Chimica delle macromolecole - Unità didattica 3:

La struttura delle proteineAmminocidi, peptidi e proteine: Amminoacidi e loro proprietà. Il legame peptidico. Struttura primarie delle proteine. La Struttura secondaria delle proteine. Struttura terziaria e quaternaria delle proteine. Il ripiegamento delle proteine. Esempi di strutture proteiche, proteine fibrose e globulari. Alcuni principi sul ripiegamento delle proteine. le proteine non ripiegate

Autoverifica: Conosci la struttura e la nomenclatura degli amminoacidi? sai descrivere la struttura di un dipeptide? Sapresti descriverne la geometria? Come si può descrivere la geometria di un polipeptide? Quali sono gli elementi comuni di struttura secondaria? Da cosa dipende la struttura terziaria? Come si ripiegano le proteine? Tutte le proteine hanno una struttura univoca e stabile? Come si ottengono informazioni sulla struttura delle proteine?

Le proteine ricoprono ruoli essenziali negli Le proteine ricoprono ruoli essenziali negli organismiorganismi

• Tre esempi di funzione proteica

– Catalisi:Praticamente tutte le reazioni chimiche degli organismi viventi sono catalizzate da proteine

– Trasporto:Alcune proteine trasportano varie sostanze, come l’ossigeno, gli ioni, ecc.

– trasferimento di informazioni:Per esempio, gli ormoni.

la alcool deidrogenasi ossida gli alcoli ad aldeidi e chetoni

L’emoglobina trasporta l’ossigeno

L’insulina controlla la quantità di zucchero nel sangue

H R

H 3N COO –

Cαcarbonio α

catenalaterale

gruppoamminico

gruppocarbossilico

Gli amminoacidi sonostrutture tetraedriche

R

COO –NH 3 NH 3

R

COO –+

modello sfere ebastoncini

Cosa è un amminoacido Una molecola che contiene entrambi i gruppi funzionali amminico e carbossilico. Gli amminoacidi più interessanti dal punto di vista della biochimica sono gli α-amminoacidi, in cui il gruppo amminico è legato al carbonio vicinale rispetto al gruppo carbossilico.

gruppi R non polari, alifatici

H 3N C

COO

H

H H 3N C

COO

CH 3

H H 3N C

COO

C

CH 3 CH 3

H

H

Glicina         Alanina      Prolina Valina

H 3N C

COO

CH 2

H H 3N C

COO

CH 2

H

OH

Fenilalanina Tirosina

H 2N

H 2C

C

COOH

C

CH 2

H 2

H 3N C

COO

C

C CH

H 2

H

NH

Triptofano

gruppi R polari non carichi

H 3N C

COO

CH 2OH

H H 3N C

COO

H C

CH 3

OH

H H 3N C

COO

C

SH

H 2

H

Serina              Treonina

H 3N C

COO

C

CH 2N O

H 2

H H 3N C

COO

C

C

CH 2N O

H 2

H 2

H

gruppi R carichi positivamente

N

C

C

C

C

H 3N C

COO

H

H 2

H 2

H 2

H 2

H 3 C

N

C

C

C

H 3N C

COO

H

H 2

H 2

H 2

H

NH 2

N H 2

H 3N C

COO

CC NH

H

2

H

CH

N

Lisina               Arginina           Istidina

gruppi R carichi negativamente

H 3N C

COO

C

COO

H 2

H H 3N C

COO

C

C

COO

H 2

H 2

H

Aspartato GlutammatoGlutamminaAsparagina

Cisteina

CH

H 3N C

COO

C

CCH 3 CH 3

H

H 2

H H 3N C

COO

C

C

S

CH 3

H 2

H 2

HH 3 C

COO

H C

C

CH 3

H 2

H

HN

C 3

Leucina         Isoleucina        Metionina

gruppi R aromatici

Gli

amm

inoa

cidi

nat

ural

iC

lass

ifica

ti se

cond

o la

cat

ena

late

rale

← È importante sapere le abbreviazioni

Alcune proprietà degli amminoacidi

La ionizzazione degli amminoacidi

… ed in più ci sono talvolta gruppi ionizzabili in catena laterale

La titolazione di acido glutammico e lisina

Il legame peptidico

Gli amminoacidi possono essere legati tra loro mediante il legame peptidico, per fare i peptidi

H 3N C

R 1

H C

O

OH H N

H

C

R 2

H COO

H 2OH 2O

H 3N C

R 1

H C

O

N

H

C

R 2

H COO

Diverso comportamento acido-base

In un peptide, il gruppo carbossilico e quello amminico non sono più vicinali, per cui il loro comportamento acido-base può anche differire da quello dei singoli amminoacidi costituenti. I gruppi carbossilici e amminici coinvolti nei legamipeptidici non possono più ionizzare. I gruppi ionizzabili nelle catene lateralipossono ionizzare (le loro proprietà possono comunque subire variazioni rispettoa quelle negli amminoacidi isolati).

H 3N C

CH 2OH

H

C

O

N

H

C

H

H

C

O

N

H

C

CH 2

H

C

O

N

H

C

CH 3

H

C

OH

N

H

C

C

CCH 3 CH 3

H

H 2

COO

O H

terminale amminico terminale carbossilico

Gli amminoacidi sono molecole chirali

Tutti gli amminoacidi naturali hanno chiralità L (come la L-gliceraldeide)

Esistono amminoacidi nella configurazione D, ma non sono abitualmente trovati nelle proteine

Lunghezza e composizione dei polipeptidi in natura

I polipeptidi si trovano in natura con precise dimensioni (peso molecolare) e composizione in amminoacidi. Questa evidenza ‘storica’ può essere desunta anche semplicemente idrolizzando i polipeptidi con acidi, in modo da poter analizzare la miscela di amminoacidi risultante.

Le proteine possono essere semplici o coniugate

Le proteine semplici sono costituite solo da una o più catene polipeptidiche, mentre quelle coniugate contengono anche parti non proteiche associate, necessarie per la loro funzione. Queste parti sono chiamate gruppi prostetici e le proteine coniugate possono essere catalogate sulla base dei loro gruppi prostetici.

Un concetto chiave:

I livelli della struttura proteicaStruttura

primariaStrutturasecondaria

Strutturaterziaria

Strutturaquaternaria

residui amminiacidici -elica catena polipeptidica subunità assemblate

Lys

Lys

Gly

Gly

Leu

Val

Ala

His

Struttura primaria: la descrizione di tutti i legami covalenti (la sequenza, le reticolazioni)

Struttura secondaria: l’organizzazione stabile degli amminoacidi in motivi strutturali ricorrenti

Struttura terziaria: il ripiegamento di un polipeptide in una particolare forma tridimensionale

Struttura quaternaria: la relazione strutturale delle diverse subunità (catene polipeptidiche distinte), se presenti

La struttura delle proteine è stabilizzata da interazioni deboliLa ‘stabilità’ di una proteina è la sua tendenza a mantenere una struttura precisa (detta nativa). In termini termodinamici, la stabilità delle proteine si valuta comunemente con ΔG dell’ordine di 20-65 kJ/mole (poco!)

Una lunga catena polipeptidica può essere molto disordinata ed avere molteplici diversi modi di interagire (alta entropia). Le interazioni che permettono ad una catena disordinata (unfolded) di ripiegarsi in una struttura unica (folded) sono proprio le interazioni deboli di cui si è parlato in precedenza:

Legami idrogeno

Interazioni ioniche

Interazioni idrofobicheTra 2 cisteine si possono instaurare legami disolfuro. Questo legame covalente è molto più forte delle interazioni deboli, ma sono effettivamente le numerosissime interazioni deboli che rendono stabile (e scelgono) una struttura proteica.

Ma una delle grandi driving forces per il ripiegamento delle proteine è la possibilità dell’acqua di formare piùlegami idrogeno se la proteina fa legami deboli con se stessa

Viaggio nella struttura delle proteine: La struttura secondaria

La geometria del legame peptidico

Il legame peptidico non è un legame covalente singolo, ma ha una certa percentuale di doppio legame, di conseguenza non c’è libera rotazione tra i gruppi attaccati tramite esso.

peptide

H

piano dellegame peptidico

C

C

C

C

C

O

O

RN

N H

H

ψ

φ carbonio α

gruppo incatena laterale

φ = 180 , ψ =180

piano dellegame peptidico

Il carattere di parziale doppio legame del legame peptidico fa sì che ogni peptide può essere pensato come un piano rigido. Ogni piano può, invece, ruotare intorno ai legami dell’azoto e del carbonio carbossilico con il carbonio α per dare le conformazioni del polipeptide

Angoli diedri importanti

La forma geometrica della catena polipeptidica dipende da tutti gli angoli Ф e ψche si susseguono lungo la catena

Ma non tutte le combinazioni sono possibili, a causa dell’impedimento sterico (un gruppo che dovrebbe occupare lo spazio di un altro)

raggio dicontattoper atominon legati

φ = 0 , ψ = 180

H

C α

NC α

H

O C

O

H

N

R

C α

C N

C α

H

C αO

C

O

H

N

R

C α

C

N

C α

HH

C αO

C

O

H

N

R

C α

C N

C α

HH

φ = 180 , ψ = 0

un’altra rotazione di 120° diφmuove il carbonile ingombranteil più lontano possibile dalla catenalaterale

φ = 0 , ψ = 0O

C α

φ = –60 , ψ = 180

C α

H

O C

N

R

H

NC

C αHO

C α OC α

raggio dicontattoper atominon legati

180

90

–180

0

–90

ψ(gr

adi)

–180 –90 0 90 180φ(gradi)

α

II C

2L

3

α

π

foglietto β antiparallelo tripla elica delcollagene

α-elicadestrogira

anello chiuso

α-elicalevogira

+4+5

–5–4

–3

n = 2

+3+4

+5

–5–4

foglietto β parallelo

Ramachandran e collaboratori hanno pensato di diagrammare gli angoli φ e ψdelle proteine note e hanno verificato la presenza di zone consentite e zone non consentite del piano φψ. Tra le zone si trovano motivi strutturali caratteristici. Questo grafico, ora noto come diagramma di Ramachandran, mostra le conformazioni ‘popolate’ degli angoli di torsione e le zone ‘proibite’ che sono poco popolate.

