Lezione 1/3/17Maschio, 45 anniSu invito della moglie si rivolge al medico di medicina generale, per controllare “gli esami”Insiste con il medico per effettuare “tutti” gli esami emato-umorali “…così non mi rompe più…”Fra gli esami prescritti vi è anche il test di screening per HIV (sensibilità 100%, specificità 99,7%).Il test risulta positivo.Il paziente chiede al medico:“Che probabilità ho di avere una infezione da HIV ?”

Il paziente del caso clinico non ha nessuna indicazione di patologia esistente, ma è spinto dalla moglie a fare gli esami. Il test di screening per hiv va a ricercare gli anticorpi contro il virus hiv. La sua sensibilità è del 100% e specificità del 99,7%.Definizione di sensibiltà -> capacità di un test di screening di trovare i malati = numero di malati positivi a un test sul totale dei malati.Definizione di specificità -> capacità di un test di screening di dare un risultato negativo nei soggetti sani (trovare i sani). = numero di negativi sani al test sul totale dei non malati. In questo caso, il test lo 0,3% delle volte va a identificare come malati soggetti che non lo sono realmente (la specificità di un test va a identificare i sani; se il test ha una specificità del 99,7%, vuol dire che 99,7 su 100 sani li individua come sani, mentre il restante 0,3 li identifica come malati, pur essendo questi sani). Quindi per lo 0,3% il test è sbagliato.Date le definizioni di sensibilità e specificità, apparentemente la probabilità che il paziente abbia realmente HIV è del 99,7% e quindi non 100%.Si può quindi dire che il complementare dell'insieme dei MALATI NEGATIVI è la SENSIBILITÀ, mentre il complementare dell'insieme dei SANI POSITIVI è la SPECIFICITÀ.

La diagnostica di laboratorio ha una grandissima rilevanza per la diagnosi.Differenza tra diagnosi e decisione clinica. ex. Dai sintomi di un uomo posso dedurre che ha il diabete. Per confermare faccio l'esame. Se il risultato è di un certo quantitativo di glucosio, allora ho la diagnosi di diabete.Se ho lo stesso paziente diabetico, ma in trattamento, che viene a lamentare dei sintomi particolari tipici di una crisi ipoglicemica, sospetto che il paziente abbia degli episodi ipoglicemici. Gli faccio quindi dosare la glicemia e, in base ai risultati, cambio la terapia -> decisione clinica (e non più diagnosi, già stata fatta in passato).

Alcuni numeri riferiti alle diagnosi:77 %: percentuale delle diagnosi mediche effettuate con l’impiego di tests di laboratorio

88 %: percentuale di decisioni cliniche modificate da risultati di tests di laboratorio44 %: percentuale di tests di laboratorio inutili. Questo è molto importante dal punto di vista economico3 %: percentuale di risultati “errati”. È un problema per le decisioni che devo prendere.

Brain to brain loop (è il nome del tipo di schema che va a schematizzare come avviene una diagnosi e quali sono gli attori in scena).Il primo cervello è quello del paziente che si interfaccia con il cervello del medico : il paziente deve prendere varie decisioni, tra cui quella di andare dal medico; inoltre è il cervello del paziente che decide che cosa raccontare e cosa no al medico. Poi arriva il cervello del medico. Gli prescrive dei test.Il pazente si fa fare dei prelievi che devono essereben identificati (quel sangue è di quel datopaziente). Devono poi essere trasportati nellaboratorio -> problema del trasporto manualePoi gli esami devono essere preparati. EX se vogliofare esami del siero, devo ricavarlo dal sangue.

Poi faccio l' analisi: sul campione vado a fare degli esami che danno dei risultati che vanno a finire nel referto che deve essere validato. Qui entra in gioco il cervello del laboratorista . Poi i risultati vanno al medico che gli ha prescritti che può decidere che i risultati gli bastano o che gliene servono altri.

Dove vanno a collocarsi gli errori in questo loop?• interpretazione dei risultati da parte del medico• identificazione• nella scelta degli esami che devono essere fatti• nel trasporto• nel corso dell'analisi: il laboratorio può sbagliare a fare le analisi, vero fino a circa 20 anni fa, dove la maggior percentuale di errori si verificava in questo punto. Oggi si dice che la maggior parte degli errori si fa in tutta

la fase sia analitica che pre analitica. Si vanno a ricercare i correttivi per ridurre il più possibile il numero degli errori che viene fatto in queste fasi.

Tuttavia il vero problema, in realtà, non è tanto nella fase tecnica, quanto nella fase dei "cervelli" (sia quello del paziente, che quello del medico, che quello del laboratorista). È in questa fase che sono fatti gli errori più gravi.

Motore Bayesiano

Bayes ha scritto un'opera sulla teoria delle probabilità.Questo schema che lui propone è il fulcro

della medicina moderna.Il teorema di Bayes consente,conoscendo la prevalenza di una malattia e la sensibilità e la specificità di un esame per la sua diagnosi, di calcolare la

probabilità di malattia in caso di esame positivo (o la probabilità di assenza della malattia in caso di esame negativo).

Consente, in altre parole, il passaggio dalla patologia medica alla clinica medica e fornisce le basi della razionalità della diagnostica di laboratorio e, a un livello superiore, della decisione medica.

Perchè i clinici sono naturalmente dei bayesiani?Il prendere una decisione clinica è fondamentalmente bayesiano: vado a valutare, integrando tra loro, sia i risultati di un test diagnostico, sia la storia clinica del paziente e solo allora vado a fare la diagnosi.Tutte le domande che sono fatte nell'anamnesi e tutte le manovre dell'esame obiettivo sono test diagnostici. Ma di questi non conosco specificità e sensibilità.Un approccio bayesiano è essenziale per intrpretare risultati sorprendenti dei test di laboratorio in un contesto

dell'anamnesi e dell'esame fisico del paziente: se così non fosse la diagnosi sarebbe errata. Vediamo alcuni esempi:

Se infatti risulto positivo a un esame di laboratorio con alta sensibilità e alta specificità, ma con una bassa prevalenza per il soggetto che ho davanti, la probabilità che l'esame sia diagnostico si abbassa molto.

Prevalenza = probabilità che quel dato paziente abbia la malattia.

Il dosaggio della troponina è un test diagnostico. È una molecola associata al citoscheletro (troponina I), quasi esclusivamente localizzata nel miocardio intracellulare. Se la trovo nel sangue vuol dire che ho necrosi miocardica -> la trovo come indice che c'è un infarto del miocardio. Guardo i casi in cui viene chiesto questo tipo di esame.

Immaginiamo di trovare la stessa quantità di troponina in tutti i pazienti della slide (dolore retrosternale, senso confusionale, diarrea, ecc...). La probabilità che tutti questi pazienti si abbia necrosi miocardica è proprio sempre la stessa?

Valore predittivo positivo di un test è la probabilità che coloro che sono individuati come positivi a un test, siano davvero malati = numero di malati e positivi sul totale dei positivi. Se il test è positivo vuol dire che ha quella patologia. Ci sono delle formule per calcolare questo valore predittivo positivo.

Vantaggi del valore predittivo positivo• Il teorema di Bayes rappresenta l'unico strumento che consente di fornire una misura quantitaiva e quindi oggettiva del "valore aggiunto" (prevalenza, nda) fornito da un esame diagnostico misurandone l'informazione (anamnesi, ec...)• L'analisi bayesiana è quindi in grado di fornire gli indicatori necessari per effettuare una valutazione oggettiva del rapporto costi/benefici di una strategia diagnostica e di valutarne la razionalità nei confronti di strategie diagnostice alternative.

Dal rapporto tra costi (in termini economici e di diagnosi non corrette che quindi devono essere ripetute, fatto che porta al l'ulteriore utilizzo di denaro) dei diversi percorsi diagnostici si può arrivare al consenso degli operatori su una strategia diagnostica.

• In condizioni di bassa prevalenza, riduzioni anche minime della specificità di un esame possono comportare drastiche riduzioni del VPP. Questo non avviene per il VPN: un esame negativo consente, nello specifico, di escludere la malattia.

Riprendiamo il caso clinico dell'inizio.del paziente con HIV non so nulla, a parte che la moglie gli ha consigliato di fare tutti gli esami. Il test ha una sensibilità del 100%: vuol dire che sicuramente tutti i malati sono positivi al test. Ma è possibile che anche altri pazienti che non hanno l'infezione vengano positivi al test (falsi positivi) -> specificità.Vuol dire che su 1000 casi positivi ce ne sono 3 che sono positivi senza avere la malattia (lo 0,3%).Qual è la prevalenza di HIV nella popolazione non selezionata (ovvero popolazione a caso che non conosco, come il nostro paziente)? Del 3 x 1000. Su 1000 pazienti, ci dobbiamo aspettare 6 casi positivi, 3 con infezione e 3 senza (falsi positivi).Che probabilità ha il mio paziente di avere infezione da HIV: 50%il valore predittivo positivo di questo test è del 50%. perchè la prevalenza della malattia è molto bassa e se faccio la formula, mi esce questo risultato.

Faccio il caso in cui questo paziente mi dica che non è tossicodipendente, non è immunocompromesso e non ha mai avuto rapporti non protetti ed è fedele alla moglie. I valori sono sempre uguali? No, è dello 0,1%. Qual è quindi il valore predittivo del test? 25%.Se invece mi dice proprio l'opposto? La prevalenza in questo tipo di popolazione è del 10%. Il valore predittivo positivo diventa del 97,4%.

cosa insegna questo esempio?Uno stesso risultato di uno stesso test di laboratorio, se applicato a pazienti differenti, dà interpretazioni differenti, NON risultati differenti.

Sapendo questo, vado a rivedere il caso del dosaggio della troponina.Devo andare a vedere anche ECG, tipo di dolore che ho, storia famigliare...

il motore bayesiano è fatto da 4 blocchi:• Conoscenza/diagnosi/ decisione clinica/ terapia -> Informazione a posteriori.• Informazione data dall'esperienza è test di laboratorio. (gli indizi)• Informazione a priori/ pre-test- pregiudizio. In questo gruppo rientra, anamnesi, esame obiettivo, ecc... ho informazioni a priori in cui il dato fornito dall'esame di laboratorio va interpretato alla luce di questo. Solo se lo integro con gli indizi ho la conoscenza

Il test di laboratorio, qualunque sia, va sempre analizzato e intrepretato in rapporto al paziente per cui questo esame viene fatto.

EX: hcg nelle femmine testimonia gravidanza, nel maschio no, perchè a cambiare la diagnosi è l'informazione a priori (il sesso, in questo caso).

ECGquesto elettrocardiogramma ce l'hanno avuto due pazienti diversi.Il primo paziente è un paziente con diabete 2 da molto tempo, iperteso scarsamente controllato, forte fumatore e con anamnesi di morti precoci per infarto. Arriva al pronto soccorso con dolore retrosternale, nausea, dolore sordo che si irradia al bracccio di sinistra.

Lo stesso ce l'ha una ragazza di 28 anni che pesa 44 chili, vegana che fa triathlon e ha nell'anamnesi una nonna di 97 anni. Arriva al pronto soccorso dopo aver corso al caldo umido. Non ha dolore retrosternale.

Questi due hanno tutti lo stesso ECG. Ci viene da dire che solo il primo ha l'infarto.Usando il motore bayesiano arrivo allo stesso risultato, ma con formule matematiche.Vediamo come funziona:Dai valori di sensibilità e specificità si possono ricavare i rapporti di verosomiglianza (likelihood ratio) utili per:• la valutazione del test clinico in sè• calcolo della probabilità di avere le malattia prima e dopo il test RV (+) = sensibilità / (1- specificità)RV (-) = (1- sensibilità)/ specificitàQuesti due parametri ci servono per determinare gli odds ( ovvero il rapporto tra la probabilità che accada un evento e la probabilità che si verifichi l'evento opposto/ complementare) post test a partire da odds pre test.--> (odds pre test) x (RV+) = odds post test (in caso in cui il risultato del test sia positivo) (odds pre test) x (RV -) = odds post test (in caso in cui il risultato del test sia negativo)ècomodo poi convertire i risultati ottenuti in probabilità

P = odds /(1 + odds)

OR (misura dell'associazione tra 2 fattori, per esempio tra un fattore di rischio e una malattia) del paziente 1 è di 5:1 (ha una probabilità pre-test dell'83%). Ammettiamo che l'ECG abbiamo una sensivilità del 90% -> quindi likelihood ratio--> con questo tipo di ECG questo paziente ha la probabilità di 45:1 di avere infarto = 98%OR paziente 2 è 1:1000. La probabilità pre test è 0,1%. ECG è lo stesso. La probabilità di avere infarto è dello 0,89% di avere infarto.

Per questi due pazienti la diagnosi è diversa, perchè il pre-giudizio (probabilità pre-test) era diverso per i due pazienti, nonostante il test sia uguale per entrambi. Questo è il motore bayesiano.Quindi la maggior probabilità di errore è nel cervello del medico, perchè è lui che deve elaborare le informazioni secondo il metodo bayesiano.

Variabilità analitica = variabilità dei risultati di vari test ottenuti misurando un unico campione con uno stesso strumento più volteVariabilità biologica = variabilità dei risultati di vari test ottenuti da campioni diversi provenienti dallo stesso soggetto.

Nei test di laboratorio raramente si tiene conto delle variabilità biologiche e analitiche (= variabilità dei risultati di vari test ottenuti misurando un unico campione con uno stesso strumento più volte).Però vediamo che, ad esempio,la creatin chinasi (marcatore di necrosi muscolare) ha valori diversi ha valori diversi a seconda che l'indivisuo sia bianco, ispanico o nero.L'amilasi è molto diversa a seconda che il paziente di british o asiatico.E così per molti altri parametri.Alcuni parametri variabili anche con l'età. Alcuni laboratori hanno dei valori di riferimento che tengono conto di queste variazioni, altri no -> queste maldefinizioni del risultato dell'esame possono portare a errori molto grossolani.

C'è anche variabilità legata al sesso.C'è anche una variabilità legata ai pasti, ma non sempre. Alcuni test hanno un risultato alterato anche perchè c'è un digiuno eccessivo. Quindi non è vero che tutti gli esami danno datti a digiuno.

C'è una variabilità legata all'attività fisica, al fumo.Il fumo aumenta il CEA (Antigene del carcinoma embrionale, che è un antigene associato al tumore), perchè il benzoapirene presenta caratteristiche carcinogeniche nei polmoni. Il fumo inoltre diminuisce ACE (enzima che converte angiotensionogeno in angiotensina)

Alcol fa diminuire LDL (infatti un bicchiere di vino può aiutare per il colesterolo), prolattina, ADH.C'è anche la variabilità circadiana di cortisolo, ACTH, maggiori al mattino. Ma servono anche per fare la diagnosi di adenomi o tumori secernenti. Anche i trigliceridi hanno valori completamente diversi da un giorno all'altro.

Le alterazioni che sono date da questi parametri così variabili, possono portare il medico a incorrere in errori.

Esiste anche una variabilità legata alla posizione in cui viene fatto il prelievo (ortostatismo e clinostatismo).

Variabilità legata alla stasi. Il laccio serve a creare una stasi venosa quando faccio il prelievo. Ma più dura questa stasi, più sono alterati i risultati degli esami (ex. Test della coagulazione, perchè attiva di per sè la coagulazione; oppure l'emogasanalisi, che valuta la quota di pCO2).Una volta presa la vena, il laccio va tolto subito -> così si evitano risultati degli esami alterati.

I tappi hanno colori diversi.Viola -> si raccoglie il sangue per esame citometrico. Contiene un anticoagulante specifico (potassio e EDTA), così il sangue non coagula. EDTA ha una struttura che consente legami stabili con molti cationi; in questo caso, il catione che utilizziamo è il potassio. EDTA lega ioni calcio e impedisce così la cascata coagulativa.Azzurro -> test di coagulazione. Contiene il sodio citrato (un altro anticoagulante: sequestra il calcio che non può quindi più essere utilizzato per la coagulazione)verde chiaro -> contine come anticoagulante litioeparina (= inibisce la trombiana). Si utilizza nelle provette che si occupano di raccogliere il plasma. Trombina -> agisce sul fibrinogeno tagliandolo in fibrina e consentendo la formazione della rete per il coagulo.Se uso la provetta viola per il dosaggio di calcio e potassio. Ma questa contiene come anticoagulante potassio e DTA, quindi se vado a dosare il potassio, vado ad avere risultati MOLTO alterati.

Per valutare che i valori di glicemia siano corretti si utilizzano dei meccanismi atti a evitare la glicolisi del glucosio presente nel sangue. Metto NaF (inibitre dell'enolasi, un enzima della glicolisi) che consente al glucosio di resistere nel sangue a temperatura ambiente per 24 ore. Altrimenti la diminuzione del glucosio sarebbe di circa 3-5% ogni ora.

Le analisi del sangue vengono fatte:• su sangue intero -> a 4°C• su plasma ( siero + fattori coagulazione)-> centrifugare, dividere e mantenere refrigerato• su siero (plasma – fattori della coagulazione) -> la centrifugazione deve avvenire a coagulazione avvenuta (qundi prima va lasciato a temperatura ambiente per 30 minuti)

TDM = therapeuting dose monitoring = monitoraggio terapeutico dei farmaci, ovvero vado a dosare la concentrazione di farmaco nel sangue per aggiustare la terapia. Regole per il prelievo per TDM:• x terapia a lungo termine -> posso fare sempre il prelievo, purchè io sia nello stato stazionario (quindi dopo 5 emivite)• x controllare la situazione plasmatica del farmaco -> deve essere ultimata la fase della distribuzione

(processo per mezzo del quale un farmaco passa da un distretto all'altro dino a raggiungere il sito d'azione)

Interferenza = effetto di una sostanza presente nel campione che altera il corretto valore del risultato. Una di queste interferenze è l'emolisi:• aumenta i costituenti extra- cellulari• interferisce con la procedura analitica• dà un'interferenza a livello otticoPuò essere data da varie cose, come la fragilità dell'emazie, errori nel prelievo, errori nel trasporto, oppure può essere data dalla torbidità, data dalla presenza di grosse micelle lipidiche.Lezione 2- 3/3/17

BIOMARCATORI DI NECROSI

Sono tra le indagini di laboratorio più richieste. Come dice il nome sono test la cui positività dovrebbe indicare la presenza di un processo necrotico in un organo o in un tessuto. Ad esempio la troponina per l'infarto.Oggi disponiamo di un pannello di biomarcatori impressionante. Non c'è settimana in cui non compaiano sulle riveste scientifiche proposte per almeno una decina di nuovi biomarcatori. In teoria, noi quindi potremmo monitorare tutto sotto qualunque aspetto.Tuttavia questa enorme disponibilità crea una notevole confusione (vediamo poi perchè) ed è necessario in questa area accettare la sfida, nel senso di affidarsi il più possibile a qualcosa di certo.Il principio generale su cui si basa l'uso di un marcatore di necrosi è molto semplice. Quando la cellula va incontro a necrosi aumenta la propria permeabilità -> si formano buchi -> ciò che c'è dentro va fuori e quello che esce lo possiamo misurare. Quello che esce va nell'intestizio -> linfa -> sistema venoso da qui preleviamo sangue e misuriamo.Vedi potassio. Dentro è 140-150 me/l. Se si rompe la membrana dobbiamo avere un aumento della concentrazione di potassio prima nell'interstizio e poi nel plasma. Il potassio però non viene usato come biomarcatore di necrosi, perchè non è specifico per un determinato tessuto. Infatti un biomarcatore di nerosi deve avere specificità di tessuto. Noi andiamo a misurare una serie di biomarcatori e a seconda di quello che vediamo sappiamo dove è avvenuta una necrosi.

