicina TrasfusionaleServizio Di Immunoematologia E Medicina Trasfusionale

Ospedale Infantile Regina MargheritaOspedale Infantile Regina MargheritaTorinoTorino

Torino, 21.01.2010

TROMBOSITROMBOSI

MALATTIA MULTIFATTORIALEMALATTIA MULTIFATTORIALE

fattori genetici + fattori acquisiti

trombosi venosa trombosi arteriosatrombosi venosa trombosi arteriosa

fattori genetici + fattori acquisiti

FATTORI DI RISCHIOFATTORI DI RISCHIO

�� Rallentamento del flusso sanguignoRallentamento del flusso sanguigno

Modificazioni della parete vascolareModificazioni della parete vascolare�� Modificazioni della parete vascolareModificazioni della parete vascolare

�� Alterazioni delle proteine plasmatiche Alterazioni delle proteine plasmatiche della coagulazionedella coagulazione

FATTORI DI RISCHIOFATTORI DI RISCHIO

�� Trombosi venoseTrombosi venosestasistasi

alterazioni emocoagulativealterazioni emocoagulative

�� Trombosi arterioseTrombosi arteriosedanno della parete del vasodanno della parete del vaso

FATTORI DI RISCHIOFATTORI DI RISCHIO

�� CongenitiCongenitiipercoagulabilitàipercoagulabilità

�� AcquisitiAcquisiti

diminuzione del flussodiminuzione del flusso

alterazioni coagulazionealterazioni coagulazione

alteraz. parete vascolarealteraz. parete vascolare

FATTORI DI RISCHIO CONGENITIFATTORI DI RISCHIO CONGENITI

�� Alterazioni genetiche delle Alterazioni genetiche delle differenti componenti del differenti componenti del sangue possono direttamente o sangue possono direttamente o indirettamente influenzare la indirettamente influenzare la bilancia emostatica ed bilancia emostatica ed innescare uno stato innescare uno stato Fattori

Anticoagulanti naturali/fibrinolisiinnescare uno stato innescare uno stato

protrombotico.protrombotico.Possono essere suddivise in :Possono essere suddivise in :�� “perdita di funzione” degli “perdita di funzione” degli

anticoagulanti naturalianticoagulanti naturali�� “ aumento di funzione” dei “ aumento di funzione” dei

fattori procoagulantifattori procoagulanti�� “diminuzione della funzione del “diminuzione della funzione del

sistema fibrinolitico”sistema fibrinolitico”

Fattori coagulazione

naturali/fibrinolisi

TROMBOSI EMORRAGIA

TROMBOEMBOLISMO VENOSO (TVP/EP): TROMBOEMBOLISMO VENOSO (TVP/EP): FATTORI DI RISCHIO CONGENITIFATTORI DI RISCHIO CONGENITI

�� Deficit di AntitrombinaDeficit di Antitrombina

�� Deficit di Proteina CDeficit di Proteina C

Deficit di proteina SDeficit di proteina S�� Deficit di proteina SDeficit di proteina S

�� DisfibrinogenemiaDisfibrinogenemia

�� FV LeidenFV Leiden

�� Mutazione della protrombinaMutazione della protrombina

�� IperomocisteinemiaIperomocisteinemia

TROMBOFILIA CONGENITATROMBOFILIA CONGENITAPREVALENZAPREVALENZA

�� V Leiden (Q506R) 3 V Leiden (Q506R) 3 –– 99

�� Protrombina (G20210A) 1 Protrombina (G20210A) 1 –– 44

�� MTHFR (C667T) 1 MTHFR (C667T) 1 –– 1111�� MTHFR (C667T) 1 MTHFR (C667T) 1 –– 1111

�� Disfibrinogenemia < 0.5Disfibrinogenemia < 0.5

�� Deficit ATIII 0.002 Deficit ATIII 0.002 –– 0.20.2

�� Deficit PC 0.2 Deficit PC 0.2 –– 0.50.5

�� Deficit PS 0.08 Deficit PS 0.08

TROMBOEMBOLISMO VENOSO: TROMBOEMBOLISMO VENOSO: FATTORI DI RISCHIO ACQUISITIFATTORI DI RISCHIO ACQUISITI

�� Immobilizzazione Immobilizzazione (anestesia generale (anestesia generale –– traumi)traumi)