Diagramma di Ramachandran ideale e reale (da datistrutturali)

Ramachandran Plots

Ideal Real (a kinase)

Il legame idrogeno nelle proteine

Dalla discussione fatta in precedenza risulta che il gruppo carbonilico delle proteine contiene un ossigeno che può accettare un legame idrogeno, mentre all’azoto ammidico è legato un idrogeno che può fungere da donatore di legame idrogeno.

Questi legami idrogeno possono avvenire con molecole di acqua o, convenientemente, tra parti diverse di una proteine (l’idrogeno di un azoto ammidico con un ossigeno carbonilico sulla stessa catena o su altre catene polipeptidiche). Spesso in una proteina molti legami idrogeno si formano allo stesso tempo

Un legame idrogeno tra gruppi di due catene polinucleotidiche

L’α-elicaÈ uno dei motivi strutturali più diffusi (e prima scoperti). Grazie a legami idrogeno, gli amminoacidi si organizzano un un’elica DESTROGIRA che compie un giro completo ogni 3.6 ammminoacidi (residui), equivalente a 13 atomi (si dice anche elica 3.613).

Ogni amminoacido si estende per 1.5 Å lungo la catena (ogni giro è quindi 1.5 x 3.6 = 5.4 Å, il passo dell’elica).

Diverse rappresentazioni dell’ α-elica.

L’α-elicaL’elica (senza considerare le catene laterali, che puntano verso l’esterno) ha un diametro di 6 Å.

Il carbonile di CIASCUN peptide forma un legameidrogeno con l’N-H che sta 4 residui più in alto lungo la catena.

I legami idrogeno sono nella direzione dell’assedell’elica, tutti i carbonili puntano verso una direzione(l’alto) mentre tutti I legami N-H puntano nella direzioneopposta.Gli angoli di torsione per ottenere un’elica di questo tiposono φ=-60° e ψ tra -45 e -50°.Il numero di residui coinvolto in un’elica può variare.

La subunità β dell’emoglobina

Un modello ideale di α-elica (poly-Ala)

Solo n-4 legami ad idrogeno intra-α-elica si possono formare in un’elica lunga n, mentre i primi 4 ossigeni carbonilici e gli ultimi 4 idrogeni ammidici alle estremità dell’elica possono formarli con altri gruppi non parte dell’elica (capping dell’elica) Dallo studio dei poliamminoacidi

(polipeptidi fatti da un tipo di amminoacido) si vede che non tutti gli amminoacidi hanno la stessa propensione a formare α-eliche: èparticolarmente frequente trovare residui con gruppi R poco ingombranti (Ala) mentre si trovano a fatica gruppi carichi, la cui repulsione disordina l’elica. Si vede, ad esempio, che a valori di pH in cui i gruppi carichi si scaricano (protonazione dei carbossili, deprotonazione degli ammoni) la propensione a formare la doppia elica di tali amminoacidi aumenta. La prolina deforma (o interrompe) l’α-elica.

Le proteine fibrose e le α-elicheLe proteine possono essere distinte, sulla base della loro solubilità, in proteine fibrose, globulari e di membrana.

Nelle proteine fibrose, le catene polipeptidiche sono allungate e allineate parallelamente alla direzione della fibra. Sono proteine spesso insolubili e con grande resistenza meccanica, che ricoprono ruoli strutturali in natura.

L’α-cheratina ad esempio (unghie, capelli …) è costituita di catene con una porzione centrale di 311-314 residui in α-elica, e porzioni N- e C-terminali non a elica.

I residui idrofobici sono nelle parti affacciate delle eliche. La torsione delle eliche serve a nascondere i tratti di residui idrofobici all’acqua (facendoli interagire tra loro sulle due eliche). È una perdita di energia compensata dall’esclusone dell’acqua.Legami disolfuro possono tenere rigidamente insieme le catene.

α-elica

Coiled coil di due α-eliche

Protofilamento (copia di coiled coil)

Filamento (quattro protofibrille ritorte in senso destrogiro

Eliche alternativeEsistono anche altri tipi di eliche nelle proteine, stabilizzate da legami idrogeno.

L’elica 310 contiene 3 residui per giro (con 10 atomi per giro, facendo legami idrogeno tra carbonili e idrogeni ammidici residui distanti 3 residui lungo la catena – detto i+3). Normalmente queste eliche sono meno frequenti e/o piùcorte dell’α-elica.

Altre strutture ad elica sono il nastro 27 (legami idrogeno tra carbonile e azoto ammidico a i+2) e l’elica π, che ha 4.4 residui per giro (e 16 atomi) per cui èanche detta elica 4.416 (legami H a i+5.)

Esempio di Ala8 in elica 310

Esistono anche eliche levogire: l’esempio del collagene

Le catene del collagene hanno una composizione molto particolare (principalmente glicina, prolina ed idrossiprolina –una modifica dell’amminoacido prolina). Questi residui non si ripiegano facilmente in una delle forme più ‘canoniche’ ma assumono una forma elicoidale molto più estesa dell’α-elica. Le tre eliche che compongono il tropocollagene (la fibrilla base a tripla elica) hanno un passo di 2.9 Å (rispetto agli 1.5 Å dell’α-elica) e 3.3 residui per giro di elica.

Ogni elica ha geometria locale LEVOGIRA, mentre la superelica risultante è destrogira.

Ogni 3 residui, un amminoacido di ogni elica si trova affacciato all’interno della tripla elica, in una regione di grande ingombro sterico: solo la Gly (o Ala), che ha gruppo R molto poco ingombrante può occupare questa posizione (per cui in ogni catena, un amminoacido ogni 3 è Gly).

Le tre catene sono legate da ponti idrogeno (l’N-H delle Glylega un C=O della Pro o Hyp adiacente) e da altri legami idrogeno. La fibra è quindi legata fortemente.

Esistono diversi tipi di collagene: il TIpo I in ossa, tendini e pelle (fatto da due catene uguali ed una diversa), il Tipo II nella cartilagine ed il Tipo III nei vasi sanguigni fatti di 3 catene uguali.

1000

am

ino

acid

i di l

ungh

ezza

, circ

a 30

0 nm

per 1

.4 n

mdi

dia

met

ro

tropocollagene

In una fibra di collagene, tante triple eliche lunghe 300 nm sono sfasate e tenute insieme tra loro da legami deboli. Al microscopio elettronico queste hanno una apparenza a bande, risultante dalla presenza di interruzioni (buchi) tra le catene. La presenza di questi buchi sembra legata alla presenza di zuccheri legati covalentemente alle idrossiproline in questa posizione.

Questi potrebbero avere utilità nel controllare l’organizzazione della struttura o nel servire da punto di nucleazione per la crescita di cristalli di idrossiapatite che formano le ossa (ove questi cristalli sono, appunto immersi in una matrice di collagene.

I foglietti beta

È un’altra struttura secondaria stabile e molto diffusa delle proteine, stabilizzata dalla formazione cooperativa di un grande numero di legami idrogeno. È detta foglietto ripiegato β o struttura β.

Nella struttura, i carboni α stanno nelle pieghe delle ‘strisce’, i C=O puntano in una direzione e gli N-H che li legano nella direzione opposta. Tutti i gruppi formano legami H.

Antiparallel β-sheet

Foglietti β paralleli o antiparalleli

Ogni catena del foglietto può essere pensata come un’elica con passo 2 (2 residui ogni giro). Poiché il carbonio α è tetraedrico, ogni piano del legame peptidico èpiegato rispetto a quello successivo (ed il foglietto risulta piegato).I legami idrogeno in questa struttura sono essenzialmente inter-strand. La catena polipeptidica è nella conformazione più estesa possibile (detta talvolta conformazione ε).

Il foglietto antiparallelo è un po’più esteso di quello parallelo (che è più piegato, per formare i legami H, che sono piegati).

I residui sono distanti 0.347 nmnel foglietto antiparallelo (0.325 nm in quello parallelo).

I gruppi R si estendono perpendicolarmente rispetto al piano del foglietto.

In genere si trovano foglietti paralleli in strutture grandi (almeno 5 catene per foglietto) mentre foglietti antiparalleli possono anche essere costituiti di 2 catene.

Ci sono proteine costituite prevalentemente di α-eliche, altre di β-sheets, mentre altre hanno presentano entrambe le strutture in una stessa catena polipeptidica.

Nella seta, ad esempio, le catene polipeptidiche sono organizzate principalmente in foglietti β antiparalleli orientati nella direzione dell’asse della fibra. La conformazione già molto estesa del foglietto motiva la scarsa estensibilità della fibra, che però è molto flessibile.