Caratteristiche di un biomarcatore:• Presente in elevate concentrazioni nel tessuto di cui vogliamo valutare la necrosi.• Assente in altri tessuti. Dobbiamo usare solo i biomarcatori tipici di un tessuto, come le transaminasi del fegato. Questo ci aiuta a capire QUALE tessuto è necrotico (infatti il prelievo lo facciamo dal sangue).• Rapido rilascio dopo l'insulto. Serve per andare a fare la diagnosi il prima possibile.• Persistenza a lungo nel torrente sanguigno. Se viene liberato dopo l'insulto subito, ma poi subito eliminato, non serve a niente, rischiamo di farcelo scappare e di non riuscire a fare diagnosi. Il potassio, ad esempio, aumenta subito quando c'è la necrosi, ma dopo pochissimo l'iperpotassemia è controllata ed eliminata dal rene• Disponibilità di dosaggi rapidi e accurati.• Disponibilità di dosaggi sensibili che sanno misurare variazioni anche molto piccole. I volumi di distribuzione sono molto grandi, perciò il test deve essere in grado -> il sangue infatti va in tutto l'organismo.• elevata efficacia diagnosticaNessuno dei marcatori di necrosi attuale risponde a tutte queste caratteristiche, ma solo ad alcune. Tuttavia li usiamo lo stesso.

Consideriamo alcuni aspetti biologici dei biomarcatori di danno. In generale molecole più piccole sono rilasciate più velocemente, perchè i buchi della membrana, anche se sono piccoli, fanno passare questi piccoli biomarcatori. Quindi sono misurabili più velocemente, perchè vengono rilasciate subito. Tuttavia queste molecole sono anche quelle che sono eliminate più velocemente dal circolo.Molecole presenti nel citoplasma in forma libera sono rilasciate molto più velocemente che non molecole strutturali. Le molecole strutturali sono rilasciate più lentamente ma persistono in circolo più a lungo

-> i biomarcatori di necrosi sono una coperta corta, se tiro da una parte mi scopro dall'altra.

Alcune molecole biomarcatori di danno sono contenute in più di un pool (= compartimenti) cellulare, ad esempio, le troponine sono presenti sia nel citoplasma (3 - 7 %) che associate all’apparato contrattile (95%). Il primo pool viene liberato più precocemente, mentre il secondo è liberato più lentamente.La finestra diagnostica di questi marcatori è quindi relativamente ampia (uno copre la fase precoce e uno la fase tardiva), anche se, per la fase precoce, è necessario un dosaggio molto sensibile (il primo pool rappresenta solo una piccolissima frazione di tutto il biomarcatore, solo l 3-7%), altrimenti perdiamo tutta la prima fase.

La concentrazione plasmatica di un biomarcatore di danno (ciò che ni riusciamo a trovare in circolo) dovrebbe essere proporzionale a:• massa di tessuto danneggiato

I valori normali delle trasamminasi è compreso tra 0 e 40. nei casi di necrosi epatica massiva (come quella da intossicazione da amanita falloide) abbiamo il passaggio da 40 a 38.000. Se noi abbiamo 100 di transamminasi abbiamo una necrosi modesta, 1000 necrosi importante, 10.000 molto importante, 38.000 tutto il fegato è praticamente morto.

• concentrazione di biomarcatore nel tessuto. Se ce n'è tanto dentro ce n'è tanto fuori. Ma questo ragionamento non

vale sempre. Se infatti uso una proteina intracellulare come marcatore, so che la concentrazione di quella

proteina non è stabile per sempre, perchè l'espressione genica di alcune proteine può variare moltissimo. Se ho un infarto e muoiono 10 g di cuore, ho una certa dose di troponina liberata. Se tra 10 anni perdo ancora 10 g di cuore, magari la quota di troponina prodotta in questi anni è aumentata e quindi, a parità di tessuto perso, ho la perdita di una quota di troponina maggiore.

• grado di perfusione del tessuto interessato. Necrosi miocardica ischemica: ciò che era nei miocardiociti (la troponina in questo caso) è uscito nel tessuto interstiziale e poco in circolo, perchè il tessuto a valle non è perfuso (per via dell'ischemia). Nel caso di angioplastica il tessuto a valle viene riperfuso e la troponina, che si trovava nell'insterstizio, passa in circolo. Se a questo punto vado a dosare la troponina, vedo che ha valori alle stelle, anche se la necrosi ormai è risolta grazie all'intervento di angioplastica.• modificazioni post-release del biomarcatore. Un biomarcatore è abituato a stare dentro la cellula in una condizione ambientale diversa da quella che c'è fuori dalla cellula. Lo stato redox è più spostato verso riduzione nella cellula, nel plasma verso ossidazione. Molti dei biomarcatori liberati, quindi, una volta rilasciati, vengono modificati in circolo. Se uso metodiche immunometriche, quindi, se vado a dosare il marcatore, poichè ossidato, non lo trovo.• clearance del biomarcatore. Magari il paziente ha insufficienza renale e la sua clearance, in generale è ridotta, perchè è il rene a non funzionare.• sensibilità e specificità del metodo di dosaggio.

Bisogna anche capire che tipo di insulto determina il rilascio di un biomarcatore.Quando un epatocita soffre, per una serie di modificazioni citoscheletriche, sulla sua superficie compaiono delle protrusioni, i blebbing. Queste possono scoppiare e quindi fare morire la cellula (perchè si forma un buco). Oppure i blebs possono chiudersi alla base con la conseguente liberazione di una vescicola che dentro ha quello che c'è nel citoplasma della cellula. Qureste vescicole vanno nel circolo e a causa degli stress a cui qui sono sottoposti si rompono e liberano ciò che hanno dentro, ovvero quello che era dentro l'epatocita -> quindi l'epatocita non muore, soffre solo, fatto che porta alla liberazione di blebbing e conseguentemente anche dei biomarcatori, anche se non c'è nè morte per apopotosi, nè per necrosi, ma solo per sofferenza. Quindi la presenza dei biomarcatori sta sicuramente a indicare una SOFFERENZA, non per forza una morte (vuoi per apoptosi o per necrosi).

BIOMARCATORI DI DANNO GENERALELDH (lattico deidrogenasi)È uno degli enzimi della glicolisi. È un enzima ubiquitario nelle cellule. Si trova nel citoplasma e quindi viene liberato precocemente in seguito a morte della cellula.• LDH era il biomarcatore di necrosi miocardica che si usava una volta.• Esistono 5 differenti isoenzimi, diversi a seconda dei tessuti (ma non così specifici)• LDH1: miocardio, eritrociti, muscolo, cervello, rene• LDH2: miocardio, eritrociti, muscolo, cervello, rene• LDH3: rene, cervello• LDH4: fegato, muscolo, rene, polmone• LDH5: fegato, muscolo, intestino (ileo), polmonenoi abbiamo aumento di LDH nelle malattie cardiovascolari, nelle epatiti acute, nelle operazioni chirurgiche, nelle nefropatie, nel caso di un'emolisi ex-vivo che si può avere in un prelievo fatto un po' male -> biomarcatore TROPPO ASPECIFICO!!! ma allora perchè viene usato?

BIOMARCATORI DI DANNO EPATICOTRANSAMINASINe esistono due:• ASP/ GOT (aspartato aminotransferasi) -> 0 - 40 U/L -> localizzazione citoplasmatica/mitocondriale• ALT/GTP (alanino aminotransferasi) -> 0- 40 U/L -> localizzazione citoplasmaticaSONO MARCATORI DI necrosi epatica. Ma ci sono due problemi.Se queste due transaminasi dicono la stessa cosa, perchè vengono dosate entrambe?Ci si aspetta che le transamminasi siano solo nel fegato, e invece sono acnhe nel muscolo, cuore, pancreas, eritrociti.Cause di aumento delle transamminasi sono varie:• Epatiti acute e croniche, virali, tossiche, autoimmuni• Infarto miocardico• Miopatie• Emopatie

• PancreopatieMa allora perchè si usano se sono così aspecifiche?

FOSFATASI ALCALINAnei bambini: 130- 700 U/Lnegli adulti: 50-190 U/Lci sono varie isoforme, di cui una tessuto aspecifica presente soprattutto a livello osseo ed epatico.Questo biomarcatore si associa agli epiteli biliari (membrana biliare dell'epatcita e cellule dei dotti biliari)-> si ritiene un marcatore di lesioni epatobiliari (diverso da transamminasi, per lesioni epatocellulari, e quindi epatociti). Ma anche le lesioni ossee possono dare un aumento di fosfatasi alcalina. Quindi si è pensato di usare un marcatore più specifico per evidenziare i danni a livello epatico.

G-GLUTAMIL-TRANSPEPTIDASI (G-GT):neonati: 10 - 100 U/Ladulti: 5 - 28 U/LE’ un enzima microsomiale di molti tessuti: rene (epitelio tubulare), pancreas, fegato, intestino (molto aspecifico). Nel fegato è particolarmente abbondante nelle cellule dell’epitelio biliare e nei noduli epatici cirrotici pre-neoplastici.E’ un indicatore aspecifico (meno della fosfatasi alcalina, però) di lesioni epato-biliari e risulta aumentata negli itteri ostruttivi e nelle cirrosi biliari.

Quindi abbiamo visto 3 biomarcatori del fegato: transaminasi per il danno epatocellulare, fosfatasi alcalina e gamma gt per il danno epatobiliare.

Ci sono altri due biomarcatori.SORBITOLO DEIDROGENASIè un enzima che presente ESCLUSIVAMENTE nel fegato. Questo sì che è specifico!

5'- NUCLEOTIDASIadulti: 2 - 15 U/LE’ un enzima che catalizza l’idrolisi dell’adenosina-5- fosfato. Ha una pressochè esclusiva localizzazione a livello dell’epitelio biliare.

Questi due dosaggi esistono da 40 anni e non vengono utilizzati. Perchè?Ho due pazienti. Il primo dice di stare bene e fa degli esami di check-up e faccio transaminasi, GT e fosfatasi alcalina. Ho un altro paziente che dice che da un po' di tempo ha dei disturbi, nausea, pesantezza, ittero, ecc.. Lo visito e vedo che ha un'epatomegalia dolente (facendolo inspirare se lo tocco gli fa male). Nelle sclere trovo un subittero. Sospetto un danno al fegato e chiedo anche per questo le transaminasi.Per entrambi i pazienti ho i referti e entrambi 100 U/L di transaminasi. Il potere prodittivo positivo di un tezt è in relazione alle caratteristiche pre- test e per questi due pazienti le caratteristiche sono diverse. A questo punto la specificità del biomarcatore non è data dal test stesso, ma da noi.Questi (SORBITOLO DEIDROGENASI E 5' NUCLEOTIDASI) sono biomarcatori molto specifici, ma poco sensibili. In genere per i biomarcatori di necrosi è meglio la sensibilità della specificità, ma perchè siamo NOI a dare la specificità, con il RISCHIO PRE-TEST (quindi non è importante se il test di suo ha una specificità bassa, tanto gliela diamo noi).

Gli algoritmi diagnostici di base non sono da seguire. Perchè i test di laboratorio hanno significato solo se applicati a quel paziente che abbiamo davanti, perchè di per sè non hanno alcun valore.Si fanno i test di funzionalità epatica = transamminasi, bilirubina, gamma GT e fosfatasi alcalina -> ERRORE! Questi test dicono solo se c'è necrosi epatica e non se il fegato funziona -> NON SONO TEST DI FUNZIONALITÀ EPATICA. In pazienti con cirrosi epatica all'ultimo stadio, le transamminasi sono pressochè normali, perchè non ci sono più epatociti che possano morire e tuttavia la funzionalità del fegato non c'è più!Il dosaggio dell'albumina è un biomarcatore di funzionalità epatica, perchè lei è sintetizzata dal fegato e bassi livelli di albumina significa che il fegato non ne fa tanta.Idem per i fattori della coagulazione, prodotti per lo più dal fegato.

BIOMARCATORI DI DANNO MUSCOLARECe ne sono 3 ma se ne usano soprattutto 2.

Hanno una localizzazione prevalentemente muscolare. -> quindi PIUTTOSTO SPECIFICI MIOGLOBINA:20 - 65 ng/mlALDOLASI:1.3 - 8.2 U/LCREATIN-FOSFO-KINASI= CREATIN CHINASI = CCK 0 - 190 U/LNe esistono due isoenzimi: MM ed MBIl muscolo scheletrico contiene 90 % di MM e 10 % di MB.Il muscolo cardiaco contiene 60 % di MM e 40 % di MB.Quindi sia nel cuore che nel muscolo scheletrico ho sia MM che MB, sono solo le percentuali a variare. Si possono avere aumento di MB nelle sindromi da schiacciamento, anche se comunque non ho danno al cuore, perchè comunque ho un danno muscolare massivo, che porta alla liberazione di quella piccola quota di MB contenuta anche nel muscolo scheletrico.BIOMARCATORI DI DANNO PANCREATICOAMILASI:35 - 115 U/L nel pasma/siero< 8000 U/L nelle urinene esiste una isoforma pancreatica (P) ed una forma extrapancreatica (S) a prevalente localizzazione salivare. È molto sensibile, ma poco specifica; posso avere aumento di amilasi sia per necrosi pancreatica che per necrosi delle ghiandole salivari.Ma questo non mi dà problemi perchè capisco se quello che ho davanti ha un problema al pancreas o alle ghiandole salivari.

LIPASI:< 1.5 U/mlè ritenuta più specifica dell’amilasi nella diagnosi delle pancreatiti e permane più a lungo elevata. Meno sensibile, ma molto più specifica, perchè tipica del danno pancreatico.

Questo permette lo sviluppo di algoritmi molto di moda, i test riflessi. In genere, come per le transamminasi, due è meglio che uno, quindi per valutare danni pancreatici li doso insieme. Parto dalle amilasi. Se sono normali significa che non ho nessun tipo di necrosi. Se sono aumentate, allora ho davanti o necrosi pancreatica o salivare e quindi vado a fare le lipasi per differenziare la diagnosi -> test riflessoMa se io ho davanti il paziente non ho bisogno di fare due test per capire se ha danno al pancreas o alle ghiandole salivari! Quindi il test riflesso è inutile.

DIAGNOSI DI NECROSI MIOCARDICAè tipica dell'infarto miocardico. Se fosse basato solo sulla sintomatologia clinica ed ECG, avremmo sensibilità del 55% e specificità dell'88% -> quindi si perderebbe 1 paziente su 2.nel tempo si sono sviluppati dei biomarcatori: troponina, mioglobina e CK totale. Ma qguardo soprattutto CK-MB: se ce l'ho infatti è più probabile che venga dal cuore e non dal muscolo, dove è solo il 10%. Ma guardo anche CK totale, perchè comunque mi indica se c'è un eventuale danno muscolare. Sono io che do la probabilità pre test che mi consente di discriminare il danno muscolare da quello cardiaco.Nello schema vediamo le cinetiche di rilascio dei biomarcatori dopo un evento necrotico.La mioglobina è subito liberata (è piccola e nel citoplasma) quindi si misura subito, ma scompare velocemnte dal circolo (dopo 24 h).CK-MB un po' più lentoTroponine hanno un andamento bifasico. È più precoce e rimane misurabile più a lungo.

Guardiamo ora la tabella.Mioglobina ha bassa specificità. La più alta specificità è la troponina.

Per la sensibilità abbiamo valori diversi in tempi diversi. Io potrei avere un paziente che va al pronto soccorso.Tutti e 3 i valori sono normali -> la probabilità che non ce l'abbia è del 95%.Se dopo il prelievo ho aumento della mioglobina, gli altri normali. Ha un infarto? Probabilmente sì. Come faccio ad avere una risposta più certa? Devo ripetere le misurazioni dopo 6 ore l'insorgenza del dolore, perchè aumenta la sensibilità di CK-MB massa e troponine e quindi le misuro, perchè la loro sensibilità e specificità, con il passare delle 6 ore, è aumentata.

Proposta di utilizzazione di un singolo marcatore (Troponina T o I). Ma:quantunque la finestra diagnostica sia molto ampia, la sensibilità ai tempi precoci e altrettanto bassa non esiste una standardizzazione precisa (= risultati difficilmente comparabili fra i vari laboratori) problematiche nel dosaggio (identificazioni di porzioni differenti della stessa molecola da parte degli anticorpi utilizzati per il dosaggio)--> si è inrodotta hs troponina che risolve questi problemi. Per questo noi usiamo solo hs troponina.

E gli altri biomarcatori allora che fine fanno?Un paziente è riportato in reparto nonostante la troponina comunque fosse alta. Il paziente ha un altro infarto e muore. Immaginiamo il paziente preso prima che ha una piccola quantità di cuore che muore e che libera il biomarcatore (un re-infarto). I valori normali in un paziente normale sono 0,04 nanogrammi/ml. In un paziente con infarto sono 150 nano grammi/ml. Ma se il mio paziente ha un reinfarto, ho già un valore alto di troponina (150) per il precedente

infarto a cui si sommano 0,1 per il muovo -> non sono in grado di misurarlo. Per questo il paziente è stato portato in reparto nonostante gli alti valori di troponina e per questo non si è riusciti a prendere l'infarto in tempo, perchè nella situazione in cui si trovava, con i biomarcatori, anche con la hs troponina, non si riusciva a diagnosticare il re-infarto in fase precoce.Come si fa allora a diagnosticare il reinfarto? Si usa la mioglobina, è tornata a valori normali (perchè velocemente è rilasciata e velocemente è riassorbita)! Ma è poco specifica. Possiamo allora usare CK-MB, non solo perchè sta scendendo, ma anche per un altro motivo.

Quantità di troponina non in circolo, ma nel tessuto miocardico di conigli normali e di conigli sottoposti a un processo di ipossia circoscritta nel miocardio. L'ipossia stravolge l'espressione genica a causa di vari fattori legati all'ipossia. Due in particolare ci interessano:• troponina. In ipossia si riduce del 90%. in un primo infarto è liberato 100 di troponina, in un secondo di uguale entità è 10. per questo non riusciamo a misurarlo• CK-MB è esattamente opposto: ipossia sovraesprime CK-MBQuindi per l'individuazione di un reinfarto andiamo a vedere CK-MB (non tanto mioglobina, che è poco specifica).

Qualche anno fa fu provato l'utilizzo della troponina per la stratificazione del rischio.Fin'ora la troponina è stata utilizzata come marcatore di necrosi. Qualche anno fa viene proposto l'uso della troponina per la stratificazione del rischio, in questo caso di mortalità a 42 giorni. Pazienti arrivati al pronto soccorso con infarto del miocardio, hanno misurato la troponina e hanno visto se correlava con la mortalità. Il risultato è questo grafico.Più è alta la troponina in ingresso, più è alto per il paziente il rischio di morire. Quindi questo biomarcatore ci serve anche per stratificare il rischio di morte per quel paziente, ovvero sapere se devo fare un trattamento più o meno aggressivo (più troponina + aggressivo).Un paziente con un infarto può arrivare al ps 2 ore dopo il malore, 12 h dopo e a sdconda di quando arriva, la troponina ha valori diversi. Ha quindi ancora senso questo tipo di correlazione? Certo, anzi! Dal punto di vista clinico, infatti, più è precoce il trattamento, maggiore è la probabilità di risoluzione.La quantità di biomarcatore dovrebbe esere proporzionale alla quantità di tessuto danneggiato -> tanta troponina = tanto tessuto danneggiato = tanto tessuto intercorso.È molto importante questo, perchè fa vedere il duplice impiego della troponina:• per la diagnosi• per le decisioni cliniche -> so se essere più o meno aggressiva con un dato paziente è quindi il biomarcatore ideale.

Tutte queste cose vengono in linea di massima seguite. I risultati che ci sono sono assolutamente positivi.30 anni fa, il 40% dei pazienti con infarto del miocardio moriva. Oggi meno del 5%. questo perchè la diagnosi viene fatta prima e perchè l'intervento, che è più radicale, viene fatto prima.Tuttavia c'è un MA.Guardo le due righe sotto il grafico. Se uno ha 3,5 di troponina, l'intervallo di confidenza è tra 1,2 e 10,5; ma io non ho una coorte di mille pazienti, ma di un solo paziente, che potrebbe essere l'unico che esce dall'intervallo di confidenza. -> posso avere lo stesso risultato di uno che ha 3,5 di troponina se sono all'interno dell'intervallo compreso tra 1,2 e 10,5.