�� Chirurgia pelvica o ortopedica maggioreChirurgia pelvica o ortopedica maggiore�� Patologia oncologicaPatologia oncologica�� EstroprogestiniciEstroprogestiniciGravidanza e puerperioGravidanza e puerperio�� Gravidanza e puerperioGravidanza e puerperio

�� Terapia ormonale sostitutivaTerapia ormonale sostitutiva�� CardiopatieCardiopatie�� Sindrome da anticorpi antifosfolipidiSindrome da anticorpi antifosfolipidi�� Disordini mieloproliferativiDisordini mieloproliferativi�� NefropatieNefropatie�� PolicitemiaPolicitemia

TROMBOEMBOLISMO VENOSO: ALTRI TROMBOEMBOLISMO VENOSO: ALTRI FATTORI DI RISCHIOFATTORI DI RISCHIO

�� Iperomocisteinemia da carenza vitaminicaIperomocisteinemia da carenza vitaminica

�� APC resistance in assenza di mutazione APC resistance in assenza di mutazione �� APC resistance in assenza di mutazione APC resistance in assenza di mutazione

�� Aumentati livelli di Fattore VIII Aumentati livelli di Fattore VIII –– IX IX -- XIXI

�� Aumentati livelli di FibrinogenoAumentati livelli di Fibrinogeno

TROMBOFILIA E MANIFESTAZIONI TROMBOFILIA E MANIFESTAZIONI CLINICHECLINICHE

�� Età di comparsa dell’evento trombotico < 45Età di comparsa dell’evento trombotico < 45--50 anni50 anni

�� tromboembolismo idiopaticotromboembolismo idiopatico

�� Tromboembolismo ricorrenteTromboembolismo ricorrente

�� Sedi non usualiSedi non usuali

�� Trombosi superficiali recidivantiTrombosi superficiali recidivanti

�� Aborti ripetutiAborti ripetuti

�� Porpora fulminans del neonatoPorpora fulminans del neonato

DIFETTI TROMBOFILICI E SEDI DI DIFETTI TROMBOFILICI E SEDI DI TROMBOSITROMBOSI

�� TVP arti inferioriTVP arti inferiori

�� Trombosi cerebraliTrombosi cerebrali

�� TVP arti superioriTVP arti superiori

�� Trombosi visceraliTrombosi viscerali

�� Trombosi superficialiTrombosi superficiali

ANTICOAGULANTI NATURALIANTICOAGULANTI NATURALI�� Gli anticoagulanti naturali Gli anticoagulanti naturali

modulano i processi modulano i processi emocoagulativi impedendo emocoagulativi impedendo che essi procedano in modo che essi procedano in modo eccessivo.eccessivo.

�� La carenza congenita degli La carenza congenita degli anticoagulanti naturali è anticoagulanti naturali è anticoagulanti naturali è anticoagulanti naturali è trasmessa come carattere trasmessa come carattere autosomico dominante ed è autosomico dominante ed è correlata ad alto rischio di correlata ad alto rischio di manifestazioni trombotiche manifestazioni trombotiche anche in giovane età (più di anche in giovane età (più di 70 differenti mutazioni nel 70 differenti mutazioni nel gene della gene della proteina Cproteina C, 131 nel , 131 nel gene della gene della proteina Sproteina S, 127 nel , 127 nel gene dell’gene dell’antitrombinaantitrombina).).

ANTITROMBINA IIIANTITROMBINA III�� Azione principale Azione principale su F.Xa e Trombinasu F.Xa e Trombina

�� Rispetto agli altri anticoagulanti naturali il deficit Rispetto agli altri anticoagulanti naturali il deficit di ATIII è quello che porta al di ATIII è quello che porta al maggior rischio maggior rischio tromboembolicotromboembolico ( 4 volte rispetto ad APCr, 3 volte ( 4 volte rispetto ad APCr, 3 volte rispetto a PS, 2 volte rispetto a PC).rispetto a PS, 2 volte rispetto a PC).