La seta del ragno è, effettivamente, un materiale dalle proprietà meccaniche ragguardevoli: si potesse fare una corda di seta di ragno dello spessore di una matita, sarebbe sufficientemente resistente per fermare un Boeing 747 in volo! Domini microcristallini di β-sheets

danno resistenza

α-eliche e zone disordinate danno flessibilità

La s

trut

tura

nan

otec

nolo

gica

della

set

a

La fibroina (della seta) o la β-cheratina (piume degli uccelli)

Sono proteine fatte di foglietti β antiparalleli ricchi di Gly e Ala (o Ser) alternati, in modo che da un lato del foglietto possano essere tutte le Gly e dall’altra tutte le Ala/Ser. In questo modo più foglietti possono impilarsi facendo combaciare perfettamente le catene laterali.

Le proprietà meccaniche delle fibre dipendono dalla struttura: fibre flessibili ma non estensibili.

Il β-turn

Le catene polipeptidiche devono anche fare ‘inversioni di direzione’ ad esempio nelle proteine globulari. I β-turn sono ripiegamenti stretti, detti anche ‘ripiegamenti inversi’.

Nel β-turn, il carbonile di un residuo fa legame idrogeno con l’idrogeno ammidico 3 residui oltre. Questo legame H stabilizza il ripiegamento. Certi amminoacidi, come la Pro o la Gly compaiono spesso nei β-turn e la conformazione del ripiegamento dipende dalla sua composizione amminoacidica. Gly ha la catena laterale più piccola per cui si può adattare alle ‘richieste’ strutturali degli altri amminoacidi, mentre Pro ha l’angolo Ф fissato dalla struttura ciclica che promuove il ripiegamento. I β-turn facilitano la formazione di foglietti βantiparalleli.

O e R3 da parti opposteO e R3 dalla stessa parte: ingombro, ok se R3=H

ripiegamento classico ripiegamento G1 ripiegamento largo

Altre irregolarità nella formazione di legami idrogeno tra le catene di foglietti βantiparalleli portano a distorsioni della geometria: sono detti ripiegamenti β.

Coinvolge 2 residui su una catena (che si piega e deforma il foglietto) ed uno sulla catena adiacente legata alla prima.

A causa della stabilizzazione energetica conferita dai legami H, è difficile che una proteina non contenga nessun elemento di struttura (secondaria).

La struttura terziaria è il ripiegamento di una singola catena polipeptidica nello spazio. Le informazioni che portano ad una struttura spaziale precisa di una proteina sono tutte contenute nella struttura primaria, anche se seguendo regole che non sono totalmente note, finora.

Le eliche e i foglietti (struttura secondaria) si forma, a causa della stabilizzazione impartita dai legami H. In seguito, questi si associano in una struttura compatta: si vede che nessuna proteina è stabile come un singolo strato di polipeptide. Ci sono modi comuni per ottenere questo impacchettamento. Come conseguenza del fatto che i tratti non interessati dalla struttura secondaria sono generalmente brevi, questi congiungono direttamente le strutture secondarie, senza attorcigliamenti o annodamenti complicati. Questo limita la varietà delle strutture terziarie, che formano delle famiglie. Le proteine si ripiegano per formare le strutture più stabili possibili. La stabilitàderiva dalla i) formazione del maggior numero possibile di legami H intramolecolari e ii) dalla riduzione della superficie accessibile al solvente.

Le proteine globulari sono le più diffuse

contengono un quantitativo variabile di α-eliche e β-sheets.

Ad esempio la mioglobina, una proteina coniugata di 17 kDa che trasporta ossigeno nei muscoli, sono presenti 8 segmenti di α-elica di lunghezza variabile da 7 a 26 a.a.Lo spazio tra le eliche è riempito dalle catene laterali (idrofobiche) mentre quelle polari sono esposte verso il solvente, come spesso succede. È relativamente insolito che una proteina globulare contenga una proporzione così grande di α-eliche.

residui idrofobici in verde

Una proteina globulare più tipica è la ribonucleasi A bovina (bovine ribonucleaseA) una piccola proteina (14.6 kD, 129 residui) che contiene alcune eliche corte, una sezione importante di β-sheets antiparalleli e alcuni ripiegamenti β, oltre ad alcuni segmenti senza struttura definita.

Il nucleo di una proteina spesso contiene soprattutto parti strutturate in eliche o foglietti, poichè in questo modo i gruppi polari C=O e N-H sono neutralizzati nella formazione di legami H e possono stare nell’interno idrofobico di una proteina.

Nei casi in cui un’elica si affaccia al solvente, ecco che presenta una faccia con residui polari o carichi ed una con residui idrofobici (elica anfipatica). Si nota che eliche completamente esposte sono polari/cariche.

Struttura della calmodulina (una proteina che lega il calcioCon un’elica totalmente esposta al solvente)

Struttura della flavodoxina (uno scambiatore di elettroni con un’elica anfipatica esposta al solvente solo su una faccia)

Codice colori amminoacidi:

L’impaccamento delle proteine

Calcolando il volume delle proteine globulari e la somma dei volumi di van der Waals dei singoli amminoacidi, si può vedere che la densità di impaccamento delle proteine è in genere 0.72-0.77. Questo significa che ci sono spazi vuoti (molto piccoli) nell’interno della proteina che possono conferire un certo grado di flessibilità meccanica. La maggior parte di queste cavità non sono grandi a sufficienza per ospitare molecole (acqua).

I coil o random coil (gomitolo statistico, in Italiano) sono quelle parti di catena polipeptidica non interessata da una struttura secondaria. Queste parti sono, spesso, ugualmente strutturate, ma in maniera più variabile, grazie alle interazioni delle loro catene laterali (i gruppi R). Queste interazioni sono molto importanti per stabilizzare le strutture proteiche (vedi modello a destra)

Stabilizzazione dell’α-elica

Stabilizzazione del β-sheet

La calmodulina (di Paramecio) che lega il calcio mediante regioni a loop non strutturate

Da dati ai raggi X a 1.0 Å

Catene disordinate e dinamica nelle proteine

Esistono anche tratti di catena polipeptidica che sono ‘disordinati’ (e spesso non appaiono nelle mappe di diffrazione ai raggi X).

Può essere che siano tratti flessibili che si possono muovere o che assumono posizioni alternative (per questo non appaiono chiari nella struttura). Spesso catene cariche sulla superficie delle proteine non sono strutturate (molte delle catene laterali delle lisine superficiali della mioglobina, ad esempio).

Le proteine sono comunque mantenute strutturate da interazioni deboli, per questo sono comunque consentiti movimenti strutturali, anche rapidi. Talvolta sono a carico di un singolo atomo, talvolta di un’intera porzione della catena polipeptidica. Possono essere indotti dall’agitazione termica o da meccanismi precisi di induzione.

Le vibrazioni degli atomi delle proteine sono solitamente movimenti veloci e limitati (0.5 Å).

I movimenti collettivi sono più lenti e coinvolgono interi tratti di catena legati covalentemente. Un esempio: il movimento dei domini flessibili di legame degliantigeni negli anticorpi. Avvengono sulle scale di 10-3-10-12 secondi e dipendono anch’essi dall’energia termica.

Transizioni conformazionali (10-9-103 secondi) coinvolgono intere porzioni di catena che si sposta anche di grandi distanze (1 nm). Possono avvenire in risposta a stimoli precisi o all’instaurazione o rimozione di interazioni specifiche. Sono importantissime per la catalisi enzimatica

Le forze che guidano il ripiegamento tridimensionale delle proteine globulari

Due importanti tendenze razionalizzano il ripiegamento delle proteine globulari:

-Una catena polipeptidica di L-amminoacidi ha, anche se non ha struttura secondaria, la tendenza ad attorcigliarsi nel senso destrogiro. Questo fa si che le catene tendano a disporsi preferenzialmente in una forma destrogira, ad esempio negli incroci necessari per la formazione di foglietti β paralleli.

-Il ripiegamento tende a nascondere i residui idrofobici all’interno della proteina, per non esporli al solvente. Le proteine globulari possono essere classificate sulla base del tipo di nucleo idrofobico e di geometria dello scheletro che sono impiegate per nascondere i residui idrofobici. Il ‘nucleo idrofobico’ è quella regione in cui si raccolgono per interagire tra loro e non con il solvente.

Antiparallelo

rotazione destrogira naturale di una catena polipeptidica

Parallelo, destrogiro

Parallelo, levogiro

Molto diffusa

rara

Si può formare il motivo βαβ

Si possono razionalizzare i ripiegamenti delle proteine globulari come strati di scheletro ripiegato, in modo che tra gli strati si possano ‘nascondere’ i residui idrofobici. Più di metà delle proteine globulari note ha due strati, circa un terzo ne ha tre, poche ne hanno quattro o cinque.

A volte non è facile definire gli strati o contarli.

(a) Citocromo c

Strato 1 Strato 2 I residui idrofobici sono sepolti tra gli strati

(b) Fosfoglicerato kinasi(Dominio 2)

(c) Fosforilasi(Dominio 2)

Parti gialle=nuclei idrofobici

(d) T rioso fosfato isomerasi

Gli strati possono anche essere geometricamente curvi, come per la trioso fosfato isomerasi, che ha uno strato centrale di β-sheet parallelo ed uno strato esterno di α-eliche.

Oltre che per gli strati, le proteine sono classificabili sulla base della strutturasecondaria che contengono (α-eliche antiparall, β-sheet paralleli o misti, β-sheetantiparall. proteine ricche di metalli o disolfuri). Le similitudini della strutturaterziaria non devono ingannare su similitudini di funzione: l’omologia funzionale èspesso dipendente da similitudini strutturali su una scala molto più piccola chel’intera proteina.

Proteine di eliche antiparallele.