BNP = PEPTIDE NATRIURETICO CEREBRALE. È una sostanza prodotta dai ventricoli in caso di sbalzo di pressione che si osserva in casi di insufficienza cardiaca (pazienti scompensati, ecc...)

Lezione 17/3

BIOMARCATORI TUMORALINel 1846 viene identificata la proteina di Bence -Jones, un tipo di proteinuria che si verifa nei pazienti con il mieloma e in condizioni normali non c'è.Nel 1928 Brown descrive una sindrome ormonale ectopica, ovvero una serie di segni e sintomi che un paziente sviluppa in seguito alla produzione di ormoni da parte di una sede che normalmente non è deputata alla produzione di quell'ormone; ad esempio ACTH prodotta da acluni tumori polmonari.Nel 1932 Cusching descrive iperproduzione di ACTH in seguito a carcinomi ipofisari. Mentre per la proteinuria di Jones il discorso è semplice (dato che normalmente la proteina non c'), per ACTH la situazione è diversa, perchè in condizioni normali un individuo produce ACTH. Allora è stato necessario individuare un cut-offe (= limite): quando ACTH è inferiore a quel limite è normale, al di sopra tumore.L'esempio tipico è dimostrato dal PSA, considerato un biomarcatore di adenocarcinoma prostatico. Tutti i maschi hanno PSA circolante, anche in coloro che non avranno un carcinoma prostatico. Lo consideriamo biomarcatore quando è superiore a 4 ng/ml -> 3,8 = non hai il tumore; 4,2 ng/ml = potresti avere un tumore.

Un paziente dice che si sveglia di notte per fare la pipì e ha un getto ridotto -> sintomi tipici di iperplasia prostatica. Fa PSA e viene 3,8 e il cut off è 4. il valore è al di sotto del cut-off e quindi è considerato normale, tuttavia il paziente ha dei sintomi di iperplasia prostatica.Se il PSA fosse 1?

Un paziente, per la presenza di una serie di disturbi, decide di andare dall'urologo che lo visita. Vede che ha un certo grado di ipertrofia prostatica. Fa un'ecografia e vede che c'è un'ipertrofia prostatica non omogena. Decide di fare una biopsia con 12 prelievi ed emerge che ha un'ipertrofia prostatica benigna. Fa il PSA e gli viene 3,5. Dopo sei mesi fa ancora il PSA e gli viene 4,1.

Esiste la variabilità analitica. Se io prendo un campione di sani e di siero e lo analizzo per 10 volte successive usando la stessa strumentazione, non otterremo mai lo stesso valore, ma dei valori che si discostano in modo più o meno importante da un limite o da un valore medio. Vediamo poi il coefficiente di variabilità analitica. Per il PSA è l'8%. Questo vuol dire che se prendo il campione di questo paziente, che dava 3,5 e poi lo analizzo 10 volte, posso trovare anche valori di 3,8 e sarebbe la stessa cosa.Esiste poi la variabilità biologica. Ammettendo di avere uno strumento perfetto, con variabilità analitica di 0. vado a fare il prelievo per 10 giorni di fila nello stesso paziente, non avrò mai gli stessi valori, per via di questa variabilità biologica. Per il PSA è del 12%.Se metto insieme variabilità analica e biologica, ho il 20% di variabilità totale. Vuol dire che un valore di PSA di 3,5 può anche essere di 4,2 e viceversa.Tutto questo ragionamento, serve a dire che per tutti quei biomarcatori molecolari per cui la decisione clinica è condizionata da un cut-off sono condizionati dalla determinazione del cut-off stesso e dalla determinazioni di due variabili, quella analitica e quella biologica. Quindi devo avere coscienza dell'incertezza nel mio giudizio di negatività o positiità.

Nel 1975 Kohler prese il Nobel per la scoperta degli anticorpi monoclonali. Si pensava che l'immunologia avrebbe potuto aiutare in ambito di diagnosi oncologica, risolvendo il problema dei marcatori tumorali.Prendiamo pazienti di sesso femminile con carcinoma ovarico. Prendiamo il tessuto del carcinoma, che verosimilmente conterrà proteine e antigeni peculiari di quel tumore. Si fece questo esperimento con 100 donne con carcinoma ovarico e 100 donne senza. Si trovò uno in particolare CA125, che viene ancor oggi utilizzato. L'evoluzione dei marker tumorali si è evoluta dal punto di vista tecnologico.

Il marker tumorale è definito come una sostanza presente all'interno o pordotta dallo stesso tumore o prodotta dall'ospite in seguito alla presenza del tumore. Che può essere utilizzata per differenziare il tumore dal tessuto normale o per determinare a presenza del timore sulla nase della misurazione dellla sua concentrazione nel sangue o in fluidi biologici.Possono essere di tutto:• Enzimi o isoenzimi, come il PSA• ormoni: HCG• prodotti di differenziazion• molecole di adesione• molecole di trasporto• proteine del citoscheletro (TPA• markers identificati con anticorpi monoclonali• markers associati a modificazioni genetiche del tumore• cellule tumorali circolanti

il tessuto neoplastico assomiglia molto ai tessuti embrionali più che a tessuti differenziati. dell'adulto Sulla base di queste similitudini, gli anatomopatologi classificano il tumore come "ben differenziato", "scarsamente" o "per nulla" (anaplastico). Grossolanamente la gravità del tumore (metastasi, invasività) è proporzionale al grado di sdifferenziazione. I marker tumorali circolanti sono quasi sempre la controparte biochimica o immunologica dello stato biochimico del tumore. I marker tumorali sono la reespressione di sostanze prodotte normalemte da tessuti embriologicamente correlati.Spieghiamo bene che cosa significa.Il CEA è usato come biomarcatore per il carcinoma del colon. Tessuti embriologicamente correlati al colon sono stomaco, fegato e pancreas. È così difficile che i livelli di CEA siano alti nei tumori di stomaco, fegato e pancreas? no. Alfachetoproteina è un marcatore dell'epatocarcinoma. Ma il fegato e i tessuti neoplastici che da lui derivano, hanno origine embrionale con colon, stomaco e pancreas. Quindi, sulla base di CEA elevati, è difficile dire qual è di precisa la sede in cui è collocato il carcinoma.Il tessuto linfoide ha un'origine embriologica molto distante da colon fegato e pancreas. Perciò è improbabile un aumento del CEA nei tumori del tessuto linfoide.

Ci sono alcuni biomarcatori cosiddetti specifici, ovvero che sembrano specifici. Ad esempio la tireoglobulina viene fatta solo dalle cellule epiteliali tiroidee, il PSA solo dalle cellule prostatiche, ecc.. ma non necessariamente questi marcatori, che sono espressione di un dato tipo cellulare, sono anche espressione del tumore dove quel tipo cellulare è prevalente.Vediamo la calcitonina, che viene prodotta dalle cellule C della tiroide. Se trovo aumento della calcitonina, allora deduco che ho aumento delle cellule C per tumore; ma non è detto sempre, perchè ci sono alcuni tumori a piccole cellule del polmone che si sdifferenziano e fanno la calcitonina, come anche alcuni tumori endocrini del tubo digerente.

NSE è un acronimo che sta per enolasi neurono specifica; quindi ci aspetteremmo che sia aumentato nei tumori di origine neuronale (tumore al cervello). Quale tumore ne produce di più? Tumori del polmone a piccole cellule, tumore di wilms (che si sviluppa nel rene), melanoma, timoma, linfoma, ecc...Si dice che ci siano marcatori tumorali specifici per un dato tipo istologico. Ad esempio, negli adenocarcinomi prevalgono questi marcatori: CEA, CA 19.9, CA 15.3, MCA,CA 50, CA 195Mentre nei carcinomi epiteliali squamosi prevalgono questi: SCC, TPA, Cyfra 21.1, TPS, TPA Ma non è sempre così.

Ci sono poi cause non oncologiche che comunque portano a variare i marcatori. Un esempio è la gravidanza, durante la quale questi marcatori aumentano: AFP, hCG, MCA, CA 125, TPA, TG

nel ciclo mestruale: CA 125Un'attività sessuale sfrenata fa aumentare PSA nel maschio.Il fumo aumenta il CEA non per il cancro al polmone, ma anche TPA, TG, SCC Abuso alcolico: CEA, TPA, Ferritina, SCC

Cause patologiche ma non oncologiche possono aumentare i livelli di marcatori tumorali, pur non essendo tumori. ____________________________________________________Ittero CEA, TPA, Ferritina, CA 15.3, CA 19.9Malatt. Resp. Croniche CEA, TPA, Cyfra 21.1Insuff. Renale Cronica CEA, CA 50, SCC, CA 125, TPA, TGMalattie Reumatiche CA 19.9Diabete Mellito CA 19.9, CA 50Insuff. Cardiaca Cong. CA 125Epatite acuta CA 19.9, CA 125, CA 15.3Epatopatia Cronica CEA, TPA, TPS, Cyfra 21.1, CA 19.9, CA 50Colelitiasi CA 19.9Malattie della tiroide TGEndometriosi= presenza di tessuto uterino in zone diverse dall'utero CA 125Ipertrofia prostatica PAP, PSAPsoriasi SCC

Cause non-oncologiche di variazioni dei livelli dei markers(cause jatrogene)

Esplorazione rettale PAPCateterismo vescicale PAP, PSAAgobiopsia prostatica PAP, PSAAgobiopsia tiroidea TGTraumatismo chirurgico TPATraumatismo chirurgico sul peritoneo CA 125Broncoscopia TPACardiochirurgia con CEC PSA

Quindi non esistono biomarcatori tumorali con sensibilità (La sensibilità esprime la capacità di un marker di riconoscere la presenza di malattia in pazienti effettivamente malati) e specificità (La specificità esprime la capacità di un marker di riconoscere solo la presenza di malattia e di restare negativo nei pazienti non affetto) che arrivano al 90%.

L’efficacia diagnostica esprime in modo complessivo l’efficacia di un marker e rappresenta la quota complessiva di risultati corretti

veri positivi + veri negativi (risposte corrette)Eff. Diagn = ______________________________

veri pos.+veri neg.+falsi pos.+falsi neg.

I markers tumorali hanno vari impieghi:• Screening nella popolazione generale. Sulla base dei ragionamenti fatti finora non è molto utile, non devono mai essere usati nella popolazione asintomatica! Tuttavia c'è un'eccezione, il carcinoma midollare della tiroide nella sua forma multifocale bilaterale, perchè qui si ha una familiarità elevatissima: dunque nei consaguinei dei pazienti con questa patologia, vado a fare il dosaggio della calcitonina come "screening", anche se questo non è un vero screening perchè la popolazione che vao a indagare è selezionata.

Carcinoma della prostata: si fa screening dosando il PSA. Ma bisogna ricordare che trovare il PSA elevato rispetto al cut off ci dice che il paziente ci POTREBBE essere una patologia prostatica di natura diversa, tra cui anche la neopasia.

• Diagnosi differenziale in pazienti sintomatici. Al mattino mi lavo i denti e vedo sangue e devo capire se questo sangue viene da un eccesso di tosse oppure da un traumetismo con lo spazzolino: per saperlo vado a fare i biomarcatori tumorali.

Ho un paziente con tumefazione linfonodale sinistra: si sospetta o linfogranuloma maligno (Hodgkin) oppure una metastaasi linfonodale per neoplasia gastrica. In questo paziente si indagano tutte le possibili sedi di neoplasia che possono dare quel segno e sono tutte negative. Si fa biopsia e si manda all'anatomopatologo che non ha mai visto una cosa così, ma sospetta sia una metastasi. Si decide di dosare tutti i biomarcatori, ma si evita il PSA perchè non si è mai vista la metastasi al linfonodo; eppure era quella.

• Staging clinico del tumore: se positivo ai biomarcatori, il tumore è più indifferenziato di un tumore che invece risulta negativo al test, e quindi più grave. Abbiamo altri metodi per rispondere a queste domande.

• Stima delle dimensioni del tumore: più è alto il biomarcatore più è ESTESO il tumore, non più è grande la massa. Abbiamo altri metodi per rispondere a queste domande.• Indicazione prognostica della progressione della malattia. Ma l'esame istologico è più preciso!• Diagnosi di tumore allo stadio primitivo: le caratteristiche di sensibilità e specificità non assolute dei markers ne limitano

l’utilità in questa situazione clinica. Eccezione: Ca a piccole cellule del polmone, Ca midollare della tiroide, Ca del testicolo, Ca dell’ovaio, neoplasie neuroendocrine per le quali esistono markers ad elevata specificità tessutale, Carcinoma prostatico

• Diagnosi di tumori allo stadio avanzato: nei pazienti con neoplasia disseminata, la diagnosi di tumore viene posta concriteri clinici, anatomopatologici e strumentali. Limitazione all’impiego dei markers tumorali: monitorizzazione dell’efficacia di una eventuale terapia

• ricerca della sede d'origine: Le metastasi multiple, in particolare quelle a sede epatica, sono spesso causa di aumento dei livelli ematici di numerosi markers tumorali e non necessariamente specifici per la neoplasia di origine.

L’impiego dei markers è potenzialmente molto utile per identificare il tumore di partenza nel caso di metastasi che originano da neoplasie per le quali esistano markers ad elevata specificità tissutale, come tiroide, prostata, sinciziotrofoblasto

• Valutazione dell’efficacia del trattamento.• Individuazione delle recidive• Monitoraggio della risposta alla terapiaQueste sono alcune possibili indicazioni.Sulla base dei ragionamenti fatti in passato, ci sono alcuni di questi punti che non sono molto validi?

Considero gli ultimi 3 punti. Ho una signora che va dal chirurgo a farsi vedere perchè facendo un'ecografia alla tiroide ha visto un nodulo tiroideo. Il chirurgo fa biopsia e si vede un carcinoma alla tiroide. Si deve operare. La signora è preoccupatissima perchè non vuole che si veda la cicatrice al collo, perciò il chirurgo vuole asportare solo il lobo dove si trova il tumore. Nella paziente viene dosata la tireoglobulina (marcatore molto aspecifica per il tumore tiroideo) che è alle stelle. Si fa operazione chirurgica e la tireoglobulina crolla, ma non arriva a zero. Il chirugo allora si preoccupa e pensa che magari ci sia da togliere anche l'altro lobo. Fa di nuovo l'intervento e la tireoglobulina arriva pressochè a zero. L chirurgo allora controlla i livelli di tireoglobulina ogni 3 mesi per circa 1 anno e mezzo, poi torna a salire. Si fa scintigrafia ossea e si trovano metastasi tiroide.--> grazie al biomarcatore ci si è accorti di questo

iperplasia paratiroidea, che può portare ad un adenocarcinoma paratiroideo. Nella neoplasia paratiroidea, si vanno progressivamente a togliere le paratiroidi: prima se ne tolgono due, poi si può arrivare a toglierne 4. Un signore deve sottoporsi questo intervento.in quegli anni si era appena introdotta una metodica di dosaggio del paratormone durante l'intervento, così capisco quante paratiroidi devo togliere, magari il paratormone si abbassa togliendono solo 2, senza bisogno di arrivare a toglierne 4. Il chirurgo toglie tutte le paratiroidi, ma non si ferma e ridosa ancora il paratormone e vede che il paratormone è ancora alto, perchè il paziente aveva una paratiroide sovranumeraria parasternale.

L'utilizzo dei biomarcatori tumorali, così come lo prevediamo (screening e indagine differenziale) ci dice poco, ma ci sono casi in cui ci dice tantissimo:• efficacia del trattamento• comparsa delle recidivePer avere informazioni a questo riguardo è necessario fare un'altra cosa. Nell'ambito del bilancio del tumore è sempre meglio introdurre il dosaggio dei biomarcatori tumorali: facciamo la diagnosi e poi dosiamo i biomarcatori, perchè ci può servire MOLTO TEMPO DOPO per valutare quello che i biomarcatori possono dare

Nella definizione di marcatore tumorale era prevista anche una sostanza prodotta dall'ospite in risposta alla presenza di tumore. Qualche anno fa compare su NewEngland un articolo: firme autoanticorpali nel carcinoma della prostata. Questo studio si basa su questo presupposto: il tessuto neoplastico è immunologicamente diverso da quello sano e chissà che l'organismo non faccia anticorpi contro questi antigeni tumorali; perciò, se trovo questi anticorpi, posso diagnosticare il tumore!Sono stati identificati 5 tipi di autoanticorpi che vengono usati per i dosaggi.Abbiamo 3 condizioni:

1. Nel pannello C abbiamo un pool di 128 soggetti, 68 con e 68 senza carcinomi della prostata. Si fa comparazione tra i valori di PSA (verde) di questi soggetti e i loro valori di anticorpi contro il tumore (rosso). Si vede che l'efficacia di questi autoanticorpi è superiore, a livello diagnostico, rispetto al dosaggio del PSA.2. Nel pannello D abbiamo pazienti con valori di PSA compresi tra 4 e 10 (non sono più distinti in pazienti con tumore e senza tumore), quindi al di sopra del cut off. Tra questi pazienti, dato che il dosaggio del PSA è un esame molto aspecifico, ce ne saranno alcuni con il tumore e altri no. Perciò vediamo come il dosaggio del PSA non ci aiuti per nulla alla differenziazione e quindi alla diagnosi di tumore alla prostata. Al contrario, gli anticorpi sì.3. Nel pannello E abbiamo pazienti che hanno il PSA compreso tra 2,5 e 10. Il PSA non li distingue, mentre gli anticorpi sì!

Questo lavoro è stato pubblicato nel 2005. Oggi questi anticorpi non sono usati per diagnosticare il tumore alla prostata; perchè? Rispetto alle informazioni che dobbiamo avere, non ci dicono molto di più. Infatti, anche se venissero alti valori di anticorpi, non andrei subito a trattare il paziente con operazione chirurgica o chemioterapia, ma farei altri esami. Per questo il test non viene usato.Questo ci fa pensare se realmente gli esami diagnostici che andiamo a richiedere sono utili. Il Laboratorio fornisce un utile sussidio all’approccio diagnostico e terapeutico nei confronti del paziente neoplastico.Il dosaggio dei markers tumorali è uno dei tanti aspetti, e non può essere mai quello esclusivo, nella diagnostica oncologica.La potenza del Laboratorio è tanto più efficace quanto più critico è l’impiego dei markers tumorali.Ciò non significa che il dosaggio dei markers tumorali deve essere drasticamente limitato, ma che l’interpretazione clinica del dato numerico ha finalità ben precise.Differenza critica esame di laboratorio: le variazioni percentuali che osservo sono o meno statisticamente significative? Questa formula mi risponde a questa domanda.Massimo GION, guida rapida all'uso dei biomarcatori tumorali:

Per capire se il paziente ha tumore, vado a dosare i valori di PSA nel tempo e vedo comunque se c'è una crescita. Se si mantengono al di sopra del cut-off, ma comunque costanti nel tempo, è più probabile una prostatite; mentre se vedo che nel tempo aumentano (dato che una caratteristica del tumore è proprio la sua evolutività), allora drizzo le antenne.Ricordiamo comunque che la medicina NON è una scienza esatta.

Lezione 27/3

VALUTAZIONE DI LABORATORIO DELLA FUNZIONALITA' RENALECosa si intende per funzione del rene? La filtrazione, assorbimento, riassorbimento, secrezione, produzione di ormoni (renina, EPO), regolazione del volume plasmatico e dello stato di idratazione e/o disidratazione.Nel grafico (accanto) si vede l'andamento della mortalità (per malattie cardiovascolare) o dell'incidenza di malattie cardiovascolari in rapporto a diversi gradi di funzionalità renale (non stiamo considerando la morte per insufficienza renale). In presenza di una funzionalità renale ridotta, l'incidenza di queste malattie quadruplica: lo vediamo per il reinfarto, l'insufficienza cardiaca, lo stroke (= ictus). Quindi una corretta o alterata funzionalità renale condiziona in modo significativo il rischio di mortalità per cause di altra natura. Questo è molto importante per l'approccio diagnostico: tutte le volte che ho davanti un paziente con problemi cardiovascolari, mi devo chiedere come funziona il suo rene. A seconda di come funziona il suo rene, infatti, il rischio di morte per quella data patologia (cardiovascolare nel caso che stiamo considerando) cambia.