I test di laboratorio impiegano substrati I test di laboratorio impiegano substrati �� I test di laboratorio impiegano substrati I test di laboratorio impiegano substrati cromogenici e la reazione valuta l’attività di cromogenici e la reazione valuta l’attività di trombina residua in presenza di eparinatrombina residua in presenza di eparina

�� InterferenzeInterferenze: : -- evento acutoevento acuto-- terapia eparinicaterapia eparinica-- epatopatieepatopatie

PROTEINA CPROTEINA C

�� La PC è un La PC è un inibitore fisiologico del fattore V e VIIIinibitore fisiologico del fattore V e VIIIed è vit. K dipendente.ed è vit. K dipendente.

�� La trombina la trasforma nella forma attiva APC La trombina la trasforma nella forma attiva APC che inattiva i Fattori Va e VIIIa.che inattiva i Fattori Va e VIIIa.

�� Il difettoIl difetto in omozigosiin omozigosi provoca la porpora fulminans provoca la porpora fulminans del neonato.del neonato.

�� Il difetto Il difetto in eterozigosiin eterozigosi può portare a fenomeni di può portare a fenomeni di trombosi più frequentemente venose che arteriose.trombosi più frequentemente venose che arteriose.

PROTEINA C PROTEINA C –– TEST DI LABORATORIOTEST DI LABORATORIO

�� I test di laboratorio sono di tipo funzionale I test di laboratorio sono di tipo funzionale

�� Si basano sull’attivazione della PC presente nel campione Si basano sull’attivazione della PC presente nel campione mediante un attivatore specifico da veleno di serpente.La mediante un attivatore specifico da veleno di serpente.La quantità di proteina C attivata viene determinata con test quantità di proteina C attivata viene determinata con test cineticocineticocineticocinetico

�� InterferenzeInterferenze: : -- evento acutoevento acuto-- epatopatieepatopatie-- TAOTAO-- deficit vit kdeficit vit k-- gravidanza (gravidanza (↑↑))-- estroprogestinici (estroprogestinici (↑↑))

PROTEINA SPROTEINA S� La proteina S è un cofattore della PC ed è vitamina K

dipendente.� Esiste in due forme : 40% libera ( agisce come cofattore

della PC). 60% è legata alla proteina C4b-BP appartenente al sistema del complemento.

� La carenza è indice di alto rischio di trombosi venose.� Le carenze di PS vengono classificate come:

- Tipo I : livelli antigenici ridotti della PS - Tipo I : livelli antigenici ridotti della PS totale e conseguente riduzione funzionale.

- Tipo II: livelli antigenici normali sia della PS libera che totale ma riduzione della funzionalità.

- Tipo III: livelli antigenici normali della PS totale ma riduzione della frazione libera e della funzionalità.

PROTEINA S PROTEINA S –– TEST DI LABORATORIOTEST DI LABORATORIO

�� Esistono due tipi di test:Esistono due tipi di test:-- CoagulativoCoagulativo volto a determinare la funzionalità della PS volto a determinare la funzionalità della PS senza separare la frazione legata al C4bsenza separare la frazione legata al C4b-- BP.BP.

-- ImmunoenzimaticoImmunoenzimatico: basato su anticorpi monoclonali ad : basato su anticorpi monoclonali ad altà affinità per gli antigeni della proteina libera.altà affinità per gli antigeni della proteina libera.

�� Interferenze:Interferenze:-- sesso.sesso.-- stato ormonale ( uso di contraccettivi orali).stato ormonale ( uso di contraccettivi orali).-- gravidanza.gravidanza.-- presenza della mutazione del fattore V leiden presenza della mutazione del fattore V leiden -- presenza di anticoagulanti tipo lupuspresenza di anticoagulanti tipo lupus-- terapia anticoagulante orale.terapia anticoagulante orale.