È il modo più semplice per impaccare α-eliche. Le proteine quindi consistono dimazzetti (bundle) di eliche, spesso con una torsione levogira.

La maggior parte di queste proteine è fatta di 4 eliche.

Le globine sono un gruppo importante di proteine di α-eliche: sono costituite da due strati di eliche, uno perpendicolare all’altro e la catena polipeptidica che passa continuamente da uno strato all’altro.

la proteina del virus del mosaico del tabacco la mioglobina

Proteine di β-sheets paralleli o misti

Si nota che i β-sheets paralleli distribuiscono i residui idrofobici su entrambi i lati del piano. Di conseguenza, nessuno dei lati del foglietto può essere esposto al solvente: i foglietti paralleli sono quindi nel nucleo delle proteine che li contengono.

Una struttura importante è il β-barrel (barile β), in cui 8 catene formano un foglietto cilindrico affiancato da eliche a loro antiparallele che formano un cilindro esterno di eliche parallele tra loro. Questa è la struttura della trioso fosfato isomerasi, giàvista.

entrambi i cilindri hanno una torsione destrogira

Un altro motivo strutturale comune basato su foglietti paralleli o misti è un ‘muro’ interno di foglietto β attorcigliato protetto dal solvente da entrambi le parti da eliche.

Queste strutture possono essere pensate come fatte di 3 strati di scheletro e quindi hanno 2 nuclei idrofobici. Un esempio è l’esokinasi.

esokinasi

Proteine con foglietti antiparalleli

I foglietti antiparalleli dispongono, di solito, i residui idrofobici su un solo lato, per cui possono avere un lato esposto al solvente.

La struttura minimale è a 2 strati, per proteggere il nucleo idrofobico. A volte la geometria è a barile (i barili contengono in genere un numero pari di catene e possono essere o tutti paralleli o antiparalleli).

A volte le catene sono interbloccate con topologie complicate che ricordano le ‘Greche’.

inibitore della tripsina dalla soia

Le proteine contenenti metalli o ricche in ponti disolfuro

Queste sono proteine generalmente piccole (100 residui) la cui struttura èfortemente influenzata dalla presenza di metalli o legami disolfuro. La struttura di queste proteine ricche in ponti disolfuro diventa instabile se i ponti disolfuro sono rotti. Alcune hanno ripiegamenti simili alle proteine viste finora.

L’insulina è un esempio di polipeptide ricco in disolfuri

La ferrodoxina è ricca in ferro (come fa presumere il nome stesso)

Insulina ferrodoxina

I coiled-coil

Il motivo strutturale dell’α-cheratina è detto coiled-coil. È un motivo presente anche in altri tipi di proteine non costituite esclusivamente di eliche. In un mazzo di eliche ce ne possono essere 2, 3 o 4 e possono essere parallele o antiparallele.

Un esempio di coiled-coil molto esteso è la coda della miosina, proteina motore che si muove sulle fibre di actina

Elementi di struttura sovrasecondariaSono anche chiamati motivi strutturali, o ripiegamenti (folds). Si tratta di raggruppamenti caratteristici di strutture secondarie trovate nelle proteine.

Alcuni grandi motivi strutturali possono comprendere l’intera proteina, altri sono molto semplici. Ad esempio, il coiled-coil si può intendere con motivo strutturale.A volte si possono individuare DOMINI di ripiegamento in lunghi polipeptidi: in questo caso, tratti diversi dello stesso polipeptide si ripiegano indipendentemente (e uno può essere ripiegato indipendentemente dagli altri). A volte anche la struttura terziaria èreminiscente della divisione in domini, e la proteina appare costituita di sezioni globulari collegate da filamenti non strutturati. Più comunemente, gli estesi contatti tra i domini non permettono di vedere chiaramente tale suddivisione.

Alcuni moduli della titina

Esempi di motivi strutturali:

Due semplici motivi strutturali che possono nascondere residui idrofobici, creando due strati nella proteina

Già visto in precedenza, eliche (destrogire e, raramente, levogire) per fare foglietti β paralleli

La tendenza dei β-strand di attorcigliarsi crea strutture come i β-barrel o i foglietti β attorcigliati.I motivi sono la base per una classificazione dei ripiegamenti delle proteine

Piruvato chinasi: una complessa struttura in cui si nota un motivo β-α-β

Altre consuetudini …

Quando entrambi presenti in una proteina, α-eliche e β-sheet fanno di solito parte di due strati strutturali distinti, perché non riescono a formare facilmente legami H tra loro.

Più spesso che no, elementi vicini nella struttura primaria restano in prossimitàanche in quella terziaria, ma non è una regola.

Non si possono formare incroci o nodi nel passare da un elemento di struttura secondaria all’altro.

α-Emolisina di Staphilococcus aureus: una proteina con un β-barrel che protrude e che si inserisce nella membrana cellulare creando un buco che porta alla lisi della cellula.

Helix- turn- helix

Beta sandwiches

4 α bundle

Le proteine di membrana si sono adattate ad un ambiente idrofobico

La struttura della batteriorodpsina, una proteina pompa che sposta protoni attraverso la membrana (verso fuori)

La struttura quaternaria

• non lineare• tridimensionale• formata da legami

idrogeno, legamicovalenti (disolfuri), impaccamento idrofobicoed esposizione disuperfici idrofiliche

• le strutture favorevolisono frequenti e sonostate catalogate

Esempi di altre strutture quaternarie

Tetramero Esamero Filamento

SSB, permette il legame coordinato al

DNA

DNA elicasi, legame coordinato al DNA e

idrolisi di ATP

ricombinasi, per il completo ricoprimento

di una molecola estesa

In molte proteine, la struttura quaternaria si presenta simmetrica

Come nell’emoglobina, la struttura quaternaria consente un livello aggiuntivo di funzionalità (o di complessità)

il legame con l’O2 ha effetti strutturali su tutta la proteina, cambiando la propensione stessa di legare l’O2.

Generalmente, solo una piccola frazione dellasuperficie proteica è conservata

Invariante (il residuo è sempre lo stesso, es: Asp)Conservato (il residuo è generalmente simile, es: carico neg.)non conservato (diversi residui in diverse specie)

Le chaperonine sono grandi complessi di proteine fatti a doppio anello il cui ruolo in vivo è assistere al ripiegamento delle proteineLe Chaperonine cercano di controbilanciare il ripiegamento delle proteine in forme non-native e l’aggregazione delle proteine - Durante il folding de novo - Nelle condizioni di stress (es.: ad alta temperatura – sono a volte detti ‘heat shock proteins’)

=rip

iega

men

to‘n

ativ

o’N

Le chaperonine e l’assistenza al ripiegamento

Cause dell’aggregazione

Interazioni idrofobicheLegami idrogeno inter-

cateneAffollamento intracellulare

U = catena non ripiegata (unfolded)N = Proteina ripiegata in modo nativoI = intermedio parzialmente ripiegato

1. Il polipeptide non-nativo si lega all’anello trans (lontano a GroES) di GroEL

2. 7ATP (equatoriali) e GroES si legano all’anello cis di GroEL3. Dissociazione dei 7ADP e di GroES dall’anello cis di GroEL4. Il dominio apicale di GroEL ruota e cambia conformazione per

raddoppiare il volume della sua cavità e mutare le proprietàsuperficiali da idrofobiche a idrofiliche

Il meccanismo di assistenza al ripiegamento delle chaperonine

1- Legano i polipeptidi non ripiegati in modo nativo attraverso interazioni idrofobiche2- Permettono ai polipeptidi di ripiegarsi in un ambiente idrofobico isolato

CHAPERONI CITOSOLICI di Coli e possibile utilizzo contro corpi di inclusione

Schlieker et al.Si possono usare chaperoni come -“disaggregasi” che disaggregano il corpo es ClpB

- “chaperoni folding” es DnaK e GroEL che intervengono anche nel folding de novo - “chaperoni holding” che prevengono l’aggregazione oppure coaggregano con gli

aggregati per richiamare le disaggregasi Oltre ai chaperoni è possibile usare proteasi per disaggregare i corpi di inclusione

Polipeptide nascente

incontra DnaKIntermedi del

folding

TF

Proteina NativaIncotra GroEL

aggregati

5-18%

10-15%

Hsp60 (GroEL), Hsp70 (DnaK) e Hsp90 (HtpG), assistendo il

folding, possono aiutarlo mandandolo “avanti”e

prevenendo così l’aggregazione. Però queste proteine non sono in grado direttamente di “soccorrere”

grossi aggregati.

Problematica con alto riscontro nell’espressione di proteine ricombinanti

eterologhe

La sovraespressione porta ad un livello di aggregazione proteica elevato:

CORPI D’INCLUSIONE

Sempre maggiore è l’interesse riscontrato dagli studi che descrivono l’eterogeneità della struttura dei corpi

d’inclusione e le interazioni dinamiche delle proteine precipitate sotto questa forma con la frazione solubile.

Come si determinasperimentalmente la struttura

delle proteine?

Cristallografia ai raggi X• cristallizzare una proteina• bombardarla con i raggi X e

registrare il disegno di diffrazione

• determinare la mappa di densità elettronica dallo scattering e dalla fase mediante trasformata di Fourier:

• Utilizzare la densità elettronica e le conoscenze biochimiche sulla proteina per raffinare le informazioni ed ottenere un modello

"All crystallographic models are not equal. ... The brightly colored stereo views of a protein model, which are in fact more akin to cartoons than to molecules, endow the model with a concreteness that exceeds the intentions of the thoughtful crystallographer. It is impossible for the crystallographer, with vivid recall of the massive labor that produced the model, to forget its shortcomings. It is all too easy for users of the model to be unaware of them. It is also all too easy for the user to be unaware that, through temperature factors, occupancies, undetected parts of the protein, and unexplained density, crystallography reveals more than a single molecular model shows.“

- Rhodes, “Crystallography Made Crystal Clear” p. 183.