Noi prendiamo in considerazione una sola delle funzioni del rene, la filtrazione glomerulare. Uno dei metodi per determinare la GFR(= VGF) è la creatinina. Facciamo il caso che un individuo sappia rimuovere dal sangue (e mettere nelle urine) 1440 mg in 24 h di creatinina, quindi elimina circa 1 mg di creatinina al minuto. Se la concentrazione plasmatica della creatinina è 0,01 mg/ml, allora si potrebbe dire che ogni minuto 100 ml di sangue sono depurati da creatinina. In questo modo, assumendo che la creatinina sia solo filtrata e nè riassorbita nè secreta, assumo che la clearance della creatinina è sovrapponibile alla VFG (velocità di filtrazione glomerulare).

U = concentrazione urinaria dellacreatininaP = concentrazione plasmatica dellacreatininaV= volume di urina in 1 min

Spiegazione della formula (fisiologia Grossini)

Per valutare il volume di filtrato prodotto dal rene in un minuto (cioè la VFG) occorre introdurre il concetto di clearance renale(C). è infatti difficile valutare VGF con le formule viste prima, perché dovrei conoscere dei valori di pressione difficili da misurare. La clearance renale di una sostanza è il volume di plasma depurato da quella sostanza nell'unità di tempo (1 minuto).La clearance si esprime quindi in ml/min. Sapendo che una determinata sostanza ha una certa concentrazione nel plasma (Px) (e quindi la quantità di sostanza che arriva al rene = carico filtrato) e conoscendo la quantità di quella sostanza presente nelle urine (Qx) (e quindi la quantità di sostanza che viene espulsa= carico escreto), si può conoscere, per il principio di diluizione, il volume di plasma in cui si trovava quella sostanza prima della filtrazione, ovvero il volume di plasma filtrato in un dato periodo di tempo.

C= Qx/PxDove Qx (carico escreto) = concentrazione della sostanza nell'urina (Ux) x volume di urina prodotta in un minuto (V).

C= (Ux x V)/ PxIl calcolo della clearance renale può dare indicazioni sulla velocità di filtrazione glomerulare (VFG) se si utilizza una sostanza la cui quantità nel tubulo prossimale e nell'urina è uguale, cioè una sostanza che non viene nè assorbita nè escreta, ma solo filtrata, come la creatinina (in realtà sarebbe meglio usare l'inulina, perchè la creatinina viene secreta per circa il 20%, ma basta tenerne da conto e non cambia nulla).

Affinchè questa formula rappresenti la realtà, è necessario che i termini presenti al suo interno siano rispettati , cosa che non si verifica spesso. Infatti, per calcolare il volume urinario, è necessario sapere bene quante urine si fanno nelle 24 h, cosa difficilissima da far capire al paziente (soprattutto bambini e anziani). Circa il 45% della raccolta delle urine nelle 24 h è scorretta. Quindi basarsi solo su formule che dipendono così tanto da un valore che non si riesce a ottenere, non va bene.Tuttavia, avere un'informazione quanto più precisa sulla filtrazione glomerulare è importante per conoscere la presenza di un eventuale danno renale. Questo (= il danno renale) evolve in 5 punti:• rischio• danno• insufficienza (difetto di funzionalità)• perdita (riduzione del parenchima renale funzionante)• ESRD (stadio finale di danno renale)

L'evoluzione di questo stadio porta all'insufficienza renale acuta o cronica. Alcune di queste fasi sono reversibili, le prime 3, se precocemente riconosciute e opportunamente trattate. Le ultime 2 sono irreversibili.Si distingue una fase dall'altra sulla base della concentrazione plasmatica di creatinina, oppure sulla velocità di filtrazione glomerulare, oppure sulla diuresi. Ma se la raccolta delle urine non è corretta, le fasi dello schema (che permette di distinguere i vari stadi del danno renale) che dipendono dalla filtrazione glomerulare (prime 3) non sono corrette.

Ci sono 5 fasi progressive per la filtrazione glomerulare.1. Aumentata (sindrome da iperfiltrazione) o normale2. Danno con leggera diminuzione3. moderata diminuzione4. grave5. insufficienza renaleIn base alla filtrazione glomerulare sono individuati questi stadi differenti.

L'evoluzione della diagnostica per l'infarto si è evoluta dagli anni 50. Per quanto riguarda l'evoluzione della diagnostica di insufficienza renale si continua ancora a misurare la creatinina sierica.Perchè? O perchè è un test così buono che non ha bisogno di miglioramento, oppure ci sono dei problemi che ancora non sono stai risolti.

CREATININA E FUNZIONALITÀ RENALE

Questo schema mette in relazione la concentrazione plasmatica di creatinina, la filtrazione glomerulare e l'integrità della massa renale. Quando noi abbiamo una riduzione del 50% della massa renale (paziente senza un rene) la creatinina si modifica di pochissimo, la filtrazione glomerulare si riduce del 20% (ci aspetteremmo una maggior riduzione!) e la massa nefrosica funzionante del 50%.Quindi noi abbiamo una perdita (il 50% dei glomeruli viene persa), ma tuttavia la creatinina non si modifica.Invece, quando solo il 25% della massa nefronica è integra, allora sì che abbiamo anche una riduzione della filtrazione glomerulare e un aumento della creatinina (come la logica ci portava ad aspettarci anche prima).

Correlazione tra la concentrazione sierica di creatinina e la GFR, tramite il cromo radiattivo (si inietta un bolo di cromo radiattivo e poi tramite la scintografia renale si misura la velocità di scomparsa dal sangue e comparsa nelle urine.) . Da 0,3 a 1,4 sono i range di normalità della concentrazione sierica della creatinina. Tuttavia questo range della "normalità" è molto ampio, poichè troviamo pazienti con GFR di 100 (normale), sia di 40 (non normale). Quindi è la concentrazione plasmatica di creatinina che ci dà info sulla funzionalità renale?

Scintigrafia = esame diagnostico strumentale atto a ottenere la rappresentazione grafica della distribuzione di materiale radiattivo, appositamente introdotto, in grado di concentrars selettivamente in un organo o in un tessuto.

Come si misura la GFR?

Antropometria =musurazion del corpo umano e delle sue parti.

EGFR (stima della velocità di filtrazione glomerulare).

La formula ideale è la formula di Starling.

Tuttavia non posso misurare questi parametrinel paziente, se non con una metodologiamolto invasiva, quindi devo ricorrere aqualcos'altro.

Sono state fatte delle proposte negli ultimi 15 anni (questi sono tutti metodi per la misura diGFR indiretta):• Cockroft-Gold: considera la creatinina, superficie corpore, peso e sesso. Fa una stima della clearance della creatinina per ricavare VFG• MDRD1 (= Modification of Diet in Renal Desease): considera creatinina, età, sesso, etnia, BUN (azoto ureico) e concetrazione plasmatica di albumina• MDRD2: uguale a MDRD1, ma non considera azoto e albuminemiaQueste formule si ricavano andando a guardare il grafico visto prima (quello del cromo radiattivo), + vari paramentri che vengono introdotti dopo.

MDRD ha avuto grandissimo successo, tanto che le varie società scientifiche di medicina di laboratorio dicono che accanto al dosaggio della creatinina deve essere messa anche la stima della GFR (=EGFR= estimated GFR). Questo perchè MDRD presenta notevoli vantaggi:• elimina le misure antropometriche• Accettato e diffuso in tutto il mondo• è studiata e corretta per i problemi di calibrazione della creatinina• Buone performance nei soggetti con ridotte VGF• Performance superiori alle altre formuleTuttavia molti pazienti risultano avere GFR non normale (anche se di poco).Questo perchè la formula MDRD era stata sviluppata in un gruppo di 1628 PAZIENTI affetti da gradi diversi di insufficienza renale. Quindi questa formula aveva 2 problemi:• sottostima la filtrazione glomerulare nell'individuo sano• è applicabile solo tra i 18 e i 75 anni. Ma anche al di fuori di queste fasce è importante conoscere la corretta funzionalità renale. Per gli anziani soprattutto per sapere se sono in grado di eliminare (con i reni) tutti i farmaci che prendono.• Inoltre si dubita della sua efficienza in pazienti con patologie concomitanti

Nel 2009 compare un lavoro che vuole correggere i problemi del MDRD con una formula che deriva da uno studio condotto su un'altra popolazione fatta sia da soggetti malati, che da individui sani. La formula è CDK-EPI (= Chronic Kidney Desease Epidemiology Collaboration) e si pensava potesse rimpiazzare MDRD nella routine clinica. Ha un altro vantaggio: può essere adattata, con le opportune modifiche, agli ultri75 enni (per pazienti fino a 110 anni), nella formula bis1 -> noi possiamo valutare la GFR dai 18 ai 110 anni.

Anche questa formula utilizza la creatinina, che è uno dei prodotti del catabolismo della fosfocreatina nel tessuto muscolare e quindi è proporzionale alla massa muscolare. Se

faccio un grafico in cui metto su x età e su y la concentrazione plasmatica di creatinina, avrò una correlazione lineare. Quindi la creatinina per la valutazione della funzionalità renale in età pediatrica non la posso usare (poichè minore è l'età, minore è la concentrazione plasmatica di creatinina, fatto che però non riguarda assolutamente la funzionalità renale). Per loro si sta studiando la cis-statina C, per la stima di GFR -> poichè sono più piccoli hanno una minor massa funzionale, ma questo è del tutto normale, non vuol dire che sono cachettici o anziani.

Tuttavia c'è un problema. Si è fatto un diagramma in cui si considerano i livelli misurati di creatinina tramite metodiche e strumentazioni differenti (per costi, ditte farmaceutiche che le producono, ecc..) sullo stesso campione. Si cercano, con questo studio, le variazioni nel dosaggio della creatinina che si hanno quando si usano metodi diversi. Si è visto che, anche se i valori della creatinina che vengono misurati sono tutti nel range della normalità, relazionati al GFR (grafico con il cromo radiattivo) cambiano moltissimo, facendo risultare in un laboratorio un soggetto malato, in un altro sano. Si sceglie un tipo invece che un altro per una questione di costi.

Questa formula può essere utile nella valutazione dell'insufficienza renale acuta e oliguria. Una bassa FE indica una retenzione di Na dal rene. Al contrarui, alti livelli di Fe possono suggerire perdita di Na dovuta a necrosi tubulare acua o altre cause da insufficienza renale acuta o altre cause di insufficienza renale intrinseca.Fin'ora abbiamo visto solo la filtrazione glomerulare, ma vediamo che il rene ha anche altre funzioni, tra cui l'escrezione l'assorbimento. Si va quindi a valutare la funzionalità tubulare. Sono stati sviluppati una serie di test che vanno a indagare l'ambito dell'escrezione frazionaria: quiabbiamo il sodio e quindi valutol'assorbimento, altrimenti posso valutare lasecrezione andando a sostituire al sodio(nella formula) il potassio.Questi parametri ci danno molte info sullafunzionalità (non sulla sua integrità) deltubulo renale.Al di sotto dell'1% danno renale -> ce n'èpoco nelle urine e quindi avremoiponatriemia e/o ipovolemiaal di sopra del 2-3% ho necrosi tubulareacuta

55.24Esistono anche nuovi biomarcatorinell'ambito della diagnostica dellafunzionalità renale: NGAL (= lipocaina,viene prodotta dai tubuli renali a seguito didanno; valori alti possono essere indice di danno a livello dei tubuli), il cui utilizzo è sempre più diffuso (non tanto perchè è molto costoso) che è molto più sensibile e specifico della creatinina.

ESAME DELLE URINELa tipologia di indagine che dà la maggior quantità di informazioni è l'esame delle urine nelle sue 3 varianti:• esame fisico (volume, aspetto, colore, odore, peso specifico)• Esame chimico: ph, glucosio, emoglobina, bilirubina urobilinogeno, porfirine, chetoni, nitriti, proteine• Esame microscopico del sedimento urinario: ricerca di cellule, strutture sopracellulari, ...Nell'esame fisico non compare mai la diuresi= volume urinario

ml / 24 oreNeonati 30 - 601 - 3 anni 300 - 6003 - 5 anni 400 - 7005 - 8 anni 500 - 10008 - 14 anni 600 - 1400adulti 600 - 1600anziani 400 - 2200negli adulti il range di normilità è molto ampio e dipende da una serie di fattori (dispersione di liquidi, ecc...).Neglio over 75 il range di variabilità è ancora più ampio (dai 400 ml ai 2200 ml nelle 24h).

Possiamo avere aumento del volume urinario per:• eccessiva introduzione di acqua• incapacità di riassorbire l'acqua filtrata (diabete insipido o per problemi con ADH)• incapacità di riassorbire i soluti (diabete mellito scompensato, diuretici dell'ansa che bloccano il riassorbimento tubulare di sodio)

Possiamo avere riduzione del volume urinario:• da ridotta introduzione di acqua. Se noi abbiamo sete beviamo, il neonato no e l'anziano magari non riesce da solo a bere. Quindi, anche per questi individui è fondamentale la raccolta della diuresi.• da disidratazione• da ridotta filtrazione. I pazienti con insufficienza renale cronica possono fare 30-40 ml nelle 24 h. Oppure in casi di sindromi da inappropriata serezione di ADH, ovvero troppo ADH e quindi troppa acqua assorbita (caso di alcuni tumori o farmaci anti-epilettici).

ASPETTO DELLE URINEColoreNormalmente è limpido, ma può diventare torbido, Per vari motivi:• per precipitazione di costituenti solubili (principalmente fosfati). Nella vescica le urine sono a 37°C, quando sono espulse e fa freddo, alcuni costituenti possono precipitare• Batteriuria imponente• Leucocituria, anche nei casi di calcolosi• per lipidi -> sindrome nefrosica o scorretta deposizione di lipidi a questo livello• per contaminazione fecale (soprattutto nelle bambine, che si puliscono nel modo sbagliato).

Le urine possono essere:• Giallo paglierino• Incolore. Per incapacità a concentrare• Rosse. Per contaminazione mestruale, emoglobinuria, mioglobinuria (soprattutto nei pazienti con sindromi da schiacciamento, grave necrosi della muscolatura scheletrica. La mioglobina è liberata, passa nelle urine, dove dà questo colorito. A livello urinario precipita e ostruisce i tubuli e questi pazienti hanno un elevatissimo rischio di necrosi tubulare ed insufficienza renale acuta. La presenza di mioglobinuria porta a una terapia che dà aumento della diuresi subito), porfinuria, alimenti (barbabietole)• Giallo arancio. Per eccessiva concentrazione, bilirubina, urobilinogeno, urobilina• Marrone scuro. Tipico nell'ambito di malattie congenite legate a deficit del metabolismo di amminoacidi• Verde. Infezioni da pseudomonas aeruginosa -> alcuni ceppi infatti producono un pigmento verde• Blu. Blu di metilene o coloranti usati per cistografia.

Peso specifico.Quello normale è tra 1007 e 1030. è il peso di un'unità di volume (di 1 l). Dipende dalla presenza di acqua e da ciò che nell'acquaè disciolto: perciò il peso specifico dipende da che cosa c'è nelle urine. Quindi abbiamo aumento del peso specifico nel diabete mellito scompensato o nelle sindromi da inappropriata (ovvero iper) secrezione di ADH, nell'ipoperfusione renale o nelle ostruzioni delle vie renali. Invece abbiamo una diminuzione del peso specifico nel diabete insipido, nelle insufficienze renali o nelle tubulopatie.

Questo parametro andrebbe monitorato nel tempo nei pazienti in cui l'eliminazione di soluti può modificarsi (per patologia o terapia).

PhIl ph delle urine normalmente è più acido di quello del sangue per una serie di motivi:• Escrezione diretta di alcuni acidi (acido urico)• Scambio Na+/H+• Produzione renale di NH3 ed escrezione di NH4+• Escrezione di H+ come H2PO4-• Riassorbimento di bicarbonatiPossiamo avere condizioni in cui il ph urinario è molto acido, al di sotto di 5,5: questo avviene nelle acidosi respiratoria e metabolica, alcuni farmaci (aspirina), alcalosi ipopotassiemica, dieta iperproteica.Oppure possiamo avere un ph superiore a 6,5 soprattutto per infezione delle vie urinarie (o da proteus o da pseudomonas), per alcalosi respiratoria e metabolica, per farmaci.Se trovo un ph maggiore di 6,5 in un paziente, quindi, vado a richiedere urinocultura.

GlucosioNelle urine normalmente non è presente, perchè nella cellula tubulare c'è il riassorbimento e tutto il glucosio filtrato è riassorbito. Il sistema di riassorbimento di glucosio ha un limite massimo, fissato a 160-180 mg. Quando la concentrazione plasmatica di glucosio lo supera, il sistema di riassorbimento è saturato e il glucosio resta nelle urine. Possiamo avere:• glicosuria iperglicemica (glucosio nelle urine e iperglicemia). Si ha soprattutto nel diabete (qualunque esso sia) o nei pazienti in trattamenti con steroidi (che sono iperglicemizzanti). Si usava un dosaggio particolare della glicosuria, la glicosuria frazionata: si invitava a raccogliere le urine in 3 campioni distinti divisi per ore (un campione teneva le urine dalle 09.00 alle 12.00, un'altro tutte le urine di una data fascia oraria, ecc...) e si valutava la glicosuria. Questo approccio ora è stato completamente abbandonato.• glicosuria normoglicemica (glucosio nelle urine e la concentrazione di glucosio a livello plasmatico è normale o addirittura bassa). Si verifica in tutte quelle siuazioni in cui si ha un deficit nel trasporto tubulare di glucosio. Si ha in caso di necrosi tubulare renale, che spesso si verifica in seguito ad avvelenamento da piombo.

Ci sono casi in cui manca il trasportatore di glucosio a livello sia renale che instestinale: in questo caso l'unica possibilità del mantenimento di una normale omeostasi glucidica, è il trapianto renale o la continua somministrazione parenterale di glucosio. Normalmente questa situazione è incopatibile con la vita. A volte può mancare solo il trasportatore a livello renale.Si può avere anche quando si prendono zuccheri diversi dal glucosio, che vanno a competere con i vari trasportatori.

Lezione 3 aprile

Corpi chetonici nelle urine (Acetoacetico, acido betaidrossibutirrico, acetone)Normalmente non ce ne sono e compaiono nelle condizioni in cui si ha una marcata lipolisi associata a una beta ossidazione degli acidi grassi. Vengono prodotti i corpi chetonici, in questo caso. Queste cose avvengono:• nel diabete 1 scompensato ( e non nel diabete 2, l'insulina è il principale ormone lipogenico, quindi se non c'è insulina viene potenziata la lipolisi; nel diabete 2 ce n'è di insulina (almeno, inizialmente), solo che non ha effetto)• negli stati cachettici• Negli sforzi fisici prolungati per l'utilizzo di forme energetiche alternative• Negli stati febbrili e tossici con vomito e diarrea• nella glicogenosi

EmoglobinuriaNormalmente non ce n'è. Stiamo parlando di emoglobina libera nelle urine, non di sangue. Si ha tutte le volte che si ha un'emolisi in vivo, come nelle anemia emolitiche, autoimmuni, da farmaci, da incopatibilità in seguito a trasfusioni.Esiste il deficit di G6PD, dove abbiamo un'importante emolisi, causata dall'assunzione delle fave o della divicina, che vanno incontro a un ciclo redox che satura i meccanismi antiossidanti del soggetto che ne è carente a causa di questa mutazione. In questi casi ci si accorge dell'emolisi per via dell'emoglobinuria.In caso di fenomeni emorragici urinari. Ma non è da considerarsi ematuria (= presenza di globuli rossi nel sangue)? No, perchè non ci sono globuli rossi. I globuli rossi non sono fatti per sopravvivere nell'urina (ambiente molto diverso dal plasma), perciò la persistenza di globuli rossi a lungo nell'urina porta a una loro lisi, con emoglobinuria.Altre cause possono essere:• Protesi valvolari cardiache (quando ancora si usavano quelle metalliche). Lo scontrarsi contro la valvola portava a una rottura dei globuli rossi.• Ustioni estese• infarto renale• emoglobinurie parossistiche (= violento): insufficienza congenita del midollo osseo che causa, per varie ragioni, emolisi. In particolare questi pazienti hanno urine scure durante la notte o al primo mattino.