PROTEINA S PROTEINA S –– TEST DI LABORATORIOTEST DI LABORATORIO

�� I test di I test di tipo funzionaletipo funzionale possono essere usati possono essere usati come test iniziale dal momento che sono in grado come test iniziale dal momento che sono in grado di riconoscere tutti e tre i tipi di carenza.di riconoscere tutti e tre i tipi di carenza.

�� Un test funzionale alterato dovrebbe essere Un test funzionale alterato dovrebbe essere valutato tenendo conto delle possibili valutato tenendo conto delle possibili interferenze e confermato dalla determinazione interferenze e confermato dalla determinazione dei livelli di dei livelli di proteina libera.proteina libera.

PROTEINA C

DIAGNOSTICA MOLECOLAREDIAGNOSTICA MOLECOLARE

�� E’ E’ principalmente rivolta alla determinazione di fattori di rischio congeniti (polimorfismi genetici) la cui ricerca è facilmente attuabile con le diffuse metodiche di biologia molecolare.

� E’ rivolta ad individuare mutazioni puntiformi di un � E’ rivolta ad individuare mutazioni puntiformi di un singolo nucleotide:

- cambiamento in un gene tale che una coppia di basi è rimpiazzata da un’altra coppia di basi.

� Le mutazioni puntiformi presentano una tale frequenza nella popolazione da essere considerate delle VARIANTI POLIMORFICHE.

FATTORE V FATTORE V -- PCPC

Fattore Va

Arg306 Arg506 Arg679

PC APC

Arg306 Arg506 Arg679

PS

Fattore V inattivato

PC APC

Endotelio

TM

Trombina

PS

F.VIIIa F.VIII inatt.

FATTORE V LEIDENFATTORE V LEIDEN

�� Il fattore V attivato è un cofattore essenziale per Il fattore V attivato è un cofattore essenziale per l’attivazione della protrombina a trombina.Il suo effetto l’attivazione della protrombina a trombina.Il suo effetto propro--coagulante è normalmente inibito dalla proteina C coagulante è normalmente inibito dalla proteina C attivata che lo taglia in tre parti attivata che lo taglia in tre parti

�� La mutazione avviene a livello della tripletta nucleotidica La mutazione avviene a livello della tripletta nucleotidica che codifica per arginina in posizione 506.che codifica per arginina in posizione 506.

Sostituzione aminoacidica che impedisce il taglio da parte Sostituzione aminoacidica che impedisce il taglio da parte �� Sostituzione aminoacidica che impedisce il taglio da parte Sostituzione aminoacidica che impedisce il taglio da parte della proteina C attivata rallentando l’inattivazione del della proteina C attivata rallentando l’inattivazione del fattore V.fattore V.

�� Soggetti Soggetti normali :normali :

la tripletta in posizione 506 è CGA (arginina)la tripletta in posizione 506 è CGA (arginina)

�� Soggetti Soggetti portatori della mutazioneportatori della mutazione : :

la tripletta in posizione 506 è CAA (glutamminala tripletta in posizione 506 è CAA (glutammina))

FATTORE V LEIDENFATTORE V LEIDEN� La prevalenza del FV Leiden nella popolazione

caucasica è 5-6% ed è del 17-20% in pazienti selezionati con storia di trombosi venosa.

� Gli eterozigoti hanno un rischio relativo (RR) di sviluppare TVP di 5-10 volte superiore rispetto ai non portatori, mentre per gli omozigoti il RR è pari a 50-portatori, mentre per gli omozigoti il RR è pari a 50-80 volte.

� Altre mutazioni interessano il sito di inattivazione in posizione 306 (associazione con trombosi non chiara)

- FV Cambridge ( R306T)

- FV Hong Kong (R306G).