1864 Viene cristallizzata l’ emoglobina.1895 Röngten osserva che quando i raggi catodici (elettroni) colpivano un bersaglio

metallico si originava una nuova forma di radiazione penetrante, che egli chiamo’raggi X.

1912 Facendo attraversare dai raggi X un cristallo di solfuro di zinco Von Laue ottiene i primi diffrattogrammi. W.L. Bragg e W.H. Bragg propongono una correlazione semplice tra la figura di diffrazione ottenuta con i raggi X e la disposizione degli atomi nel cristallo che ha generato la figura (legge di Bragg).

Anni ‘30 Bernal, Crowfoot, Bragg, ottengono i primi diffrattogrammi da cristalli di proteine (insulina, emoglobina, mioglobina).

1941 Atsbury ottiene il primo diffrattogramma ai raggi X del DNA.1951 Pauling e Corey propongono la struttura di α-elica e foglietto β in base a

considerazioni teoriche.1953 Watson e Crick propongono la struttura a doppia elica del DNA sulla base delle analisi

diffrattometriche ai raggi X di Franklin e Wilkins.1954 Perutz e coll. elaborano i metodi basati sull’ impiego dei metalli pesanti per risolvere il

problema delle fasi nella cristallografia ai raggi X.1960 Kendrew descrive la struttura della mioglobina a una risoluzione di 2 Å. Perutz

propone la struttura della emoglobina, piu’ grande, ad una risoluzione inferiore.Anni ‘80 Hartmut Michel risolve la struttura (3 Å) della prima proteina di membrana (centro di

reazione fotosintetico).Anni ‘90 Diviene possibile la cristallografia risolta nel tempo.2000 Vengono risolte le strutture (3 Å) delle subunita’ L e S del ribosoma (circa 1.5 e 1 MD

rispettivamente).

Cenni storici

Cristallografia ai raggi X

• Servono grandi quantità di proteine cristallizzate (le proteine devono cristallizzare)

• È difficile cristallizzare le proteine• Molto difficile per proteine

idrofobiche (transmembrana) • Più accurato dell’NMR• Costoso: $100,000/proteina• Accesso a radiazione adatta• Tempo di calcolo per risolvere la

struttura

Cristallografia a raggi X

• Ottenere cristalli della proteina– 0.3-1.0 mm– Le singole molecole sono ordinate in modo

periodico, ripetitivo. • La struttura è determinata dai dati di

diffrazione. problema fondamentale è che l’ intensità dello scattering dei raggi X risultante dall’ interazione con una singola molecola è troppo debole per dare informazioni utilizzabili.

→→ Con un cristallo l’ ampiezza dello scattering viene amplificata di un fattore pari al numero di cellule unitarie che formano il cristallo esaminato.

Condizioni per la cristallizzazione di proteine

• Proteina pura > 97% e in grande quantita’.

• Lenta precipitazione da una soluzione sovrasatura → metodo hanging drop.

• Giocano un ruolo molti parametri critici: pH, temperatura, concentrazione della proteina, natura del solvente e del precipitante, ligandi della proteina, etc.

• Alcuni cristalli non diffrangono affatto o troppo poco (disordine intrinseco), altri sono troppo piccoli o troppo fragili.

Le proteine nei cristalli tendono a impaccarsi lasciando fra loro larghi spazi

Impaccamento della glicolato ossidasi

→ Struttura ‘nativa’

→ Diffusione di ligandi, metalli pesanti

Diffrazione a raggi X

Risoluzione

Spettroscopia NMR

• I protoni risuonano ad una frequenza che dipende dal loro intorno chimico.

• Questo può essere impiegato per caratterizzare una struttura.

• Non ha bisogno di cristalli, la proteina può essere in soluzione (anche se in genere molto concentrata).

• A risoluzione più bassa della cristallografia ai raggi X.

Spettroscopia NMR

• Proteine in soluzione acquosa, mobili, vibrano e si mescolano grazie all’agitazione termica

• l’NMR rileva i chemical shift dei nuclei atomici con spin non nullo a causa delle interazioni che hanno con l’ambiente circostante

• determina le distanze tra coppie di atomi

• impiega, poi, conoscenze chimiche e biochimiche sulla proteina per determinare famiglie di modelli.

determinare delle costrizioni(distanze, angoli)

da usare per determinare unastruttura

Campo magnetico

NOE (Nuclear Overhauser Effect)

NMR

Risonanza Magnetica Nucleare(NMR)

• Proteine in soluzione• Limite di dimensione ~ 40 kDa• Proteine stabili a lungo• Marcatura con 15N, 13C, 2H.• Strumentazione molto costosa• Tempo per assegnare le risonanze

Pro e contro

X-ray

• Richiede cristalli, problematico

• Non ha limiti (teorici) di grandezza

• Piú preciso

• Risoluzione

• Struttura può essere deformatadai cristalli, rigida

• Una “soluzione“

NMR

• Possibile in soluzione, piùsemplice

• Limitato a proteine fino a circa 300 residui

• Meno preciso

• Numero di vincoli

• Struttura nativa in soluzione, flessibile

• Molti modelli

X-ray NMR

Fluorescence Resonance Energy Transfer• è spesso descritto come “righello molecolare”• segmenti di una proteina sono etichettati con fluorofori• il trasferimento di energia avviene quando donatore ed accettore

interagiscono, questo dipende dalla distanza e decresce come 1/d6

dove d è la separazione tra donatore ed accettore• donatore ed accettore devono essere distanti meno di 50 Å,

l’intensità di emissione dell’accettore è sensibile alle variazioni di distanza

• si possono individuare coppie di punti di catena che sono, ad esempio, separati quando la catena non è ripiegata e prossimi quando la catena è ripiegata.

Protein DataBank (PDB)

X‐ray: 58,000NMR: 7,400

http://www.pdb.org

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/gquery

Utili portali di ricerca per strutture

Il problema del ripiegamento delle proteine …

… cioè il problema di capirci qualcosa

Perché il ripiegamento delle proteine è un problema?

“Chiunque abbia faticato per ripiegare una carta stradale dovrebbe portare particolare rispetto alle proteine, le quali si ripiegano da sole ed in pratica si mettono anche nel cassetto”

- (Brian Hayes, da un articolo su American Scientist, 1998)

Le proteine si ripiegano spontaneamente nella loro struttura ‘nativa’, impiegando un tempo biologicamente breve (dell’ordine

dei secondi)

Come si ripiegano le proteine?

la struttura nativa è lo stato fondamentale del sistema, La differenza energetica con

il primo stato eccitato è >> kT…

…le proteine si ripiegano o si denaturano come risposta ad uno stimolo esterno e per

svolgere funzioni biologiche

…il ripiegamento di una proteina è una reazione

chimica, il meccanismo è tale che lo stato di transizione abbia bassa energia libera

Perché il ripiegamento delle proteine è (ancora) un problema irrisolto?

La struttura tridimensionale proteica NON ÈGERARCHICA, ma contestuale e la nucleazione ha luogo contemporaneamente: le strutture 2° e 3°crescono insieme

Le proteine non hanno un problema di ripiegamento …… ce l’hanno i ricercatori

In principio, le leggi della fisica determinano per intero come una catena lineare di

amminoacidi si ripieghi in una struttura tridimensionale complessa dotata di proprietà biochimiche utili.

In pratica, predire la struttura partendo dalla sequenza è un grande problema

irrisolto.

Cartoons by Larry Gonick

Perché il ripiegamento è un problema?

è molto difficile caratterizzare il processo di ripiegamento!

STATO NATIVO

STATO FONDAMENTALE

Perché il ripiegamento delle proteine è (ancora) un problema irrisolto?

Paradosso di Levinthal (1968):

2CI2 N= 83 residui~ 5 stati ogni residuo

Ω = 5 ~ 1083 58

foldτ = ~ 10 secΩ

k0 10

58

12

>> età dell’universo !!τfold

Se la ricerca è casuale:

Ricerca casuale nello spazio conformazionale

panorama di energia conformazionale simile ad un

campo da golfcoordinata(e) di reazione

Ener

gia

Teoria della superficie di energia potenziale

Superficie di energia potenziale a ‘campo da golf’

superficie di energia potenziale altamente corrugata

superficie di energia potenziale ad imbuto

coordinata(e) di reazione

Ener

gia

troppo lento!

troppo lento!

OK!

La proteina cerca CONFORMAZIONI ad ENERGIA PIÙ BASSA

Cartoons by Larry Gonick

Studi teorici hanno mostrato come superfici di energia potenziale fatte ad imbuto con un minimo unico possano guidare efficientemente una proteina verso strutture native grazie alla progressiva organizzazione delle strutture parzialmente ripiegate che si formano lungo il cammino.

L’imbuto è corrugato da ‘impedimenti’ locali (impedimenti sterici, contatti non nativi, ecc.) che producono barriere di potenziale alcune volte maggiori delle fluttuazioni termiche. Durante il ripiegamento, questa corrugazione dell’imbuto comanda la cinetica del processo intrappolando le molecole che si stanno ripiegando. Si ipotizza che i processi di ripiegamento/denaturazione possano avvenire su questa complessa superficie di energia potenziale, caratterizzata da numerosi intermedi.