ProteinuriaSi dice che a livello urinario, in condizioni normali, non ci sono proteine, ma non è così. Le proteine ci sono, anche se in bassissime concentrazioni. Possono essere quantizzate con metodi di dosaggio molto sensibili (altrimenti non ce ne si accorgerebbe, talmente sono poche quelle fisiologiche).Si può classificare in 3 gruppi:• Lieve: (< 1 g/24 ore): Può essere associata a situazioni di modesto interesse patologico, spesso associata a condizioni posturali particolari (commesso, che sta per molto tempo in piedi, specie se il paziente è magro, perchè le logge renali sono più sottili e i reni scendono), nei bambini che intorno ai 7-8-9 anni iniziano a svolgere attività fisica. Sono condizioni di scarso interesse patologico. Ma può anche essere il primo segno di una patologia renale. Quindi, davanti anche a una lieve proteinuria, è sempre bene indagare più a fondo.• Moderata (1 - 4 g/24 ore). Si associa solitamente a patologie renali importanti o a calcolosi urinarie importanti, specie quando le dimensioni sono molto grandi da dare danni rilevanti a livello renale. Spesso però è associata a malattie renali.• Massiva (> 4 g/24 ore) Configura la sindrome nefrosica. Solitamente causata da malatie primitive renali o da malattie sistemiche con compromissione renale (nello specifico, più probabilmente glomerulare). Si ha un allargamento delle maglie del setaccio renale, che consente il passaggio delle proteine. Ci sono pazienti che eliminano fino a 20-25 g di urine nelle 24 h. In questi pazienti il meccanismo di compenso è molto particolare. La maggior parte delle proteine eliminate sono albumina, quindi il paziente farà più albumina a livello epatico. Ma per poterla produrre in grandi quantità ha bisogno di amminoacidi e spesso quelli introdotti con la dieta non sono sufficienti e quindi va a distruggere le proprie proteine, specie quelle muscolari. Questi pazienti, a causa della riduzione della pressione oncotica, sono gonfi con molti edemi (anche situazione di anasarca).

L'approccio diagnostico e terapeutico è differente a seconda della classe di proteinuria.In condizioni normali in un po' di proteinuria si ha a causa di una modesta filtrazione glomerulare di proteine, per essudazione tubulare nei modesti processi infiammatori a carico del tubulo, per turn over delle cellule che tappezzano le vie urinarie: se penso al percorso del filtrato glomerulare, ho che va a pulire un condotto che porta fuori: qui le cellule di sfaldamento vengono portate via dal filtrato, distrutte per stress meccanico e quindi liberano proteine.Possono avere anche origine cisto-pielica, per essudazione a seguito di processi infettivi-infiammatori oppure indifferente (per origine), associata ad emorragie.

Quando trovo proteinuria, devo chiedermi che tipo di proteine sono.(Schema di elettroforesi e caratterizzazione delle proteine che possono esserci nelle urine figura vicino).Posso avere proteine con una massa molecolare minore dell'albumina o maggiore. Perchè si dividono in base a questo?Si dice che le proteine non sono filtrate a livello glomerulare, ma non è vero, quelle piccole passano agevolmente attraverso il filtro glomerulare, ma tuttavia nelle urine ne troviamo poche, grazie alla presenza di sistemi di riassorbimento a livello tubulare delle proteine a basso peso molecolare. Questo (ovvero il trasporto delle proteine dal lume al tubulo) non succede per le proteine ad alto pm, perchè in genere nemmeno passano il setaccio glomerulare e se anche passassero non verrebbero riassorbite.Quindi, tenendo conto di questo, se vado a quantizzare e tipizzare le proteine che trovo nelle urine, faccio le mie considerazioni. Se trovo solo proteine a basso pm, la proteinuria è data da un danno renale di tipo tubulare.Se trovo proteine ad alto peso molecolare, la causa è un danno glomerulare.Se ho una proteinuria mista (sia ad alto che a basso peso molecolare) posso avere o un danno sia tubulare che glomerulare o una proteinuria indifferente, spesso legata a un'emorragia delle vie urinarie.Algoritmo diagnostico:1. quantità o entità della proteinuria (quante proteine)2. qualità della ptroteinuria (alto o basso peso molecolare)

Microalbuminuria.È la presenza di albumina nelle urine al di sopra dei livelli normali, ma al di sotto dei limiti di detezione delle convenzionali strisce reattive (20 - 200 mg/L)Non è l'eliminazione con le urine di un'albumina minore del normale, ma l'emissione di piccole quantità di albumina, non di proteine. Se noi troviamo albumina nelle urine, vuol dire che il glomerulo ne fa passare di più: quindi c'è danno glomerulare, anche se modesto. Questo è molto importante nel monitoraggio di alcune patologie, come il diabete mellito.Il diabete è una malattia molto diffusa e temibile, per le complicanze ad essa associate, tra cui una delle più gravi è la nefropatia (il 50% di pazienti che fanno dialisi ci sono arrivati a seguito di complicanza diabetica). È quindi importante pe ril paziente diabetico un monitoraggio dello sviluppo del danno renale. È molto temibile soprattutto la glomerulopatia diabetica, il cui primo

segno è la comparsa di microalbuminuria. Quindi il monitoraggio della microalbuminuria mi dà una precisa indicazione dello sviluppo del danno glomerulare. Se ne misuro l'entità posso monitorare arresto o sviluppo di questa patologia.

Per un po' di tempo la microalbuminuria serviva anche a monitorare l'ipertensione arteriosa, non perchè dà un danno glomerulare, ma perchè l'aumento di permeabilità del glomerulo era considerato come modello di una disfunzione endoteliale globale, una delle caratteristche dell'ipertensione arteriosa essenziale.

NitritiIn condizioni normali non ci sono nitriti (forma ridotta), ma nitrati (forma ossidata). In presenza di flora batterica i nitrati sono ridotti a nitriti. Quindi, il fatto che li troviamo, ci suggerisce che nelle urine ci sono i batteri (ma magari sono lì per contaminazione).

Esterasi lucocitarieSono enzimi normalmente presenti nei granuli dei neutrofili. Se questi neutrofili si ritrovano nelle urine non sono nel loro ambiente adatto, quindi si rompono e io trovo esterasi elucocitarie. Se in un paziente trovo nitriti ed esterasi leucocitarie, ipotizzo che il paziente abbia un'infezione batterica delle vie urinarie. Ma se trovassi solo nitriti e non esterasi, la probabilità che sia una contaminazione sarebbe molto alta.

ESAME DEL SEDIMENTO URINARIOPermette di analizzare la parte corpuscolata delle urine, che dà molte informazioni. Fino a 1-2 ann fa, questo esame veniva fatto centrifugando le urine a bassa velocità -> si otteneva un corpuscolato che si analizzava al microscopio a fresco, senza fissarlo. L'esame che si fa adesso è fatto da strumenti che analizzano il contenuto corpuscolare senza centrifugarlo. Ci dà info su processi patologici che sono attraversati dal flusso del liquido urinario. Ci si puà trovare dentro di tutto, ma tipicamente:• Cellule di origine ematica soprattutto◦ Eritrociti -> sono piuttosto piccoli, il citoplasma omogeneo e non granulare. Possiamo trovare eritrociti intatti quando:▪ contaminazione, specie nelle femmine in età fertile, di sangue mestruale▪ fenomeni emorragici (cistite emorragica)▪ processi infiammatori glomerulari. Nella gomerulonefrite post streptococcica, il danno glomerulare è così grande che passano anche i globuli rossi che quindi troviamo anche nelle urine◦ Leucociti. Sono più grandi degli eritrociti. Il citoplasma è granuloso e in alcuni casi sembra di vedere il nucleo. Sono cellule piccole e omogenee Non importa se sono mononucleati o polimorfonucleati, perchè l'esame è fatto a fresco senza fissazione e colorazione e quindi non noto queste differenze. Li troviamo:▪ per contaminazione da parte di processi infiammatori dei genitali esterni. Una delle raccomandazioni da fare prima di fare l'esame delle urine è di lavare i genitali esterni.▪ Fenomeni infettivi infiammatori a carico delle vie urinarie• Cellule di origine urinaria , chiamate cellule di sfadamento delle vie urinarie, che si classificano in 3 gruppi:◦ Epiteliali renali. Sono le cellule che tappezzano il tubulo renale, hanno un nucleo grande con forma poligonale. Spesso hanno una sorta di orletto polarizzato (nel versante tubulare). A volte sono associate a formare dei gruppi. Sono indice di una patologia renale alta. Tutte le volte che le troviamo ci dobbiamo allarmare. Spesso è associata a pielonefriti (= malattia infiammatoria di reni e pelvi renale) o insufficienze ranali acute.◦ Cellule degli epiteli di transizione. Sono cellule grandi in cui si vede bene il nucleo centrale. Sono sferiche. Epitelio di transizione si ha nella vescica e nell'uretra. La presenza di queste cellule + leucociti sono sintomo di una cistite soprattutto.◦ Cellule delle basse vie urinarie. Sono molto frequenti nelle femmine e spesso associate a processi infiammatori. Cellule molto grandi e appiattite, presenti in agglomerati. Spesso rappresentano un vero e proprio tappeto. Non hanno un chiaro significato patologico di patologie delle vie urinarie.• Strutture sopracellulari • Muco • Cristalli . Si formano per precipitazione di elementi solitamente solubili. O perchè la loro concentrazione ha superato il limite di solubilità o perchè ci sono state variazioni nel liquido in cui si sono sciolti. E spesso precipitano insieme a molecole di acqua a cui sono attaccati. A ph acido (quale quello tipico delle urine) possiamo avere acido urico o ossalato di calcio. Con ph basico abbiamo soprattutto cristalli di fosfato. Ma questa è una regola generale con delle eccezioni: magari ho una fosfaturia molto imponente, magari non tanto per ph basico quanto per elevata concentrazione dei fosfati che, superando la concentrazione a cui sono solubili, diventa insolubile e precipita, formando dei cristalli.

● Acido urico● Cristalli molto frequenti sono quelli di ossalato di calcio (forma tetraedrica, ma non sempre).

Nello stesso campione, a seconda del grado di idratazione, la forma cambia.

● I cristalli di fosfato solitamente hanno forme più allungate che possono assumere un aspetto a rosetta o a croce. Quando trovo cristalli con struttura aghiforme, mi chiedo se lurina è acida. Se nn è acida devo ricordare che molti farmaci precipitano in questa forma.● Cristalli di fosfato triplo.● Cristalli di colesterolo. Nelle sindromi nefrosiche abbiamo ipercolesterolemia con perdita nelle urine di lipoproteine.● Cristalli di cisteina. La cistinuria è una delle condizioni da temere a livello di patologie delle vie urinarie perchè ad un ph leggermente acido la cistina precipita. La cistinuria è una malattia genetica legata alla scarsa funzionalità di un trasportatore degli amminoacidi. Questa precipita e forma cristalli. Quindi quando si trova bisogna sempre allarmarsi.• Batteri . Betteriuria è molto frequente, non perchè sono molto frequenti le infezioni delle vie urinarie, ma perchè la contaminazione è sempre molto frequente. Anche se oggi si usano contenitori sterili, spesso non sono sempre usati e si ha contaminazione. Bisogna sempre dubitare di batteriuria nei casi in cui io non vedo la presenza nelle urine anche di leucociti.

Dall'esame delle urine io capiscono solo se ci sono o no batteri e non quale tipologia di battere è quella che sto osservando.

• Cilindri. Nel tubulo renale abbiamo uno spazio in cui possono precipitare alcuni componenti e andare così a riempire lo spazio del tubulo. A monte il glomerulo filtra e quindi crea una pressione che spinge quello che si trova nel tubulo, che quindi verrà espulso con la forma cilindrica del tubulo (tipo la salsiccia: quando la pulisco la salsiccia che esce dalla pelle mantiene la forma cilindrica che aveva quando era dentro la pelle).

Possiamo avere cilindri granulosi che sono formati da prodotti di sfaldamento delle cellule epiteliali renali. Oppure possiamo avere cilindri fatti da cellule come eritrociti, leucociti, ecc... il meccanismo di formazione è sempre lo stesso. I cilindri di globuli rossi non possono essere frutto di contaminazione.

• Funghi e parassiti • Spermatozoi . Anche questo è un riscontro piuttosto frequente, specie nel soggetto che di recente ha avuto eiaculazione. Tuttavia, nonostante sia molto frequente e nella maggior parte dei casi fisiologico, devo appurare che non ci siano processi patologici a carico delle vescichette seminali; in questo caso, oltre agli spermatozoi, troverei anche altre cellule, tra cui i leucociti.Quindi bisogna sempre essere molto attenti a leggere l'esame delle urine.

DIAGNOSTICA DEL DIABETE MELLITOÈ una delle diagnostiche più difficili. Si basa sul riscontro in almeno 2 occasioni di una glicemia a digiuno uguale o superiore a 126 mg/ dl.

Insulina non è l'unico ormone che condiziona l'omeostasi glucidica. Esistono anche altri ormoni che la controllano (catecolammine, glucagone, cortisolo, gh). Il glucosio non è l'unica molecola e il metabolismo del glucosio non è l'unico metabolismo a cui dobbiamo fare riferimento. Dobbiamo considerare i metabolismi a livello di fegato, muscolo e tessuto adiposo. Il glucosio a livello plasmatico non deriva solo dall'alimentazione, ma anche da altri processi di generazione endogena attraverso gluconeogenesi, glicogeno lisi e glucolisi.

In genere si parla di diabete mellito nei pazienti in cui la glicemia a digiuno è maggiore di 126 mg/dl in 2 occasioni. È una definizione per convenzione che non tiene conto del fatto che il prelievo fatto a digiuno è fatto al mattino, quando i livelli di catecolammine, cortisolo e glucocorticoidi sono i livelli più alti di tutta la giornata.

Abbiamo varie classificazioni del diabete mellito:• magro, giovanile• insulinoresistente, dell'età adulta, grasso• secondario. Insorge per un'altra malattia, come il morbo di cushing (iperproduzione di cortisolo) o in un paziente in trattamento cons teroidi, in un paziente senza pancreas per carcinoma del pancreas• gestazionale. Non si capisce bene perchè insorge. Si sa che le donne che ce l'hanno sono donne che hanno un rischio più elevato a sviluppare forme di diabete mellito al di fuori della gravidanza.• IGT. Alterata tolleranza al glucosio e NON È il diabete mellito e si diagnostica in un modo diverso.

La glicemia dopo 24 h da carico orale assume valori tra 140 mg/dl e 200 mg/dl; in questo caso non è ancora diabete,ma aumenta il rischio di patologie cardiovascolari. Spesso questi risultati al test sono associati alla sindrome metabolica (nella quale, tra le altre cose, abbiamo insulino resistenza, ecc...).

Ci focalizziamo sulle prime 4 tipologielo si definisce quando la la glicemia a digiuno è maggiore di 126 mg/dl in 2 occasioni. L'emoglobina glicata non è per la diagnosi di diabete mellito.

La misurazione della glicemia è il punto cardine della diagnostica del diabete mellito. Ne esistono varie misurazioni:

• glicemia a digiuno• profilo glicemico giornaliero. Misurazione del glucosio nel sangue a varie ore nel corso della giornata. Può avere un'espressione di minima nella glicemia a digiuno o post prandiale, oppure di massima (che lo misura più spesso). Serve non a diagnosticare il diabete mellito• Curva da carico orale di glucosio. È un test perticolare che va a misurare la glicemia dopo la somministrazione di un importante carico di glucosio (75 g). Non serve a diagnosticare il diabete mellito• Glicosuria delle 24 ore. Se noi trovassimo nelle urine delle 24 ore, sappiamo che almeno in un momento della giornata il paziente ha avuto una glicemia maggiore di 180 g/dl• glicosuria frazionata.• Misurazione personale della glicemia. Ma non serve a fare la diagnosi di diabete mellito.

INSIEME alla misurazione della glicemia si associa la misurazione di insulina. Non serve per la diagnosi di diabete mellito. Infatti potrei trovarmi nella condizione in cui il paziente ha diabete mellito e ha 0 insulina circolante (diabete 1), oppure il paziente ha diabete, ma con insulina normale o aumentata (diabete 2). Questo esame serve a differenziare il diabete 1 da quello 2. Ma non basterebbe guardare solo l'età del soggetto? A volte non basta.

Al bambino che non cresce, prima di iniziare somministrazione di gh, fanno un esame di carico di glucosio. Facendo questa indagine ci si è accorti che l'insulinemia di questi pazienti era molto bassa, a volte addirittura indosabile. Ma il problema non era un problema di insulina. Questo perchè i dosaggi di insulina sono molto sensibili all'emolisi: basta che ci sia un pochino di emolisi e la quota di insulina si abbassa. L'insulina è formata da due catene tenute insieme da ponti disolfuro. Per misurare l'insulina si usano anticorpi monoclonali di due tipi, uno contro la catena a e uno contro la catena b e si valuta come insulina la molecola con entrambe le catene. Nell'eritrocita c'è un enzima che taglia i ponti disolfuro e se ho emolisi questo enzima si libera. Se il ponte il viene tagliato i metodi immunometrici non vedo più l'insulina come tale.

Ci sono pazienti che l'iperglicemia non ce l'hanno sempre (quindi se vado a misurargli la glicemia non è che è proprio alta), ma è in una condizione di prediabete o diabete chimico. Come si fa a diagnosticare allora? Allora provo a stressare bene i suoi meccanismi omeostatici andando a fare la curva sa carico orale di glucosio. In un individuo normale la glicemia aumenta -> esce insulina -> torna normale.Ma ci possono essere pazienti (verse) che dopo 30 minuti hanno 280 di glicemia. Poi scende, ma comunque la glicemia resta alta. I suoi meccanismi omeostatici nn sono in grado di gestire uno stress iperglicemico. I vecchi clinici lo consideravano una sorta di intorpidimento delle beta cellule pancreatiche: serve una glicemia molto alta perchè le beta cellule vadano a secretare insulina. E si facevano trattamenti con farmaci ipoglicemizzanti cheagivano sulle beta cellule stimolando la liberazione diinsulina (ora non si usano più).Oppure posso avere pazienti in cui la glicemia sale e poinon scende. Il motivo può essere un'insulinoresistenza cheviene sì gestita in condizioni standard, ma non sotto stress.Questo test si usa in tutte quelle condizioni in cui i normaliesami non vedo il diabete, ma il paziente o ce l'hacomunque, oppure lo svilupperà a breve.

Nel grafico le curve blu e verde indicano una ridottatolleranza a idrati di carbonio (IT) che non è diabete, maprecede spesso l'emergere del diabete.Spesso alla curva da carico orale si associa il dosaggiodell'insulina: a seguito dello stimolo glicemico dovrebbeesserci un'aumentata secrezione di insulina. Questo test siusa anche per calcolare insulinoresistenza: per misurareelevati livelli di insulina con valori glicemici nella norma ovicini alla norma.Questo test si usa anche per la diagnosi di condizioni diiperincrezione di insulina, causata da insulinomi otrattamenti che si associano a un'aumentata secrezione di insulina.Questo test serve per valutare il grado di compenso metabolico per quelle stuazioni in cui si ha un'aumentata secrezione di ormoni iperglicemizzanti.