FATTORE VFATTORE V

�� Aplotipo HR2: Aplotipo HR2:

-- Sostituzione di una istidina con arginina in Sostituzione di una istidina con arginina in posizione 1299 del dominio B del FV (H1299R)posizione 1299 del dominio B del FV (H1299R)

�� Diversi studi hanno riconosciuto HR2 come un Diversi studi hanno riconosciuto HR2 come un fattore fattore di rischio protromboticodi rischio protrombotico e determina una significativa e determina una significativa alterazione dei valori di APCr. alterazione dei valori di APCr. Aumentato rischio Aumentato rischio alterazione dei valori di APCr. alterazione dei valori di APCr. Aumentato rischio Aumentato rischio protromboticoprotrombotico per quei soggetti che ereditano l’aplotipo per quei soggetti che ereditano l’aplotipo HR2 e il FV leiden.HR2 e il FV leiden.

�� Soggetti con aplotipo HR2 hanno un aumento relativo Soggetti con aplotipo HR2 hanno un aumento relativo dell’isoforma più trombogenica e glicosilata del FV dell’isoforma più trombogenica e glicosilata del FV (FV1).(FV1).

PROTROMBINAPROTROMBINA

�� La protrombina o fattore II svolge un ruolo La protrombina o fattore II svolge un ruolo fondamentale nella cascata coagulativa in quanto la fondamentale nella cascata coagulativa in quanto la sua attivazione in trombina porta alla sua attivazione in trombina porta alla trasformazione del fibrinogeno in fibrina : trasformazione del fibrinogeno in fibrina : formazione del coagulo.formazione del coagulo.

�� La frequenza genica della mutazione è del 5La frequenza genica della mutazione è del 5--6% nei 6% nei pazienti con TVP, e nel 1pazienti con TVP, e nel 1--2% nella popolazione sana . 2% nella popolazione sana . Portatori in Portatori in eterozigosi hanno un RR 3 volte hanno un RR 3 volte maggiore rispetto ai controlli. L’maggiore rispetto ai controlli. L’omozigosi è rara.è rara.

PROTROMBINAPROTROMBINA

�� La protrombina è codificata da un gene localizzato sul La protrombina è codificata da un gene localizzato sul cromosoma 11.cromosoma 11.

�� Tale gene è strutturato in 14 esoni separati da 13 introni con Tale gene è strutturato in 14 esoni separati da 13 introni con una zona a monte in 5’ e una a valle in 3’ non tradotte.una zona a monte in 5’ e una a valle in 3’ non tradotte.

�� La mutazione è stata individuata in posizione La mutazione è stata individuata in posizione 2021020210 nella nella regione 3’ ( regione 3’ ( sostituzione di una sostituzione di una guanina Gguanina G con una con una adenina adenina regione 3’ ( regione 3’ ( sostituzione di una sostituzione di una guanina Gguanina G con una con una adenina adenina AA).).

�� Il rischio di trombosi è associato al fatto che in questa zona Il rischio di trombosi è associato al fatto che in questa zona in 3’ è presente un in 3’ è presente un GENE PROMOTERGENE PROMOTER che presiede alla che presiede alla produzione di protrombina stessa .produzione di protrombina stessa .

�� La mutazione attiva il promotore che determina una La mutazione attiva il promotore che determina una maggiore produzione di proteina, creando uno scompenso maggiore produzione di proteina, creando uno scompenso nell’equilibrio dei sistemi coagulativo e fibrinolitico.nell’equilibrio dei sistemi coagulativo e fibrinolitico.

MTHFRMTHFR

�� L’MTHFR è un enzima coinvolto nel metabolismo L’MTHFR è un enzima coinvolto nel metabolismo dell’aminoacido metionina ed interviene nel processo di dell’aminoacido metionina ed interviene nel processo di rimetilazione da omocisteina a metionina tramite rimetilazione da omocisteina a metionina tramite l’intervento della vitamna B12.l’intervento della vitamna B12.

�� La mutazione La mutazione C677TC677T ( sostituzione di una citosina in ( sostituzione di una citosina in timina al nucleotide 677) causa una riduzione timina al nucleotide 677) causa una riduzione timina al nucleotide 677) causa una riduzione timina al nucleotide 677) causa una riduzione dell’attività enzimatica della MTHFR con conseguente dell’attività enzimatica della MTHFR con conseguente aumento di Omocisteina.aumento di Omocisteina.