Cartoons by Larry Gonick

(Onuchic & Wolynes Current Opinion in Structural Biology 2004, 14:70–75)

Una proteina è guidata verso la sua struttura nativa da superfici di energia potenziale con una struttura

globalmente ‘ad imbuto’

Le molecole individuali seguono cammini differenti.

Esaminare gli equilibri conformazionali e le cinetiche di ripiegamento al livello della singola molecola, sta divenendo una necessità ed al tempo stesso una grande sfida in biologia sperimentale.

(J. M. Fernandez, H. Li, Science 2004, 303, 1674-1678)

Within such a complex funneled multidimensional energy landscape, different protein molecules, in spite of having the same sequence, can follow markedly different trajectories during their folding and also in their thermal fluctuations afterhaving reached their “native” structure. In fact, one molecule can be driven into one funnel trap, while a different molecule can visit another one, and so on. Through such a multiplicity of conformational paths, peculiar structures could be assumed or particular motions could be made even by only a few moleculesof the ensemble.

Those structures might be selected or those motions might be rectified to make a specific biological function possible, and the same function would be inaccessible for all the other molecules at that same moment. It has been theoretically recognized that the structure of a protein required for a biological function might also be the result of catastrophic events, such as the cracking or unfolding of partof the protein due to transient strain energies. On this basis, examining protein conformational equilibrium and folding kinetics at a single-molecule level has become a necessity, and it is currently considered a great challenge in experimental biology.

Examining protein conformational equilibrium and folding kineticsat a single-molecule level

Misure di singola molecola

Superiamo le limitazioni delle medie con misure di molecole singole, poi è possibile effettuare

• medie nel tempo • medie nelle popolazioni conformazionali

Discrasia: pensiamo nei termini di una molecola singola, ma facciamo solitamente esperimenti campionando numeri di

Avogadro di molecole ed estraendo quantità mediate

Gli esperimenti di denaturazione indotta dalla forza normalmente esplorano traiettorie differenti sulla

superficie di energia potenziale rispetto agli esperimenti di denaturazione termica o con agenti chimici.

Gli esperimenti di denaturazione meccanica sono particolarmente rilevanti per le proteine che sono soggette a

forze di trazione in vivo.

(X. Zhuang & M. Rief, 2003)

denaturazione termica

denaturazione meccanica

denaturazione meccanica della titina

mediante optical tweezers Kellemayer et al. Science 1997, 276,1112-1116; Tskhovrebova et al., Nature 1997, 387, 308-312

mediante microscopia a forza atomica: Rief et al. Science 1997, 276, 1109-1112

• La curva di forza ha un profilo a denti di sega in cui ogni picco corrispondeallo svolgimento di un dominio individuale• I singoli moduli si svolgono sequenzialmente.

Denaturazione e rinaturazione di una proteina in velocity clamp

Titina: la denaturazione e la rinaturazioneprocedono su due traiettorie diverse. Il tempo richiesto per campionare tutte le possibili interazioni e scegliere i minimi di energia ottimali diventa sempre più lungo

Miosina II coiled coil: si comporta come una vera molla entropica: può rilassare molto velocemente poiché la sua struttura ètopologicamentesemplice

(fig.from X. Zhuang, M. Rief Curr. Op. Str. Biol: 2003)

Il processo è dominato da effetti cinetici quando la velocità di applicazione della forza è piùalta del tempo di rilassamento molecolare più lento.

Panorama (superficie) di energia libera

da: http://www.ch.embnet.org/MD_tutorial/

( ) vdWticaelettrostadiedricaangololegame EEEEERE ++++=

Simulazioni di Dinamica Molecolare

• Possible in principle.• Astronomical, highly under-constrained search space.• Biophysics complex and incomplete.• Next to impossible in practice.

The Structural Prediction Problem“Given a protein sequence, compute its structure”.

Secondary Structure Prediction

• Much simpler to predict a small set of classes than to predict 3-D coordinates of atoms.

• Amino acids have different propensities for alpha helices, turns and beta sheets.

• Homology can also be used since fold is more conserved than sequence.

A Major Challenge of Bio-informaticsThe challenge: Understand the relationship between amino acidsequence and the 3D structure of proteins; Predict 3D structure from sequence.

Unfortunately, the relationship between sequence and structure is very complicated. Current tools perform this taskpoorly.

Best performance (so far) can be achieved using sequencehomology to a known 3D structure experimentally determined (by X-ray crystallography or NMR).

How do Proteins AcquireCorrect Conformation ?

• The primary amino acid sequence is crucial in determining its final structure.

• In some cases, additional interactions may be required before a protein can attain its final conformation (for example, cofactors, one or more subunits).

• Proteins can change their shape and function depending on theenvironmental conditions in which they are found. The primary aminoacid sequence does not change.

How is the 3D structure determined?1. Experimental methods (Best approach):• X-rays crystallography - stable fold, good quality crystals.• NMR - stable fold, not suitable for large molecule.

2. In-silico methods (partial solutions -based on similarity):

• Sequence or profile alignment - uses similar sequences, limited use of 3D information.

• Threading - needs 3D structure, combinatorial complexity. • Ab-initio structure prediction - not always successful.

http://www.idi.ntnu.no/grupper/KS-grp/microarray/slides/drablos/Fold_recognition/sld004.htm

Principle: Look for the structure with minimum free energy.

Rule of thumb: Hydrophobic a.a. wants to stay “inside” (conserved),hydrophilic a.a. wants to be “outside” (less conserved, assuming water as the universal solvent in cells).

The main driving force for folding is to pack hydrophobic side-chainsinto the interior of the molecule, thus creating a hydrophobic core.

Factors other than free energy: shape, size, polarity, strength of interactions, etc.

Predicting Protein Structure

Conformation of PolypeptidesThe Advent of Computational Modeling:Aim: Develop procedures for predicting protein structure,that are not so time consuming and that are not hindered by size and solubility constraints.

Basic Theory: Proteins that share a similar sequence, generally share the same basic structure. There is a strong conservation of protein 3D shape across large evolutionary distances.

1. Comparative (Homology) Modeling.Requires sequence that is similar to the sequences of a protein(s) of known structure.

2. Fold Recognition (Threading).Requires a structure similar to a known structure (with little sequence similarity).

Both based on similarity.

3. Ab-initio (based only on sequence)Have no similarity, based on first principals.

Example:A pathway for folding a 2-domain protein.

Three Main Approaches for Structural Prediction:

Principle: Sequence homology usually implies 3D structural similarity.Given a protein sequence, look for homologous sequenceswith a known structure.Suppose the structure of one or more homologous hasalready been determined. Then the structure of “our”original protein will be similar (High sequence identity(> 70%), is necessary).

Remark: The success of this approach depends on thenumber of different structures already determined(low success early on, improved as PDB grows).

1. Comparative (Homology) Modeling

Classifying Proteins by Folds

In human: Estimated number of proteins is 100,000.~700 folds discovered so far.

Fold: Collection of proteins that share a similar combination of secondary structures.

Nature has created complexity through the combination of a small number of simple elements - such as secondary structures.

2. Protein Fold Recognition -

Goal: Map regions of linear sequence to known folds in PDB.

Fold recognition - Given a sequence and a library of folds,thread the sequence through each fold. Take the one with the highest score.

Note: Method will fail if new protein does not belong to any fold in the library.

Experience shows that with current library (~700 folds)most new proteins do find a“good fold”.

Score of the threading is computed based on known physical chemistry properties and statistics of amino acids.

http://cmgm.stanford.edu/biochem218/16Threading.pdf

Fold Recognition

Thick backbone - known structure. Thin lines - modeled structure. Some side-chains are not positioned correctly, but some look good.

The similarity of structures is very high in “core regions”(helices & sheets). However, loops vary even in pairs of homologous structures with high % of sequence similarity.

Fold Recognition - Threading

Ab-initio, theoretical modeling, and conformation space search

• Ab-initio = given amino acid primary structure, i.e. sequence, derive structure from first principles (e.g. treat amino acids as beads and derive possible structures by rotating through all possible φ, ψ angles using a “reliable” energy function, then optimize globally)

• Theoretical modeling = subset of ab-initio, given amino acid primary structure and knowledge about characteristic features, derive structure that has that structure and features(e.g. protein has an iron binding site

possible heme substructure)

• Conformation space search = subset of ab-initio, but a stochastic search in which the sample space is reduced by initial conditions/assumptions (e.g. reduce sample space to conform to Ramachandran plot)

Homology modeling and threading

• Homology modeling = knowledge-based approach, given a sequence database, use multiple sequence alignment on this database to identify structurally conserved regions and construct structure backbone and loops based on these regions, restore side-chains and refine through energy minimization (apply to proteins that have high sequence similarity to those in the database)

• Threading = knowledge-based approach, given a structure database of interest (e.g. one that provides a limited set of possible structures per given sequence for fold recognition, one that provides a one structure per given limited set of possible sequences for inverse folding) use scoring functions and correlations from this database to derive structure that is in agreement (apply to proteins with moderate sequence similarity to those in the database)

Energy minimization, simulation and Monte Carlo

• Energy minimization = select an appropriate energy function and derive conformations that yield minimal energies based on this function

• Simulation = select appropriate molecular conditions and derive conformations that are suited to these molecular conditions

• Monte Carlo = subset of molecular simulation, but it is an iterated search through a Markov chain of conformations (many iterations canonical distribution, P(particular conformation)~exp(-E/T)) proposed by N. Metropolis, in which a new conformation is generated from the current one by a small ``move'' and is accepted with a probability Pacc = min(1, exp(-ΔE/kT)), which depends on the corresponding change in energy, ΔE, and on an external adjustable parameter, kT

Used when all else fails:1. No homology found to any sequence with known

structure. 2. All known folds give poor threading scores.