C'è un uomo di 50 anni ricoverato per una stuazione psichica grave con manie di perscuzione, sdoppiamento della personalità. Viene chiesta la valutazione da parte di un internista, perchè il paziente presentava anche episodi ipertensivi particolari, perchè preceduti da un'aura (sensazione strana, sensazione di ovattamento generale), seguita da una puntata ipertensiva importante. Nel corso di queste crisi ipertensive il paziente impallidisce, suda (tipico di secrezione di catecolamine), inizia ad avere una specie di convulsione. La pressione è altissima nel corso della crisi. Tutto questo è tipico del feocromocitoma, un tumore neuroendocrino che produce catecolamine. Gli accertamenti per questa diagnosi vanno a dosare l'acido vedilmandelico (metabolita urinario delle

catecolamine) che risulta alto. Al tempo in cui si verifica il caso, era uso fare un retropneumoperitoneo con statigrafia, esame che non evidenzia nessuna formazione a livello del surrene (spesso questo tipo di tumore origina dalla midollare del surrene). Tuttavia il feocromocitoma può originare anche altrove. Si fa una lastra del torace e si vede una palla in corrispondenza della periferia laterale del lobo inferiore sinistro. Il chirurgo esporta il tumore. Portato in anatomia patologica il frammento è un insulinoma e non un feocromocitoma come ci si aspettava. Questo insulinoma faceva moltissima insulina e, quando la produceva, abbassava la glicemia a cui corrispondeva una risposta contro-insulare che portava all'espressione dei sintomi: pallore, sudorazione, aumento della secrezione di catecolamine ecc...Non si era arrivati a questa conclusione perchè non si aveva fatto un test della glicemia.Il paziente, alla rimozione dell'insulinoma, vede sparire anche le sue manifestazioni psichiche (che si avevano per riduzione dell'apporto di glucosio al cervello).

Nella valutazione della secrezione insulina, non si deve solo misurare l'insulina plasmatica. Ci sono infatti casi (come quando succede che ci sia emolisi nel corso del prelievo), dove l'insulina è distrutta. È quindi molto più attendibile il dosaggio del peptide C (pezzo che viene staccato dall'insulina al momento della sua secrezione). Ci serve per la differenziazione del diabete 1 dal 2.

Si usa il peptide c per vedere l'attività residua delle cellule beta del pancreas in caso di :• anticorpi anti -insulina (quindi non valuto l'insulina perchè è distrutta da questi anticorpi)• insulina endogena. Poichè non si distingue da quella esogena, non posso valutarla direttamente, ma tramite il peptide C.•Valutazione del profilo glicemico giornaliero: misura glicemia nel corso della giornata. Serve a valtare l'efficacia specifica del trattamento, ad esempio nel paziente diabetico a cui viene dato un regime da seguire con l'insulina. Con questo esame si vuole valutare se:• il compenso metabolico è sufficiente a brevissimo termine.• se la posologia dell'insulina è o meno adeguata. Per la valutazione di questo obiettivo un tempo si valutava la glicemia basale.

Vediamo i 3 pazienti del grafico. Paziente rosso: la glicemia varia da 120-150. Non raggiunge mai livelli molto bassi nè molto alti. Si potrebbe dire che in questo paziente la posologia di insulina è adeguata.In giallo e verde vediamo che la glicemia a digiuno è alta -> saremmo portati ad aumentare la quantità di insulina dasomministrare. Se facessimo così nel paziente verde, andrebbe bene. Ma se lo facessimo a quello giallo ci sarebbero dei problemi: dopo la somministrazione di insulina a digiuno abbiamo infatti un abbassamento della glicemia -> se li aumentiamo la quota di insulina da prendere a digiuno, lo mandiamo in coma ipoglicemico.

C'è poi l'emoglobina glicata (valori normali tra 5-6%). è chiamata anche Hb A1C. È una forma di emoglobina a cui si aggiunge glucosio tramite reazioni non enzimatiche. Questo test negli anni ha avuto uno sviluppo incredibile.Se noi mettiamo in una provetta hb e glucosio e lasciamo la provetta a incubare a 37°C per molto tempo, una parte di Hb verrà glicosilata. La dose è proporzionale alla concentrazione di glucosio e al tempo in cui l'Hb è stata esposta al glucosio. Questa informazione la spostiamo in vivo -> essendo l'Hb nei globuli rossi che hanno una vita di 120 gg, la misurazione di emoglobina glicata dovrebbe darci un'idea del grado di compenso metabolico in questo periodo.Questo è il motivo per cui l'emoglobina glicata trova la sua massima applicazione nella valutazione del compenso metabolico.Contributo della glicemia alla emoglobina glicata:

10 gg 50%11-20 gg 20 %21-60 gg 20 %61-120 gg 10 %

A seconda dei valori di emoglobina glicata si è cercato di ricavare dei valori di concentrazione plasmatica di glucosio, ma questi ragionamenti non hanno alcuna validità. Infatti la concentrazione plasmatica di glucosio ha delle variazioni enormi anche a parità di regime terapeutico.

Come viene glicata l'emoglobina, anche altre proteine sono glicate. Tra le varie proteine che possono essere glicate, c'è anche l'albumina (che un tempo si chiamava fruttosamina). Con il termine generale di Fruttosamina vengono indicate le chetoamine delle proteine plasmatiche (soprattutto albumina). Il turn-over delle proteine plasmatiche è in genere molto più rapido di quello della emoglobina (20 giorni per albumina). Il livello di fruttosamina è indicativo del controllo glicemico relativo alle 2-3 settimane precedenti il dosaggio.

L'emivita dell'albumina è di 20 gg. Quello detto per Hb glicata vale anche per albumina glicata, ma vale per un tempo molto più breve.Nel paziente possiamo valutare il compenso metabolico:• a brevissimo termine -> glicemia giornaliera• breve termine -> albumina glicata• medio-lungo termine -> Hb glicataQuesti 3 parametri non è detto che vadano nella stessa direzione (può avere tutti i valori normali tranne uno, ecc...).Paziente con Hb glicata normale, il resto molto alto-> paziente diabetico con buon compenso metabolico che però ha avuto febbre negli ultimi 5-6 gg. Oppure posso avere Hb glicata molto alta e con gli altri paramentri normali: il paziente in passato ha avuto qualcosa che ha scompensato il diabete.Sapere queste cose orienterà il nostro regime terapeutico: so se modificarlo (e poi tornare al regime normale) o no a seconda di qual è la causa che mi ha portato allo sballamento.

Nella valutazione di pazienti diabetici in trattamento che hanno fluttuazioni anche importanti della glicemia, abbiamo armi che ci danno informazioni molto precise sul compenso metabolico.Perchè devo controllare così bene il compenso metabolico?Perchè il buon compenso metabolico è inversamente proporzionale alla precocità e alla gravità delle complicanze emerse a seguito di diabete.

Nella diagnostica del diabete mellito si fa molta attenzione ai fattori genetici e immunologici.

conseguente alla distruzione delle beta cellule, che quindi in un primo momento verrebbe operata solo dal virus.Dopo un po', quando la massa delle beta cellule cala, non si ha comparsa subito di diabete. Questo si ha quando la massa delle beta cellule scende sotto un livello clinico. Questo processo di distruzione non è detto che sia progressivo con la stessa velocità, ma è un processo che va a gradini. Poi si arriva alla fase di diabete instabile.Gli anticorpi prodotti nel corso della reazione, possono essere dosati?

Nel grafico si vede il time course dello sviluppo di un diabete di tipo 1. Prima di avere una manifestazione clinica evidente, può avere una lunga storia nascosta. Si sostiene che tutto inizi da un fattore ambientale (infezione virale, molto probabilmente) che agisce su un paziente con una predisposizione genetica -> si ha distruzione delle beta cellule del pancreas che così non produce più insulina.Prima si sosteneva che la distruzione delle beta cellule del pancreas fosse mediata dagli anticorpi. Ma si ha anche la compresenza di attacco dai linfociti T. Si pensa che una parte della risposta immunitaria possa essere

Parliamo di 3 tipi di anticorpi:• anticorpi anti GAD• anti-IAA2 -> è una fosfatasi proteico trasme• anti insulina. Possono essere:◦ anti-insulina endogena◦ antiinsulina esogena. Oggi è difficile osservarla, ma fino a qualche anno fa, quando le insuline erano di derivazione porcina, questo si poteva osservare.

Nella figura si vede l'evoluzione verso il diabete manifesto in pazienti che sono positivi agli anticorpi nel tempo 0. Se i pazienti hanno tutti e 3 gli anticorpi positivi, la probabilità che sviluppino diabete è molto alta e lo sviluppano nel giro di 6-7 anni.Ma ci sono pazienti che anche se hanno gli anticorpi positivi, non sviluppano il diabete.Allora a che cosa servono questi anticorpi? Servono a dare un significato progrostico. La prognosi non è relativa a pazienti che già hanno il diabete, ma per quei pazienti che ancora non hanno il diabete. Il significato quindi è prosgnositico e preventivo. Inizia ad essere introdotto il dosaggio di un anticorpo contro lo zinco.Il diabete non si sviluppa mai nella maggioranza di persone positive per gli anticorpi. In altre persone solo molto tardivamente nella vita.

Nel grafico vediamo il rischio relativo di sviluppare cose in rapporto all'emoglobina glicata.L'emoglobina serve a valutare:

•il compenso metabolico•la prognosi dell'evoluzione del diabete

Diagnosi di diabete Glicemia a digiuno

Diagnosi di ridotta tolleranza ai nitrati di carbonio Curva da carico di glucosioGrado di compenso metabolico • Emoglobina glicata (a medio termine)

• albumina glicata (a breve termine)• glicemia puntuale o nel corso della giornata

(brevissimo termine)Prognosi per il rischio di complicanze • Emoglobina glicata

• anticorpi

DIAGNOSTICA DELL'EMOSTASISignora che deve sottoporsi a intervento di protesi d'anca. Dopo l'intervento la signora mostra fenomeni emorragici diffusi: rettorragie, emorragie digestive e i test risultano leggermenti alterati. Il tutto si risolve in modo improvviso con una diagnosi di emofilia che dà i primi segni a 65 anni??

ragazza in volo ha male alle gambe. Le viene poi diagnosticata embolia polmonare.

L'indagine viene fatta con vari tests su sangue intero che prendono in considerazione 4 processi:• emostasi primaria (piastrine)• emostasi secondaria (coagulazione)• sistemi di controllo della coagulazione

• fibrinolisi

Di solito si dice che i valori di riferimento per i numeri di piastrine sono 150-400 x 10^3/ mm^3. Ma questo non vuol dire che se uno ne ha 130.000 allora le sue piastrine non bastano, ma so solo che non hanno cvalori normale, ma possono anche non dare problemi: le devo guardare quando ho dei problemi che possono derivare da questo valore non nella norma. Valori di piastrine bassi, ma senza che ci sia alcuna sintomatologia, li tengo così.

La diminuzione del livello piastrinico si può avere per aplasia midollare, colonizzazione midollare, autoimmunità, ipersplenismo o C.I.D. Un aumento delle piastrine può essere dato da trimbocitopenie

A volte i numeri di piastrine sono giusti, ma bisogna vedere se quelle che ci sono funzionano bene. Una volta si usava il tempo di emorragia: tempo necessario affinchè una standardizzata incision della cute smetta di sanguinare. Il problema è che il taglio può essere più o meno profondo. Questo test misurava l'emostasi, ma non era standardizzabile.

Un altro metodo è Aggregometri piastrinica (metodo di Born) -> quando le piastrine di trovano in agitazione alla temperatura di 37°C, l'aggiunta di un agonista determina la formazione di aggregati piastrinici rendendo più limpida la soluzione. Un fotometro valuta nel tempo la riduzione della resistenza al passaggio della luce.

Adesso si fa PFA (platelet function Analisys). È un'analisi che simula la risposta piastrinica nel processo emostatco. Il sangue intero, immesso in una cartuccia viene aspirato da un capillare del diametro di 150 mm e passa attraverso una membrana ricoperta di collagene (o altre sostanze che stimolano la coagulazione). Le piastrine che aderiscono alla membrana riducono il flusso fino all'occlusione. Più il tempo per arrivare a questa occlusione è lungo, meno è efficiente la coagulazione.Il test si sviluppa in due livelli: un primo dove la membrana è fatta da collagene ed epinefrina. Nel caso in cui il test risulti normale, non procedo oltre. Se il test è alterato (= tempi di chiusura allungati), rifaccio il test utilizzando collagene e ADP. Se il test è ancora alterato, allora vado a cercare eventuali problemi, se invece è normale non mi preoccupo. Infatti una terapia con anticoagulanti come aspirina, vanno a ridurre anche i livelli di ADP presenti nelle piastrine che quindi vedono ridursi la loro capacità di aderire tra loro e contribuire alla formazione del coagulo.

Modificazioni piastriniche indotte dall'attivazione:• aumento del calcio citoplasmatico• modificazioni del ciroscheletro• cambiamento di forma• espressione delleUna volta che ho capito che c'è un difetto di funzionalità piastrinica, posso caire qual è? Sì, tramite un sistema citofluorimetrico. Mepacrina è un indicatore fluorescente che ha la caratteristica di localizzarsi nei granuli di secrezione. Devono averli in una situazione normale e devono diminuire molto con la coagulazione.

Lezione 20/4 sistemataPer attivare la coagulazione bisogna attivare la cascata coagulativa che può iniziare con la via intrinseca o estrinseca che poi si uniscono nella via comune. Questi percorsi metabolici in vivo non si verificano, in vivo si parte sempre dal fattore settimo. Queste vie sono vie che sono state artifialmente costruite dai laboratoristi.La cosa importante della cascata coagulativa è la sua organizzazione. I fattori della coagulazione sono in genere proteine con attività enzimatica quasi sempre proteasica. Ad esempio il fattore IX attivato che attiva il X, operando quindi una proteolisi limitata su un fattore inattivo (X) attivandolo (in Xa): Questo è uno schema abbastanza comune a molti fattori della coagulazione. Il processo finale della cascata coagulativa è dato dalla formazione di una rete di fibrina dal fibrinogeno. Il fibrinogeno è il substrato generale su cui si costruisce il coagulo.I fattori hanno origine epatica, una concentrazione plasmatica bassa ed emivita breve. Questo implica il fatto che nelle patologie da ridotta funzionalità epatica (ex insufficienza epatica grave) vengono sintetizzati meno fattori della coagulazione e quindi abbiamo un maggior rischio emorragico.Di tutti i fattori della coagulazione, il più abbondante nel plasma è il fibrinogeno (300 mg x dl). Ma il fibrinogeno di per sè non va ad aumentare il rischio trombotico, è solo il mattone, senza gli operai (fattori della coagulazione) il problema non sussuste.Esistono condizioni in vivo patologiche in cui il processo coagulativo è inopportuno:

• viene attivato in condizioni in cui non dovrebbe-> sindromi trombotiche.• non viene attivato o viene poco attivato -> sindromi emorragiche.Immaginiamo che quello riportato in questo schema della coagulazione sia realmente quello che accade e andiamo a valutare i vari casi.La via intrinseca si attiva grazie al fattore 12. Il fattore 12 si attiva con il contatto con superfici negative. Nel nostro organismo il collagene, ad esempio, ha una superficie negativa. Posso immaginare di verificare tramite dei test di laboratorio il funzionamento di questa via andando a mettere il sangue o il plasma su una superficie negativa. Guardo anche il tempo in cui si forma il coagulo: se è accorciato la via funziona troppo, se è allungato, funziona troppo poco.

Esistono delle criticità della fase pre-analitica per quanto riguarda i test della coagulazione:• Puntura venosa netta e minima stasi• Provetta in plastica o in vetro siliconato• Anticoagulante: sodio citrato• Rapporto anticoagulante:sangue 1:9• Centrifugazione ad elevata velocità per eliminare le piastrine• Conservazione del plasma fino ad un massimo di 4 ore a temperatura ambiente

La via estrinseca viene attivata dal tissue factor che va ad attivare il fattore 7. Per mimarla in vitro, andando così a valutare tramite test la coagulazione, metto nel plasma tromboplastina (trasforma la protrombina in trombina) e vedo come va.

In laboraorio esistono due test che misurano l'efficienza della cascata coagulativa: PT e aPTT.PT --> (tempo di protrombina) : Valutazione della formazione di un coagulo a partire da plasma a cui viene aggiunta tromboplastina tissutale. Valuta l’efficienza delle vie estrinseca e della via comune.aPTT (tempo di tromboplastina parziale attivata): Valutazione della fromazione di un coagulo a partire da plasma a cui viene aggiunta una “superficie” in grado di attivare il fattore XII. Valuta l’efficienza delle vie intrinseca e della via comune

Torniamo alla ragazza con embolia polmonare, a cui vengono eseguiti questi due test, che risultano nella norma. Vuol dire che il mimare in vitro queste vie non discrimina la paziente dagli individui normali; quindi in lei, in modo autonomo, non esiste un'esagerazione di queste vie.Faccio la stessa cosa all'anziana signora, per cui il PT è normale e aPTT è di molto allungato. Ipotizziamo ci sia un difetto nella via intrinseca fino al fattore 10 però, perchè la via comune è intatta (infatti se così non fosse avremmo anche un'alterazione di PT). Potrebbe avere un problema a calcio, fosfolipidi, fattore 12, 9 e 8. Il calcio e i fosfolipidi non sono, perchè servono anche nella via comune ed estrinseca e abbiamo visto che entrambe funzionano perchè PT è normale. Quindi sospettiamo una sindrome emorragica per deficit fattoriale (12, 9, 8 o 11).

Una delle patologie più frequenti da eccessiva coagulazione o emostasi è rappresentata dalle sindromi ischemiche coronariche o cerebrali. I pazienti che hanno avuto o una sindrome coronarica o un ictus usano farmaci particolari, antiaggreganti o anticoagulanti (ovvero farmaci che riducono efficienza della coagulazione, come i coumarilici, che interferiscono con la carbossilazione vitK dipendente). Questi farmaci vanno dosati bene, altrimenti si corre il rischio di un'emorragia.Per capire il dosaggio giusto vado a dosare in questi pazienti (anche a distanza di pochi giorni per tutta la vita) il PT, che va a valutare l'efficacia del trattamento anticoagulante. Essendo un test così diffuso e così necessario, può succedere che un paziente faccia questo test in una città e poi va a rifarlo in un'altra città (magari perchè è in vacanza) dove i range di normalità del PT sono diversi e l'esame stesso è diverso. Per evitare questo problema si va a valutare INR (International Normalised Ratio), che è un rapporto tra il PT del paziente e quello di un pool di individui con plasma normale: essendo un rapporto, non importa il metodo e i parametri usati. Negli individui normali INR =1, nei malati è maggiore.

Nel diagramma si mette in relazione il rischio relativo diemorragia per anno di trattamento a seconda del livello di INR.Con INR molto alto (6-7-8) il rischio di emorragia è 1:2,ovvero il 50% dei pazienti con questi valori rischiano di avereemorragia nel primo anno di trattamento. Se INR è basso, però,aumenta, per questi pazienti, il rischio di avere trombosi e nonemorragia. Quindi bisogna trovare un intervallo terapeutico incui il rischio è equiparato al beneficio. Il range va da 2 a 4,5: inquesto range si ha riduzione del rischio trombotico e rischioemorragico non altissimo.