�� La frequenza è del 40La frequenza è del 40--50 % in 50 % in eterozigosi e del 10e del 10--12% 12% inin omozigosi

Metabolismo dell’omocisteinaMetabolismo dell’omocisteina

Metionina S-Adenosil Metionina

Tetraidrofolato Dimetilglicina

5-10 Metilen

tetraidrofolatoVit B 12

MTHFR

OMOCISTEINAOMOCISTEINA

Betaina

S-Adenosil Metionina

5-Metil

tetraidrofolato

Cistationina

Cisteina

PLP

MTHFR

CBS

MTHFRMTHFR

Altri polimorfismi si trovano : Altri polimorfismi si trovano :

�� All’interno dello stesso gene ( A1298C , G1793A).All’interno dello stesso gene ( A1298C , G1793A).

�� All’interno di altri geni coinvolti nel metabolismo All’interno di altri geni coinvolti nel metabolismo dell’omocisteina ( metionina sintasi A2756G, metionina dell’omocisteina ( metionina sintasi A2756G, metionina sintasi reduttasi A66G)sintasi reduttasi A66G)sintasi reduttasi A66G)sintasi reduttasi A66G)

�� L’associazione diretta di tali polimorfismi con la L’associazione diretta di tali polimorfismi con la malattia trombotica è dibattuta.malattia trombotica è dibattuta.

�� Ben investigata per MTHFR C677T, meno per le altre Ben investigata per MTHFR C677T, meno per le altre sostituzioni.sostituzioni.

SCREENING TROMBOFILICOSCREENING TROMBOFILICO

�� L’esistenza di più marcatori rispecchia il lato L’esistenza di più marcatori rispecchia il lato multifattoriale della trombosi in cui la multifattoriale della trombosi in cui la coesistenza di multipli difetti ne modula la coesistenza di multipli difetti ne modula la variabilità clinica.variabilità clinica.

�� Problema per il laboratorio: quali e quanti Problema per il laboratorio: quali e quanti marcatori inserire nello screening trombofilico.marcatori inserire nello screening trombofilico.

�� Sviluppo di nuovi sistemi diagnostici per la Sviluppo di nuovi sistemi diagnostici per la diagnosi precoce di coagulopatiediagnosi precoce di coagulopatie

QUALI ESAMI RICHIEDERE ?QUALI ESAMI RICHIEDERE ?

�� AntitrombinaAntitrombina�� Proteina CProteina C�� Proteina SProteina S�� FibrinogenoFibrinogenoLAC LAC -- Anticorpi anticardiolipinaAnticorpi anticardiolipina�� LAC LAC -- Anticorpi anticardiolipinaAnticorpi anticardiolipina

�� APC resistance APC resistance →→ mutazione F.V Leidenmutazione F.V Leiden�� Mutazione protrombinaMutazione protrombina�� Omocisteinemia Omocisteinemia →→MTHFRMTHFR�� Fattore VIIIFattore VIII�� Assetto lipidicoAssetto lipidico

A CHI FARE GLI ESAMI ?A CHI FARE GLI ESAMI ?

�� Pazienti con Pazienti con storia di TVPstoria di TVP ::idiopaticaidiopatica< 45 anni< 45 annisedi atipiche di trombosisedi atipiche di trombosiTVP ricorrentiTVP ricorrentiTrombosi venose superficiali ricorrentiTrombosi venose superficiali ricorrentiTrombosi venose superficiali ricorrentiTrombosi venose superficiali ricorrenti

�� Parenti di primo gradoParenti di primo grado del probandodel probando

�� Familiarità Familiarità per tromboembolismo venosoper tromboembolismo venoso

�� Patologie ostetrichePatologie ostetriche

QUANDO E COME?QUANDO E COME?

�� Prima di iniziare la terapiaPrima di iniziare la terapia, , se possibile

(comunque eseguire lo studio molecolare))

�� In condizioni di baseIn condizioni di base�� In condizioni di baseIn condizioni di basedopo gravidanzadopo gravidanza

dopo estroprogestinicidopo estroprogestinici

dopo sospensione TAOdopo sospensione TAO

�� Protocollo completoProtocollo completo