Given only the sequence, try to predict the structure based on physical-chemistry properties (energy, hydrophobicity, size, charge, etc.).

Some ab-initio programs try to simulate the process of the protein folding in the cell (by molecular dynamics).

3. Ab-Initio Prediction

Ab-Initio Prediction• A good prediction method for 2- or 3D structures

only for small & simple proteins. • Method requires enormous computational resources.

Despite substantial improvements, success

is still very limited.

PARADIGMA STRUTTURA-FUNZIONE

SEQUENZA SEQUENZA AMMINOACIDICAAMMINOACIDICA STRUTTURA 3DSTRUTTURA 3D FUNZIONEFUNZIONE

STRUTTURA 3D SPECIFICA ESTRUTTURA 3D SPECIFICA E’’ PREREQUISITO PREREQUISITO FONDAMENTALE PER LA FUNZIONALITAFONDAMENTALE PER LA FUNZIONALITA’’

DELLA PROTEINADELLA PROTEINA

ESPERIMENTI DI DENATURAZIONEESPERIMENTI DI DENATURAZIONE

Talvolta qualcosa non è perfettamente razionale …

così dovrebbe funzionare sempre, ma …

CONFIGURATIONAL ADAPTABILITY (Karush, 1950)

DA STUDI SU ALBUMINA DEL SIERODA STUDI SU ALBUMINA DEL SIERO

IPOTESI CHE CAMBI CONFORMAZIONALI IPOTESI CHE CAMBI CONFORMAZIONALI SIANO RESPONSABILI DELLA FUNZIONALITASIANO RESPONSABILI DELLA FUNZIONALITA’’

DELLA PROTEINADELLA PROTEINA

20 ANNI FA: scoperta, in alcune proteine, di segmenti non 20 ANNI FA: scoperta, in alcune proteine, di segmenti non strutturati aventi ruolo importante per la funzionalitstrutturati aventi ruolo importante per la funzionalitàà della della

proteina stessa.proteina stessa.Coda funzionale Coda funzionale

delldell’’istone H5istone H5

Dalla “TRIPLETTA PROTEICA”MoltenMolten globuleglobule OrdinatoOrdinato

Gomitolo statisticoGomitolo statistico

SCHEMA DEL QUARTETTO PROTEICO

IUPsIUPs

INTRINSICALLY UNSTRUCTURED PROTEINSINTRINSICALLY UNSTRUCTURED PROTEINS

Proteine la cui funzione Proteine la cui funzione èè direttamente correlata direttamente correlata al disordine strutturaleal disordine strutturale

Trasduzione del segnaleTrasduzione del segnale

Regolazione del ciclo cellulare Regolazione del ciclo cellulare

Espressione genicaEspressione genica

• Assenza di folding associata a alta flessibilità

• Comuni a molti organismi, in quantità correlata alla complessità

• Localizzate soprattutto in nucleo e citoscheletro

TECNICHE PRINCIPALI PER DIMOSTRARE L’ASSENZA DI UN’UNICA

STRUTTURA 3D

Cristallografia Cristallografia ai raggi Xai raggi X

Risonanza Risonanza magnetica nucleare magnetica nucleare multidimensionale multidimensionale (NMR)(NMR)

Dicroismo circolareDicroismo circolare

Studio delle Studio delle IUPsIUPs in vitroin vitro in in soluzioni altamente diluitesoluzioni altamente diluite

CARATTERISTICHE STRUTTURALI

• CONFORMAZIONE ESTESA

• COMPOSIZIONE AMMINOACIDICA CARATTERISTICA

• ORDINE STRUTTURALE

•• BASSA IDROFOBICITABASSA IDROFOBICITA’’•• ALTA CARICA NETTA ALTA CARICA NETTA •• MANCANZA DI MANCANZA DI CysCys•• ABBONDANZA DI ProABBONDANZA DI Pro

CONFORMAZIONE ESTESA

• La PRINCIPALE PROPRIETÀstrutturale delle IUPs è che non posseggono una struttura ben foldata in condizioni fisiologiche.

• Appaiono infatti in una CONFORMAZIONE ESTESA che sembra assomigliare allo stato di random coil, ma tale struttura dipende da una precisa composizione amminoacidica per nulla casuale.

SNAP-25

SARA SBD DOMAIN

HIF-1α

HIF-1α

COMPOSIZIONE AMMINOACIDICA DISTINTIVA

FREQUENZE DI AMMINOACIDI IN %FREQUENZE DI AMMINOACIDI IN %

EE’’ FAVORITA UNA CONFORMAZIONE FAVORITA UNA CONFORMAZIONE ESTESAESTESA

Arg, Ala, Gly, Pro, Glu, Lys, Ser e Gln(disorder-promoting)

Trp, Tyr, Phe, Cys, Ile, Leu e Asn(order-promoting)

Tale composizione amminoacidica provoca:Tale composizione amminoacidica provoca:

BASSA IDROFOBICITABASSA IDROFOBICITA’’ALTA CARICA NETTA ALTA CARICA NETTA

COMPOSIZIONE AMMINOACIDICA DISTINTIVA

• In una struttura globulare di solito le cisteine occupano il SITO ATTIVO o stabilizzano i LEGAMI DISOLFURO. Le IUPs infatti sono carenti nella frequenza di questi residui.

• La prolina è un amminoacido che DESTABILIZZA la struttura avvolta delle proteine a causa della sua struttura rigida.

• La prolina induce la formazione di una elica sinistrorsa chiamata POLIPROLINA II (PP II), una conformazione molto frequente nelle IUPs.

MANCANZA DI MANCANZA DI CysCys ABBONDANZA DI ProABBONDANZA DI Pro

EE’’ FAVORITA UNA CONFORMAZIONE FAVORITA UNA CONFORMAZIONE ESTESAESTESA

ORDINE STRUTTURALE

• L’ordine strutturale delle IUPs èvisibile a livello della sequenza amminoacidica, come dimostra la BASSA COMPLESSITA’(molte regioni ripetute) se comparata con le sequenze random delle proteine globulari.

• Inoltre la distribuzione a lungo raggio di alcuni amminoacidi (Pro, Gln, Acidi, Basici) ètutt’altro che casuale. Infatti è chiaramente visibile che l’organizzazione in DOMINIdi alcune IUPs è definita dalla prevalenza di alcuni residui piuttosto che di altri.

ZONE RICCHE IN AA ACIDIZONE RICCHE IN AA ACIDI

ZONE RICCHE IN AA BASICIZONE RICCHE IN AA BASICI

ZONE RICCHE IN ProZONE RICCHE IN Pro

ZONE CARICHEZONE CARICHE

ORGANIZZAZIONE DEI DOMINI DELLE ORGANIZZAZIONE DEI DOMINI DELLE IUPsIUPs

S,A,Q,N,K NOME DELLS,A,Q,N,K NOME DELL’’AA PREDOMINANTEAA PREDOMINANTE

CARATTERISTICHE FUNZIONALICoinvolgimento in molti PROCESSI CELLULARI:• regolazione della trascrizione e traduzione • trasduzione cellulare del segnale • immagazzinamento di piccole molecole (scavengers)• regolazione dell’assemblaggio di grossi complessi multiproteici

(assemblers)• funzione di chaperoni per proteine e molecole ad RNA

TRANSIZIONETRANSIZIONE DISORDINEDISORDINE--ORDINEORDINE ((coupledcoupled foldingfolding and and bindingbinding). Può ). Può consistere sia nellconsistere sia nell’’assunzione di uno stato semplicemente piassunzione di uno stato semplicemente piùù ordinato, sia ordinato, sia di una struttura secondaria o terziaria.di una struttura secondaria o terziaria.

BINDING PROMISCUITYBINDING PROMISCUITY, capacit, capacitàà di legare pidi legare piùù target differenti. target differenti. Ovviamente ciò presuppone lOvviamente ciò presuppone l’’adozione di diverse conformazioni.adozione di diverse conformazioni.

MODIFICAZIONI POSTMODIFICAZIONI POST--TRASDUZIONALITRASDUZIONALI (fosforilazioni, acetilazioni, (fosforilazioni, acetilazioni, metilazioni,metilazioni,……). Propriet). Proprietàà molto importante per tutte le molto importante per tutte le IUPsIUPs la cui funzione la cui funzione èè soggetta a modulazione (soggetta a modulazione (display display sitessites).).

IUPs = proteins that mostly lack a single, well-defined three-dimensional structure in physiological conditions.IUPs play key roles in a wide range of biological processes like transcriptional and translational regulation, signal transduction, protein phosphorylation and help in the folding of RNA and other proteins.IUP’s fulfil more then one, apparently unrelated, function (‘moonlighting’, or multi-tasking proteins); might increase the complexity of metabolicnetwork without increasing the number of underlying proteins

against the classical paradigm of protein science “one sequence=one structure”

Intrinsically Unfolded Proteins (IUPs)

Tompa P, Trends Biochem Sci (27) 10, 527-533

Dunker AK, "DisProt: the Database of Disordered Proteins." Nucl. Ac. Res. 2007(35)786-93

• Questa classe di IUPs non è coinvolta nel riconoscimento molecolare.

• La funzione deriva direttamente dallo stato disordinato in cui si trovano ed è associata all’abilità del polipeptide di fluttuare tra stati conformazionali alternativi.