Il PT può aumentare per vari motivi:• carenza o alterazioni delle fattori della via entrinseca e/o comune

• epatopatie croniche (nel fegato infatti vengono sintetizzati i fattori della coagulazione; se ho problemi al fegato, allora produrrò meno fattori della coagulazione e quindi avrò un maggiore rischio emorragico)• nella CID (perchè sono consumati i fattori della coagulazione• malattie autoimmuni -> perchè nel corso di malattia autoimmune possono essere fatti anticorpi contro i fattori della coagulazione.• Deficit di vitamina K• Terapia anticoagulante orale

Anche aPTT può essere aumentato per vari motivi:• Carenza o alterazioni di fattori della via intrinseca e/o comune• epatopatie croniche• deficit di vitamina K• CID• terapia eparinica

Torniamo alla signora anziana. Non vado a valutare la concentrazione dei fattori della coagulazione (quindi la quantità), ma quanto funzionano. Quindi devo avere a disposizione dei test che servano a misurare l'attività dei fattori della coagulazione.

Prendo il plasma e distruggo il fattore 8. Se faccio PTT risulta allungato. Se prendo il plasma di uno normale e lo aggiungo a questo plasma, il PTT torna normale, perchè ho fornito il fattore che mancava.Faccio il caso contrario vedi figura dopo. Prendo il plasma della signora (a cui ho detto che manca uno dei fattori) e lo aggiungo a un plasma a cui manca fattore 12: se la signora ha il fattore 12, il PTT è normale. Prendo un altro plasma a cui ho distrutto il fattore 11 (quindi il PTT è allungato) e aggiungo il plasma della signora: il PTT torna normale, quindi la signora ce l'ha. Lo faccio con tutti i fattori e con il fattore 8 vedo che il PTT resta allungato anche se aggiungo il plasma della signora: la signora ha una carenza/non funziona bene il fattore 8. Quindi ha un'emofilia, che però in 65 anni non è mai comparsa: questo lascia un po' sconcertati.

Il mix test (test di miscela) consiste nel miscelare il sanguedella signora con uno carente di un fattore, aspettandociche il PTT sia normale, perchè le carenze del sangue sianocompensate dai fattori del sangue della signora.Mix test è un test che viene fatto per differenziare lecarenze fattoriali da altre patologie. Se la signora avessedavvero un deficit del fattore 8 perchè le manca la proteina,con il mix test il PTT sarebbe normale e sempre uguale neltempo. Ma non è così con questa signora, dopo 2 ore ilPTT torna allungato.La signora ha un'artite reumatoide (è una cosa che si sa giàdall'inizio, ma che lui dice solo ora). La signora haun'emofilia acquisita, ovvero un deficit di funzionalità diun fattore della coagulazione, non per mancanza delfattore, ma perchè ha degli inibitori di un fattore dellacoagulazione, nel suo caso anticorpi contro il fattore 8. Seavesse un'emofilia da mancanza di fattore 8, si farebbe unaterapia sostitutiva, dando fattore 8: ma se lo facessimo allasignora, non cambierebbe nulla. Alla signora vengonoquindi dati degli immunosoppressori che vanno a ridurre laproduzione di anticorpi contro il fattore 8 -> PTT tornanormale.

Quindi, per la determinazione dell'assenza di un singolo fattore si impiegano plasmi carenti in cui il fattore da determinare è stato rimosso, mentre rimane inalterato il contenuto degli altri fattori. Viene successivamente eseguito un test PT i PTT a seconda del fattore; si valuta in quale misura (%) il plasma del campione in esame riesce a correggere l'attività del plasma carente del farmaco

ricercato. Si valuta il risultato nei confronti di una curva ottenuta con varie diluizioni del plasma standard addizionato con plasma carente.

Il processo coagulativo è fondamentale per la sopravvivenza dell'individuo ed è importante che sia molto molto preciso e per questo esistono dei sistemi di controllo. Un esempio sono antitrombina e proteina C e S.

L’Anti trombina (AT) è il più importante inibitore della coagulazione. Essa agisce sul FII (trombina), sul FX e in minor misura sul FIX, FXI e FXII. La sua azione è notevolmente potenziata dall’ eparina. L’AT è secreta dal fegato ed escreta coi reni. L’emivita è di circa 60 ore. Rispetto agli altri anticoagulanti naturali è quello che porta al maggior rischio tromboembolico (4 volte rispetto alla R-PCA, 3 rispetto alla PS, 2 rispetto alla PC). Ambito di riferimento 75-125 %.I pazienti che hanno elevati livelli di antitrombina, sono pazienti con tendenza alle emorragie, ma i casi di iperantitrombinemia sono molto rari. Sono più comuni i casi in cui manca o si ha carenza di antitrombina, fatto che porta alla mancanza di un controllo negativo della coagulazione, quindi una maggior tendenza alla trombosi.Le carenze di antitrombina possono essere date da difetti congeniti:• Difetti congeniti◦ Tipo I: Livelli antigenici e funzionali ridotti◦ Tipo II: Presenza di livelli plasmatici normali, ma incapacità a neutralizzare la Trombina o di legare l’eparina• Difetti acquisiti

• Uso di contraccettivi orali• Gravidanza• Epatopatie (cirrosi,neoplasie)• CID e Ustioni e Shock settico (consumo AT)• Interventi chirurgici (consumo)• Sindrome nefrosica (perdita)• Gastroenterite acuta (perdita)• Chemioterapia (consumo)• Neoplasie e Leucemie (consumo)Il prendere la pillola anticoncezionale con questo problema, aumenta la probabilità di avere trombosi. Ma la ragazza non ha questo problema, perchè non prende la pillola.

Proteina C, è Proteasi vitamina K dipendente, è sintetizzata nel fegato ed escreta nei reni. L’emivita è di circa 7 ore. I difetti genetici di carenza totale sono incompatibili con la vita. Le carenze congenite parziali possono portare a fenomeni di tromboembolia più frequentemente venosa che arteriosa. Particolarmente critica è la necrosi cutanea da “Cumarinici” che può insorgere come complicanza nella fase iniziale della TAO Ambito di riferimento 70-140%.Le carenze possono essere date da:Difetti congeniti

• Tipo I: Livelli antigenici e funzionali ridotti• Tipo II: Presenza di livelli plasmatici normali ma riduzione della funzionalità Difetti acquisiti:• Epatopatie (cirrosi,neoplasie)• CID• Decorso postoperatorio

• Patologie con danno endoteliale (liberazione di trombomodulina)• Leucemia• Ischemia• Artrite reumatoide• TAO = terapia da anticoagulante orale

La Proteina S è un cofattore della PC ed è vitamina K dipendente.Il 35% circola in forma libera. Questa frazione è quella che agisce come cofattore della PC. Il restante 65% circola legata in modo reversibile alla proteina C4bBP appartenente al sistema del complemento.La Proteina S è sintetizzata dal fegato, dalle piastrine e dalle cellule endoteliali ed è escreta dai reni.Ambito di riferimento 70-123%.Carenze congenite (5 – 8%)• Tipo I: Livelli antigenici e funzionali ridotti• Tipo II: Livelli antigenici normali ma riduzione della funzionalità (rari)• Tipo III: Livelli antigenici normali di PS totale ma ridotti di PS libera e ridotta attività funzionale Carenze acquisite• Epatopatie acute e croniche• TAO

• Gravidanza -> funzionale per ridurre l'emorragia del parto• Estroprogestinici• CID• Interventi chirurgici• Stati infiammatori

Il sistema della proteina C e S funziona così: la trombomodulina (che è un recettore sulle cellule endoteliali) ha 2 siti di legame, uno per la proteina C inattiva e uno per la trombina (non protrombina). Su questo recettore proteina C e trombina vengono in contatto tutte le volte che si forma trombina, ovvero tutte le volte che il sistema coagulativo è attivato. La trombina è una proteasi che taglia un pezzo della proteina C attivandola - > va in circolo -> si unisce alla proteina S e insieme vanno a tagliare il fattore 5 ATTIVATO (proteina C ed S sono proteasi). Non taglia il fattore 5 inattivo. Quindi questo sistema:• si ha solo e soltanto quando si ha attivazione della coagulazione• limita l'efficacia della coagulazione tagliando il fattore 5 attivatoQuesto è uno dei sistemi coinvolti nella genesi delle sindromi trombotiche, magari perchè ci sono dei deficit di proteina C ed S. Per questo di queste due proteine si dosa sia la funzionalità che la concentrazione, al contrario di quello che abbiamo fatto per i fattori, dove al dosaggio della quantità abbiamo preferito una verifica della funzionalità (anche perchè dosare la quantità richiede l'utilizzo di un test ELISA, molto costoso rispetto a quello che valuta la funzionalità).

Ma può anche esserci il caso in cui livelli e funzionalità di proteina C ed S sono normali, ma c'è la resistenza alla proteina C attivata: la proteina C c'è, è attivata, ma per qualche motivo c'è una resistenza. Questa condizione è associata a un maggior rischio di trombosi. È una condizione piuttosto frequente ed molto comune nelle trombosi nei giovani: è APC Resistance.È un disordine associato ad un maggior rischio di trombosi. La resistenza alla Proteina C attivata è un elemento molto comune tra i soggetti sani europei, circa il 5%, ed è responsabile di circa il 50% delle trombosi venose di tipo eredofamiliare.L’analisi genetica ha mostrato che in moltissimi casi L’APC-R viene spiegata con una mutazione puntiforme del gene per il fattore 5^ non nei siti catalitici di funzionamento (infatti funziona bene), ma nei siti in cui viene tagliato dalla proteina C -> il sistema della proteina C ed S è normalmente attivato, ma la proteasi non riconosce nulla di ciò che deve tagliare -> la conseguenza è trombosi.I test coagulativi in questi individui sono normali. Esistono dei test precisi per valutare questa mutazione, in particolare test genetici non solo nel paziente, ma anche nei consanguinei.Nei pazienti eterozigoti, il rischio di eventi trombotici è del 25% maggiore dei soggetti normali, nei soggetti omozigoti del 100%.

La fibrinolisi è un processo che porta alla lisi del coagulo di fibrina. Un'eccessiva fibrinolisi porta a un rischio emorragico, una ridotta fibrinolisi porta a rischio trombotico.Ho un coagulo, che deve essere rimosso da una proteasi, la plasmina. La plasmina non ha specificità di substrato e quindi taglia tutto quello che incontra. Come si fa a dargli una specificità di substrato? La si genera là dove c'è bisogno. Infatti in circolo non c'è, sia perchè l'emivita della plasmina è di 0,1 secondi, sia perchè viene prodotta solo qui, nel punto in cui ce n'è bisogno.La plasmina si forma dal plasminogeno, grazie al taglio operato da TPA (attivatore tissutale del plasminogeno), prodotto dalle cellule endoteliali in corrispondenza del coagulo.Esistono dei sistemi di controllo su questo fenomeno:• inibitore della plasmina, antiplasmina circolante. Impedisce che tagli in circolo e quindi dia danni in cicolo.• Ibitore dell'attivatore del plasminogeno.Come possiamo misurare l'efficienza di questo sistema? Si potrebbe pensare, misurando i livelli di TPA, ma non sono usati, perchè non danno informazioni sulla funzionalità.Non possiamo misurare la plasmina, perchè ha un'emivita molto breve. Possiamo misurare il plasminogeno, ma ci importa poco, perchè è un precursore, non sappiamo se poi viene convertito nella proteina attivaPossiamo andare a misurare il dimero D.Il fibrinogeno è fatto da 2 subunità D e una E tenute insieme. Quando il fibrinogeno è tagliato, si possono formare la subinità D, DE o E.La fibrina è fatta da tutta una serie di fibrinogeni, e viene poi tagliata in frammenti piccoli dalla plasmina. Tagliata in certi punti va a liberare il dimero D (D-D). Quando lo troviamo in circolo ha origine SOLO dalla fibrina e da nient'altro.A cosa ci importa? Tutte le volte che si attiva la fibrinolisi, si ha taglio dellafibrina e quando questo avviene si vengono a generare dei dimeri D e quindi si osserva un aumento del dimero circolante. Prendiamo il caso della ragazza, che ha avuto embolia polmonare. Ipotizziamo che questo embolo abbia avuto origine da un trombo o da un coagulo. Ma affinchè si abbia un embolo, questo coagulo deve essere tagliato o degradato. Se questo avviene per fibrinolisi, ci aspettiamo un aumento dei livelli di D-dimero. Per essere quindi sicuro della mia diagnosi devo andare a dosare il dimero D.

Se ho valori alti di D-dimero, ho valori che suggeriscono embolia polmonare: infatti, nella seconda colonna del grafico vedo che i pazienti che hanno embolia polmonare hanno valori aumentati di dimero D. Devo però ricordare che il D-dimero non misura nello specifico l'embolia, ma la fibrinolisi. Infatti, pazienti che hanno trombosi venosa senza avere embolia polmonare, hanno gli stessi valori di D-dimero di chi ha embolia. Stessa cosa se guardo pazienti con CID.Quindi questo dosaggio del dimero D mi misura la fibrinolisi: se è aumentato = c'è una fibrinolisi = il paziente ha ALMENO un coagulo. Quindi il D-dimero misura la fibrinolisi di uno o più coaguli presenti in quel momento.Quindi il D-dimero mi serve per fare diagnosi differenziale: ho un paziente che ha sintomi dell'embolia polmonare, ma ha il D-dimero normale, quindi non ha embolia. Questo test è

importante per il suo potere predittivo negativo: la sua importanza non è tanto legata a quando mi esce positivo, quanto quando mi esce negativo, perchè mi va ad escludere tutta una serie di patologie.

Ci sono anche gli anticorpi anti-fosfolipidi. Sono autoanticorpi molto eterogenei tra loro diretti contro i fosfolipidi che intervengono nel sistema della coagulazione (il loro bersaglio è il complesso proteina- fosfolipide). Gli anticorpi anti-fosfolipifi nella loro forma ossidata, da soli o in presenza di diverse proteine, che funzionano come cofattori.Questi anticorpi in vivo sono associati a fenomeni trombotici, mentre in vitro provocano allungamento del tempo di coagulazione!La loro presenza determina uno degli stati di trombofilia acquisita più frequenti (2-3%), inibiscono il sistema di controllo della coagulazione PCa-PS, la protrombina e quindi agiscono in senso trombotico, interferiscono con il rilascio di prostacicline, con il sistema fibrinolitico e con la liberazione dei fattori tissutali.Caratteristiche in vitro degli anticorpi anti-fosfolipidi:• Si legano ai fosfolipidi impedendo la formazione del complesso FXa-FVa-Ca++-fosfolipide.• Questo determina un allungamento di PT e di aPTT

In vivo sequestrano in vivo i fosfolipidi alla proteina C che quindi non può più funzionare -> la coagulazione non è più inibita -> maggior rischio trombotico.Lezione 28/4

ESAME EMOCROMOCITOMETRICO E L'IDENTIFICAZIONE CELLULARE= emocromo. È l'esame più frequentemente richiesto (1000 al giorno!!). Questo esame va a caratterizzare le popolazioni di cellule del sangue.

Emocromo= Indagine condotta su campione di sangue intero, reso incoagulabile mediante aggiunta di K3EDTA (uno degli errori più comuni è la presenza di coaguli nella provetta, fatto che rende sfalsati i risultati degli esami) e volto a caratterizzare qualitativamente e quantitativamente le diverse popolazioni cellulari della parte corpuscolata del sangue stesso.Vengono essenzialmente prese in considerazioni 3 differenti popolazioni cellulari (sia dal punto di vista qualitativo che quantitativo):• Eritrociti ed altri elementi della serie rossa• Leucociti ed elementi immaturi della serie bianca• PiastrineMa in realtà è un esame molto più ricco.Ci sono vari parametri che possono essere valutati con l'emocromo.Parametri irrinunciabili:• Gli 8 parametri classici (WBC, RBC, PLT, Hb, HcT, MCV, MCH, MCHC)• Le cinque popolazioni leucocitarie (PMN neutrofili, PMN eosinofili, PMN basofili, linfociti, monociti)• Il numero assoluto di reticolocitiParametri addizionali:• Caratteristiche chimico-fisiche dei singoli elementi• Analisi morfologica mediante esame microscopico

Nella tabella sono riportati i valori di riferimento per i vari parametri. Vediamoli uno per uno:EMOGLOBINAEsprime la quantità (espressa in grammi) di Hb presente in un decilitro di sangue. Valori bassi di emoglobina sono indici di anemia, la cui causa più frequente è il deficit di ferro (carenza marziale).Valori di riferimento: ♀: 12-16 g/dL♂: 13-17 g/dL

ERITROCITII globuli rossi sono cellule del sangue adibite al trasporto dell'ossigeno dai polmoni verso i tessuti e di una parte dell'anidride carbonica dai tessuti ai polmoni.Costituiscono gran parte della componente corpuscolare del sangue (circa 4 milioni per mm 3).Eritrociti sono cellule del sangue adibite al trasporto di ossigeno. Sono presenti in grandissima concentrazione nel sangue (circa 4-5 milioni per mm^3). Questa concentrazione è 3 ordine di grandezza maggiore dei leucociti (4-5 mila per mm^3).

Si parla di ANEMIA quando si ha una riduzione della concentrazione di emoglobina e non necessariamente della concentrazione di globuli rossi. Possiamo infatti trovarci davanti a un aumento di globuli rossi in anemia (è il caso della anemie beta talassemiche). Quindi, per fare diagnosi di anemia, il parametro a cui fare riferimento è la concentrazione di emoglobina. Talassemia = problemi nella formazione della subunità beta dell'emoglobina -> questo comporta a ipossia che stimola la produzione di globuli rossi che però saranno comunque difettosi.

In questa tabella ci sono i valori di riferimento di Hb e globuli rossi in rapporto alle età della vita. La concentrazione di Hb nei neonati è nettamente superiore a quella che si osserva già nei bambini da 1 a 6 anni. Questo ha delle conseguenze: sia non

dobbiamo spaventarci quando troviamo in un neonatoalti valori di emoglobina, sia dobbiamo allarmarciquando in un neonato troviamo valori di emoglobinaconsiderati normale in un adulto (13, ad esempio).

Cause di anemia:• Anemie da ridotta produzione

◦ da alterata proliferazione delle cellulestaminali

◦ da alterazioni del comportamento dellecellule proliferanti

• Anemie da perdita di sangue• Anemie da aumentata distruzione

◦ da difetto intrinseco◦ da difetto estrinseco

Ho un paziente che perde tantissimo sangue per un incidente. Appena avvenuto l'incidente faccio un emocromo e vedo che è normale. Questo perchè la concentrazione totale non è stata aletrata: infatti, se si perde del sangue, si va a perdere sia la parte solida che quella liquida: quindi le proporzioni di sangue restano inalterate, è la quantità in assoluto che varia.Quando invece passa un po' di tempo e l'organismo, in seguito all'emorragia, va ad attuare dei meccanismi di compenso per ovviare alla riduzione di volume, vediamo un aumento, ad esempio, della retenzione idrica: questo comporta, quindi, un aumento della componente liquida del sangue rispetto a quella solida e perciò una riduzione della concentrazione dell'emoglobina (la quantità resta uguale, è il volume in cui è diluita che aumenta) -> dall'emocromo risulta anemia.

Le anemie possono essere date da: carenza di vitamina B12, emorragia, carenza di ferro, malattie autoimmuni (in questo caso abbiamo anemia da aumentata distruzione di globuli rossi che vengono riconosciuti dal sistema immunitario, erroneamente, come non self).

Il difetto può essere intrinseco ( il porblema è del globulo rosso) o estrinseco (il problema è estraneo al globulo rosso).

EMATOCRITOEsprime la percentuale del volume del sangue che è occupato dai GR (anche se in generale si deve parlare di cellule, ma poichè la maggior parte elle cellule del sangue sono globuli rossi, diciamo globuli rossi).La metà del volume di sangue dopo centrifugazione è occupato da cellule, eritrociti per la maggior parte: perciò l'emaocrito è intorno al 50% -> Valori di riferimento: ♀: 37-48% ♂: 42-52%

Ematrocrito si riduce per ridotta concentrazione di gr (spesso associata ad anemie), ma non sempre. Di solito varia non in rapporto alla variazione della componente cellulare del sangue, ma di quella liquida del sangue. Ad esempio, in tutti i casi di disidratazione, avremo aumento dell'ematocrito, in iperidratazione l'ematocrito diminuisce. Quindi non è che si ha perdita della parte cellulare, solo che questa viene più o meno diluita andando a rappresentare, a seconda delle situazioni, una percentuale diversa della quantità presente nel sangue.

MCV = volume corpuscolare medio (somma dei volumi/ numero di globuli rossi)È un parametro che misura in modo approssimativo il volume medio di un eritrocita. I valori di riferimento sono tra 82-98 fL (fentolitri). Possiamo avere condizioni associate a un aumento di MCV e a una riduzione.Aumento: deficit di vitamina B12 e folati (abbiamo una macrocitosi)Riduzione: in tutte le anemie da carenze di ferro (possiamo arrivare a 75 fL), o nel caso di anemie beta talassemiche. Come faccio a capire se la riduzione è data da un tipo di anemia o dall'altro? Guardo MCHC (vedi dopo).MCV ci permette di orientarci fin da subito nella diagnosi di anemia. Se infatti trovo un'anemia con MCV aumentato, non penso che sia da carenza di ferro e quindi non vado a dosare ferro, transferrina, ferritina -> così evito di fare esami che non servono e spendere soldi inutili.

Rallentamento sintesi di Hb = meno emoglobina a maturazione finita =anemia microciticaRallentamento differenziazione (carenza di acido folico e vitamina B12 ) = blocco maturazione del proeritroblasta in normoblasta = anemia megaloblastica

Aumento (Macrocitosi) Diminuzione (Microcitosi)___________________________________________Deficit di B12Deficit di folatiInsensibilità a B12 e folatiEpatopatie croniche

Carenza di ferroRidotta utilizzazione di FeEmoglobinopatieCarenze proteiche

anisocitosi -> globuli rossi di vari volumipoichilocitosi -> alterazione della forma dei globuli rossi.

Anemie macrocitiche (più di 100 fL)da intensa attività eritropoieticada deficit endocrini e metabolicida carenza B12 e folati

Nelle anemia macrocitiche il problema è il difetto nella maturazione dei precursori eritroidi, che sono più grossi dei globuli rossi normali perchè dotati di nucleo.Anemie normociticheAnemie microcitiche (meno di 85 fL)

da deficit di ferroda deficit dell’utilizzazione di ferroda anomalie della sintesi emoglobinica

MCHÈ il contenuto medio di emoglobina (non concentrazione, ma quantità) in ogni globulo rosso. I valori normali sono tra 27- 32 pg (picogrammi) di emoglobina per ogni singolo eritrocita.

MCHCÈ la concentrazione emoglobinica corpuscolare media all'interno del singolo globulo rosso. Essendo una concentrazione è espressa in g/ dl di globuli rossi e non in dl di sangue! I valori normali sono tra 32 e 36.MCHC = : anemia normocromicaMCHC ↓: anemia ipocromica

Il sangue ha una componente liquida e una cellulare. Quella cellulare la supponiamo fatta solo di eritrociti, perchè sono la componente cellulare a maggior rappresentanza. MHC ci dice quanta emoglobina c'è per globulo rosso, MCHC ci dice la concentrazione media di emoglobina per dl di globuli rossi impaccati.La concentrazione di emoglobina normale è (approssimiamo) 15 nel sangue intero (ricordiamoci che concentrazione = quantità/ volume). L'ematocrito è il 50%. Quindi, la concentrazione media di emoglobina per dl di globuli rossi, è circa doppia, ovvero 30 dl, perchè il volume che io sto considerando è solo il 50% del volume totale del sangue che prima utilizzavo come volume di riferimento per ottenere la concentrazione di emoglobina).

In un eritrocita che è di 60 fL (molto piccolo, quindi con MCV ridotto) il contenuto di emoglobina è ridotto (MCH è ridotto), ma non è detto che sia ridotta anche MCHC. Se la riduzione di MCV è associata anche a una diminuzione del numero degli eritrociti (cosa che succede nelle anemie da carenza di ferro), MCHC è ridotto (ci sono meno globuli rossi e più piccoli, perciò effettivamente si ha una carenza nella concentrazione di emoglobina). Ma nel caso in cui avessimo globuli rossi piccoli, ma in grande quantità, avremmo MCHC normale (perchè la riduzione di quantità di emoglobina per ogni singolo globulo rosso viene compensata dall'aumento nel numero -> quindi la quantità di emoglobina è la stessa, solo distribuita in un numero maggiore di globuli rossi).

Carenza di ferro: osserviamo microcitosi (MCV ridotto), meno globuli rossi (MCH ridotto) e MCHC ridotto.Sindrome beta talassemica: emoglobina ridotta, globuli rossi più piccoli (MCV ridotto), ma in maggior quantità -> MCH ridotto, MCHC normale.

VARIANTI EMOGLOBINICHEEsistono diverse forme di emoglobina. Nel mondo ne sono state descritte circa 1500. Per individuarle esistono delle metodiche (cromatografiche o elettroforetiche, di solito).

Altro parametro è RDW (Red cells Dispersion Width): l'ampiezza della distribuzione del volume dei GR attorno al suo valore medio (fL). È un parametro addizionale. Quando si fa emocromo si ha un grafico che dà una distribuzione del volume eritrocitario. MCV infatti è un valore medio, con RDW, invece, vado a vedere come si distribuisce il valore per avere quella data media che MCV esprime.

RDW indica il coefficiente di variazione dei volumi eritrocitari. I valori normali sono tra 11 e 15% Un valore superiore al 15% è indice di anisocitosi (aumento di variabilità delle dimensioni

eritrocitarie per la presenza nel sangue periferico di emazie di diverso volume: normociti, microciti e macrociti) presente in quasi tutte le anemie.

Ho un paziente a cui viene trovato RDW aumentato, per via di una variante emoglobinica che questo paziente possiede. Dopo qualche anno vado nuovamente a valutare RDW e mi aspetto che sia sempre aumentato (infatti la variante emoglobinica è sempre la stessa). Tuttavia vedo RDW nella norma. Com'è possibile? Il paziente ha subito una trasfusione di recente da un individuo con emoglobina normale, che ha spostato il suo RDW da quello che normalmente era. Se andassi a rifare RDW a distanza di un po' di tempo, lo troverei ancora aumentato, come ènormale che accada per questo paziente.

MATURAZIONE DELLA SERIEERITROCITARIA

Il globulo rosso circolante ha come precursore l'eritroblasto, che contiene sia nucleo che RNA. Dopo di lui ci sono i reticolociti ( che si chiamano così perchè con una colorazione particolare sembravano avere un reticolo che poi si è scoperto essere RNA) -> sono eritrociti che hanno perso il nucleo, ma non ancora RNA.Nel sangue periferico non ci sono eritroblasti, ma qualche reticolocita. Per

valutarli ci sono vari metodi che permettono di differenziare i reticolociti in 3 popolazione: alta, media e bassa fluorescenza (a seconda della conentrazione di RNA).

LFR (Low Fluorescence Ratio) -> Rappresenta la frazione di Reticolociti maturi. Valori normali: 78% - 92%MFR (Medium Fluorescence Ratio) -> Rappresenta la frazione di Reticolociti con caratteristiche maturative intermedie. Valori normali: 6% - 18%HFR (High Fluorescence Ratio)-> Rappresenta la frazione di reticolociti immaturi. Valori normali: 0% - 4% IRF (Immature Reticulocite Fraction) -> Rappresentata da MFR+HFR

La misurazione della concentrazione dei reticolociti è importante (vanno dallo 05,% al 1,5% dei globuli rossi). Noi possiamo ipotizzare di trovare una concentrazione aumentata di reticolociti nel sangue di un paziente che ha un midollo che sta lavorando molto (tutte le volte che c'è un'anemia, ad esempio, che il midollo è stimolato a produrre più globuli rossi). Le concentrazioni ce le aspettiamo basse nelle condizioni in cui il midollo sta lavando meno.Ho un paziente anemico (poca emoglobina). Vado a dosare i reticolociti. Se sono aumentati, significa che il midollo sta rispondendo molto alla carenza di globuli rossi e quindi la causa di anemia non è una ridotta produzione, ma un'aumentata distruzione. Se invece ho anemia con reticolociti ridotti o normali, significa che il midollo non sta rispondendo alla riduzione di emoglobina e quindi sospetto che l'anemia sia data dalla ridotta produzione di globuli rossi.Quindi il dosaggio dei reticolociti è molto importante quando ho un'anemia, per fare la diagnosi differenziale.

Aumento-Condiz. Fisiologiche-Anemie da perdita-Anemie emolitiche-Farmaci (B12, folati)-Terapia con ferro

Diminuzione-Aplasie midollari-Leucemie-Anemie megaloblastiche-Malattie mieloproliferative

Ci sono delle forme particolari di eritrociti.• Sferociti microcitici -> globuli rossi piccoli e tondeggianti senza la tipica concavità• Macrociti -> globuli rossi di dimensioni elevate• Drepanociti -> globuli rossi a flace (anemia falciforme)• Elissociti -> globuli rossi a forma ellittica

Nell'anemia con crisi emolitiche importanti, il midollo è portato a uno stress eccessivo che lo porta a buttare fuori anche eritroblasti, che perciò possono essere reperiti in circolo (cosa non normale). Gli eritroblasti, all'esame istologico, hanno lo stesso aspetto dei reticolociti, con la differenza che loro hanno il nucleo.

PIASTRINESono prive di nucleo poiché derivano dai frammenti citoplasmatici del megacariocita, cellula emopoietica per le piastrine, ma possiedono granuli e molti organelli citoplasmatici e RNA. Si presentano di forma tondeggiante o ovale di circa 2-4µm. MPV (Mean platelet volume): il volume medio delle piastrine (fL), un parametro addizionale che è possibile valutare con l'emocromo. Valori di riferimento: 9,9-15,7 fL. Si è visto che averlo molto alto è associato a una maggior tendenza alla trombosi (ma è solo uno studio).PDW (Platelet Dispersion Width): l'ampiezza della distribuzione del volume delle piastrine attorno al suo valore medio (fL)

Aumento Diminuzione________________________________________________________________________________-Trombicitemie assenziale -Aplasia midollare-Infiammazioni acute -Colonizzazione midollare-Neoplasie midollari -Autoimmunità-Splenectomia -Ipersplenismo

-C.I.D.

LEUCOCITINel sangue i leucociti sono tra 4.000 e 10.000 per mm3; la durata della loro vita varia da poche ore per i granulociti a mesi per i monociti ad anni per alcuni tipi di linfociti.sono divisi in 5 grosse categorie:• granulociti /polimorfonucleati neutrofili• granulociti /polimorfonucleati eosinofili• granulociti /polimorfonucleati basofili• linfociti• monociti

Per formula leucocitaria o emogramma si intende la determinazione percentuale dei vari tipi cellulari di leucociti presenti nello striscio di sangue periferico.La formula leucocitaria normale è:

In età infantile si ha inversione della formula leucocitaria: si ha un numero di linfociti superiore al numero di granulociti neutrofili.La percentuale che c'è, è rispetto al numero assoluto di leucociti.

In condizioni patologiche i rapporti numerici tra i vari tipi di leucociti possono variare:• se aumentano i neutrofili l'infezione è di natura batterica• se aumentano i linfociti è tendenzialmente di origine virale• se aumentano i monociti probabile mononucleosi• se aumentano gli eosinofili si può pensare o ad una allergia o ad una infestazione da parassiti• se aumentano i basofili si può pensare ad una malattia del sangue (leucemia mieloide cronica)

Quando i globuli bianchi raggiungono picchi altissimi (da 30 mila a centinaia di migliaia) si possono avere le leucemie.Un calo di leucociti si può trovare in quadri di infezione molto gravi, sintomatici di stati di esaurimento del sistema di difesa, di danni al midollo osseo (ad esempio a causa di medicine, radioterapia o sostanze chimiche), in molte infezioni da virus e in alcune malattie del sistema sanguigno.

Basofili: granuli grossi di blu molto intenso o nero. Svolgono funzione analoga a quella dei mastociti (principale differenza tra idue tipi cellulari è la localizzazione: i mastociti sono infatti cellule residenti nei tessuti connettivi propriamente detti, soprattutto connettivi lassi). In seguito a stimolazione, che può essere sia aspecifica che specifica (mediata dal riconoscimento di specifici antigeni, soprattutto IgE) - è più frequente quest'ultimo caso - vanno incontro ad una degranulazione massiva con liberazione di istamina, che determina vasodilatazione e un aumento della permeabilità vasale.Un aumento di granulociti basofili può essere causato da malattie autoimmuni o dalla malattia di Hodgkin.

La mononucleosi infettiva (detta comunemente malattia del bacio) è una malattia causata dal virus di Epstein-Barr (EBV). Ha un periodo di incubazione che va dalle quattro alle otto settimane. Si manifesta, in alcuni casi, con lo stato febbrile (febbre) (90%), comparsa di linfonodi palpabili sul collo, sulla nuca e sulle ascelle (90%), stanchezza, astenia (70%), in alcuni casi si avverte un ingrossamento della milza (30-40%), del fegato (15% ancora più frequente l'aumento delle transaminasi), mal di gola intenso accompagnato da alterazione delle tonsille (75%), che possono presentare placche e ricoprirsi di un essudato di colore biancastro. L'80-90% della popolazione adulta dei paesi occidentali dimostra di aver avuto in passato una infezione da EBV (Virus di Epstein-Barr), l'agente più frequente della mononucleosi.

Monociti: nei monociti all'interno ci sono dei vacuoli. Sono molto grandi.NEUTROFILIAumento Diminuzione_________________________________________________________________________________________Infezioni acute (batteriche) Infezioni (???) virali Neoplasie metastatizzate Aplasie midollari Farmaci (steroidi, litio) Colonizzazioni midollari Crisi emolitiche Agenti chimici (benzene) Collagenopatie Chemioterapici Fisiologico (gravidanza) Radiazioni

Facciamo il caso di un paziente normale, che ha 10.000 leucociti e percentuali normali. Mettiamo che abbia un'infezione batterica importante: vedo aumento di polimorfonucleati neurofili e della loro percentuale. Se i leucociti fossero sempre a 10.000, l'infezione batterica determinerebbe un aumento della percentuale dei neutrofili, che passerebbero dal numero normae di 5.400 a 9.800. Ma questo non succede mai, perchè in un'infezione batterica, oltre a un aumento della percentuale dei neutrofili, osservo anche un aumento assoluto del numero dei leucociti in generale. Questo significa che, in un'infezione batterica, avrò anche un aumento dei linfociti, solo che tale aumento è proporzionalmente minore rispetto a quello che osservo nei neutrofili.Lo stesso ragionamento vale per le infezioni virali: abbiamo una crescita proporzionalmente maggiore dei linfociti rispetto ai neutrofili, ma comunque entrambi crescono in numero assoluto!

È importante quindi guardare anche il numero assoluto delle varie popolazioni leucocitarie, oltre che le percentuali: se in un paziente con infezione virale ho aumento dei linfociti e una riduzione assoluta (e non percentuale) dei neutrofili, la prognosi varia, perchè il paziente è più suscettibile ad infezioni batteriche.EOSINOFILIAumentoDiminuzione__________________________________________________________________________________________Malattie allergiche CortisoniciMalattie cutanee (pemfigo)Malattie parassitarieLeucemie eosinofile (LMC)Collagenopatie

BASOFILIÈ una cellula circolante che in condizioni normali praticamente non si vede (meno dell'1%).Se vedo anche un leggero aumento di basofili, vado sempre a pensare a una leucemia mieloide cronica, perchè il suo esordio è quasi sempre caratterizzato da un aumento della concentrazione di questa popolazione cellulare.

Aumento Diminuzione_____________________________________________________________________________________Leucemia a cell. Basofile IpertiroidismoLeucemia Mieloide Cronica Infezioni acuteIpotiroidismo CorticosteroidiEstrogeni ad alte dosiSplenectomia

MONOCITIAumento___________________________Malattie ematologiche (mielodisplasie, leucemie)CollagenopatieNeoplasie maligne (ovaio, stomaco, mammella)Malattie infettive batteriche (tubercolosi, sifilide)Malattie infettive viraliMalattie dell’apparato digerente (enteriti)Sarcoidosi

LINFOCITIAumento Diminuzione____________________________________________________________________________________________Fisiologico (< 4 anni) AIDSMalattie virali RadiazioniToxoplasmosi ChemioterapiciIpertiroidismo CortisoniciLeucemie linfatiche Insuff. renaleVasculitiInfezioni virali (atipici)

EMATOPOIESI

Schema della genesi delle varie cellule nel sangue. Durante questa maturazione le varie cellule cambiano il loro fenotipo sia morfologico sia per quanto riguarda la composizione. In particolare è importante valutare la composizione proteica (specie della superficie). In alcune malattie abbiamo un'espansione clonale di alcune specifiche forme maturative. Questo accade perchè si può osservare un blocco di maturazione e la cellula immatura va a proliferare, va a colonizzare il midollo, eliminare le altre cellule e poi va in circolo. Ci si chiede di che tipo di cellule si tratta, perchè a seconda del tipo di cellula che ho ho un determinato tipo di leucemia e a seconda dei vari tipi di leucemia farò trattamenti diversi.

Nella tabella vedo alcune proteine espresse solo da alcuni tipi cellulari. Vedo che CD45 è sempre espressa nella maturazione cellulare.CD34 è un marcatore di cellule staminali, che dopo il promielocita non si vede più.CD66D inizia a essere prodotto solo da promielocita.CD35 solo dalle cellule più mature.Vado a ricercare queste proteine in una popolazione cellulare espansa in modo enorme e a seconda delle proteine di membrana che questa popolazione esprime la andrò a identificare e potrò così attuare un trattamento specifico.

In laboratorio ci sono molti sistemi per fare questa identificazione:L’immunofenotipizzazione è basata sulla identificazione di Antigeni di superficie, citoplasmatici e nucleari, per mezzo di reagenti quali Anticorpi monoclonali coniugati.La presenza di un dato antigene è un indicatore dell’appartenenza di una cellula ad un lineage di un definito livello differenziativo La citofluorimetria a flusso -> La citometria a flusso è una tecnica laser utilizzata in biologia per il conteggio, la separazione e il rilevamento delle cellule. Questa tecnica permette l'analisi simultanea di più parametri sia fisici sia chimici, su migliaia di cellule al secondo.Il dot blot -> Il Dot blot è una tecnica biochimica che, sfruttando l'ibridazione DNA/DNA, evidenzia la presenza di un gene in uno specifico organismo. Le cellule del campione vengono solitamente fissate su un filtro di nylon o nitrocellulosa, che viene posto su un pacchetto di carta assorbente.

Ecco il grafico di un dot-blot che va a identificare le diverse popolazioni cellulari nel midollo di un paziente. Questo è un midollo normale. Cerchiata, c'è una regione in cui normalmente si localizzano i blasti (cellule immature e in proliferazione).Nel secondo grafico, invece, i neutrofili non ci sono quasi più, idem linfociti. Nella regione dei blasti ci sono moltissime cellule -> questa è la condizione tipica di una colonizzazione midollare. Queste cellule poi vengono ulteriormente tipizzate. La tipizzazione ha poi portato alla diagnosi di leucemia mieloide acuta.Quindi immunofenotipizzazione serve alla diagnosi.

Dopo aver fatto diagnosi si inizia il trattamento. Dopo un mese si rianalizza il midollo (grafico a sx): ci sono ancora i blasti, mentre neutrofili, monociti e linfociti ancora non ci sono -> il grafico è simile a quello di prima, quindi capisco che il trattamento non è efficace. Quindi questa tecnica serve anche per vedere l'efficacia del trattamento. Si cambia il trattamento e dopo 3 mesi si fa esame: Linfociti, monociti e neutrofili sono aumentati, blasti sono quasi eliminati: quindi si

ha avuto eliminazione della popolazione che aveva colonizzato il midollo e gli altri hanno ripreso a crecere. In questo caso l'esame è servito a valutare l'efficacia del trattamento.