• Svolgono fondamentalmente ruoli architettonici come ad esempio quello di molle per la contrattilità del muscolo, o di spaziatori dei microtubuli del citoscheletro.

• Comprende principalmente bristles, springs e linkers.

CATENE ENTROPICHE

LEGAME TRANSIENTE

• La loro funzione è mediata da modificazioni regolatorie POST-TRADUZIONALI come fosforilazione o proteolisi limitata.

• Alcune modificazioni richiedono infatti una buona flessibilità del substrato (data in questo caso dal disordine intrinseco) che permette interazioni transienti ma specifiche con il sito attivo dell’enzima.

• Ultima classe ad essere stata individuata.

• Comprende sia chaperoni proteici che RNA-chaperoni. I primi sono la classe funzionale con la maggiore incidenza di regioni non strutturate (il 40% contro il 15% dei proteici).

• La funzione dipende direttamente dai segmenti non strutturati.

DISPLAY SITESDISPLAY SITES CHAPERONSCHAPERONS

A questo gruppo appartengono le IUPs coinvolte in riconoscimentiA questo gruppo appartengono le IUPs coinvolte in riconoscimenti molecolari, ma molecolari, ma che intraprendono con i propri target solo legami transienti, osche intraprendono con i propri target solo legami transienti, ossia non permanenti sia non permanenti nel tempo.nel tempo.

LEGAME STABILEA questo gruppo appartengono le A questo gruppo appartengono le IUPsIUPs coinvolte in riconoscimenti molecolari, ma coinvolte in riconoscimenti molecolari, ma che intraprendono con i propri target solo legami permanenti, osche intraprendono con i propri target solo legami permanenti, ossia duraturi nel sia duraturi nel tempo.tempo.

SCAVENGERSSCAVENGERSASSEMBLERSASSEMBLERSEFFECTORSEFFECTORS

Alterano lAlterano l’’attivitattivitàà dei loro dei loro target molecolari target molecolari (singole proteine o (singole proteine o complessi complessi multiproteicimultiproteici). ).

La loro azione La loro azione èèprincipalmente inibitoria, principalmente inibitoria, ma scoperte recenti ma scoperte recenti hanno dimostrato che hanno dimostrato che possono agire anche da possono agire anche da attivatori, dimostrando la attivatori, dimostrando la loro estrema versatilitloro estrema versatilitààstrutturale e funzionale.strutturale e funzionale.

Questa classe di Questa classe di proteine proteine èè coinvolta coinvolta nei processi di nei processi di assemblaggio, assemblaggio, regolazione e regolazione e stabilizzazione di stabilizzazione di grossi complessi grossi complessi multiproteicimultiproteici quali ad quali ad esempio il ribosoma, esempio il ribosoma, la cromatina e il la cromatina e il citoscheletrocitoscheletro..

ScavengersScavengers significa significa esattamente esattamente ““spazzinispazzini””, infatti la , infatti la loro funzione loro funzione èè quella quella di accumulare e di accumulare e neutralizzare piccole neutralizzare piccole molecole che molecole che costituiscono il loro costituiscono il loro ligandoligando..

Human diseases linked with abnormal aggregation of IUPs

Chiti & Dobson, AnnuRev Biochem2006

“human proteins have evolved to resist aggregation and to functio n efficiently, butwith almost no margin of safety to respond to genetic and environmental factorsthat decrease their solubility or increase their concentration i n vivo.”

“we are constantly living our lives at the edge of a molecular pr ecipice”.

(Vendruscolo and coll. Trends Biochem Sci 2007)

The expression levels of human genesin-vivo are anti-correlated with the aggregation rates of the corresponding proteins measured in -vitro

-Its physiological functions in the nervous system remains to be fully defined.

-It is related to several neurodegenerative diseases, including Parkinson’s disease (PD).

- α-syn bound to ubiquitin is the main constituent of the proteinaceous cytoplasmic inclusions called Lewy Bodies.

Lewy body α-synuclein immunostain

Amphipatic region NAC Acidic terminal

1 61 95 140

α-synuclein

oligomers

fibrils(β−sheets)‏

Lewy body

Interacting withmembranesit acquires α-helixstructure

The transition from the natively unfolded monomeric state to fibril is a process of acquiring a β-structure. This process is still under strong debate.

?

αSyn is a nativelyunfolded protein

Amyloid fibrilsThe name comes from the early mistaken identification of the substance as starch (amylum in Latin)

One of the most intriguing issues in biology is the occasional conversion of proteins into stable fibrillar aggregates.Such structures, known as amyloid fibrils are involved in over 20 neurodegenerative human diseases.

An electron microscope imageof amyloid fibrils in vitro

Diffraction pattern: signature of cross β structurewith β-strands orthogonal to the fibril axis

Amyloid fibrils

Syn 1-140 / 110h 37°C

Fibril-involving Proteopathies (Amyloidoses):42 and counting !

• Alzheimer’s disease• Parkinson’s disease• Atrial Amyloidosis• Hereditary Renal

Amyloidosis• Secondary Systematic

Amyloidosis• Injection-Localized

Amyloidosis• Type II diabetes• Chronic Wasting Disease

(CWD)• Scrapie• BSE- Mad Cow Disease• Kuru• Creutzfeldt-Jakob Disease

1 . Tecniche per valutare il contenuto di struttura secondaria

DICROISMO CIRCOLARELo spettro CD di una IUP ècaratterizzato da un’ellitticitànegativa a 198 nm e da un’ellitticitàprossima a zero a 185 nm. Valutando i valori di ellitticità a 200 e 222 nm si riesce anche a discriminare tra proteine randomcoils e premoltenglobules.

SPETTROSCOPIA INFRAROSSA DI FOURIER (FT-IR)Le informazioni sulla struttura secondaria derivano dalla scomposizione della banda di assorbimento dell’ammide nei suoi componenti. Questa banda si origina dalla vibrazione di stretching del C=O del legame peptidico, la cui frequenza è sensibile alla conformazione della proteina.Consente di monitorare l’aggregazione della proteina e di discriminare tra eliche con differenti gradi di flessibilità

2. Metodi per valutare la struttura terziaria globale

SMALL ANGLE X-RAY SCATTERING (SAXS)

L’intensità di scatter è sensibile sia alle dimensioni della proteina in soluzione, sia alle proprietà conformazionali della catena polipeptidica.

Confrontando per una proteina il raggio di rotazione sperimentale con quello atteso, si riesce a discriminare tra proteine foldate, random coils e premolten globules.

DYNAMIC LIGHT SCATTERING E GEL FILTRATION

Attraverso queste tecniche è possibile determinare il raggio idrodinamico Rh di una particella in soluzione: sono stati definite delle relazioni empiriche tra l’Rh e il numero di residui di proteine globulari e di random coils, perciò si può confrontare l’Rh osservato con i valori attesi e valutare il grado di compattezza della proteina.

ULTRACENTRIFUGAZIONE ANALITICA E VELOCITA’ DI SEDIMENTAZIONE

Anche queste altre due tecniche forniscono informazioni idrodinamiche quali la taglia e la conformazione della proteina

3. Metodi per valutare la struttura terziaria locale

SPETTROSCOPIA DI FLUORESCENZAIl principale fluoroforo nelle proteine è l’amminoacido triptofano: esso ha

un massimo di assorbanza prossimo a 280 nm e un massimo di emissione altamente dipendente dalla polarità dell’ambiente. L’intensità di fluorescenza del triptofano dipende inoltre dall’interazione con i gruppi vicini. Lo spettro di fluorescenza di una IUP fornisce perciò utili informazioni sull’ambiente del fluoroforo, e quindi sulla presenza di struttura proteica ordinata in sua vicinanza.

SPETTROSCOPIA NEAR UV-CDNella regione near-UV (320-260 nm) i segnali CD sorgono

principalmente dalle catene laterali aromatiche di fenilalanina, tirosina e triptofano. Segnali pronunciati sono indicativi di residui aromatici in un ambiente piuttosto asimmetrico, compatibile con la presenza di una residua struttura ordinata.

DIFFERENTIAL SCANNING CALORIMETRY (DSC)

Poiché l’assenza di una transizione termica cooperativa è indicativa dell’assenza di struttura terziaria rigida, un’analisi della capacitàtermica può risultare utile per l’individuazione di proteine intrinsecamente disordinate.

SURFACE PLASMON RESONANCE (SPR) – tecnologia BIACORE

Le variazioni di segnale riflettono cambiamenti conformazionali all’interno di una proteina immobilizzata. Si possono quindi valutare il disordine strutturale intrinseco e il folding indotto in presenza di un ligando

Need: handles are needed to grab anindividual IUP molecule by AFM, toconnect one end of the protein to the tip and the other to the substrate

Tool: Single-Molecule AFM-based Force-Spectroscopy

In SMFS, like for optical tweezers, the handles can • provide an internal standard: their length and behavior under tension is wellknown, so that interesting events can be recognized

• define a precise pulling geometry for the molecule of interest

• reduce the effect of non-specific probe-surface interactions

Handles+protein=artificial bionanostructure

zz z

zz z

zz z

Bulk analysis SMFS

Result: SMFS can detect different classes of single-molecule events originated by different conformers of

α-synuclein in the nanostructure

Many nanostructures comprising α-synuclein are pulled and unfolded …here are some example curves of two types

Interpretationis due to:

is due to:

extension of the unstructuredportion of the nanostructure

It is now possible to characterize the folding state of α-synuclein monomers!

[Sandal, Valle, et al. PLOS Biology 2008, 6(1), e6]