I QUATTRO LIVELLI DI ORGANIZZAZIONE STRUTTURALE DELLE PROTEINE

STRUTTURA PRIMARIA : LEGAME PEPTIDICO

Il legame peptidico rappresenta la vera UNITA’ RIPETITIVA dellaproteina, presente cioè con una struttura identica in ogni sequenza

Nel legame peptidico, il legame singolo C–N (O=C–NH) hacaratteristiche di doppio legame (lunghezza intermedia),risultando in un ibrido di risonanza: la libera rotazione C–Nè impedita, quindi il legame peptidico costituisce unastruttura planare rigida.

C’è invece libertà di rotazione tra Ca – C=O (angolo Y(psi)) come tra Ca – NH (angolo f (phi)).

Dato che il legame peptidico è rigido, la conformazione della catenaamminoacidica è definita completamente quando f e y sono fissatiper ciascun residuo della catena. Tuttavia, un residuo non può avereuna qualunque coppia di valori di f e y, perché certe combinazioninon sono possibili a causa di impedimenti sterici

Grafico di RamachandranPossibili strutture assumibili in funzione degli angoli diedri tra due amminoacidi

Grafico di RamachandranPossibili strutture assumibili in funzione degli angoli diedri tra due amminoacidi

STRUTTURA SECONDARIA

E’ data dal ripiegamento dellacatena polipeptidica

La struttura secondaria analizza i rapportitra amminoacidi vicini nella struttura primaria(un residuo rispetto ad un altro distante tre-

quattro residui, nell’ a elica) ma anchedistanti (nel foglietto )

E’ la struttura primaria che determina il tipo diripiegamento e pertanto la struttura secondaria èessa stessa dipendente dalla sequenza dei codoni

La struttura secondaria è l’organizzazione tridimensionale di segmenti definiti

della catena amminoacidica

STRUTTURA SECONDARIALa struttura secondaria descrive la formazione di legami idrogeno

tra i gruppi CO e NH dello scheletro polipeptidico

3 tipi principali : Alfa-elicaFoglietto-beta (beta-sheet)Ripiegamento-beta (beta-turn)

Proteina ad a-eliche Proteina a foglietti b

turn turn

a

STRUTTURA SECONDARIA

Struttura ad a elica

È la più semplice organizzazione tridimensionaleche una catena polipeptidica può assumere

Lo scheletro carbonioso è avvoltointorno all’asse centrale, lasciando igruppi laterali R proiettati versol’esterno. I legami H puntano nellastessa direzione

E’ un’elica che, girandoattorno ad un asse centrale,assume una struttura globalea bastoncino.

Si forma quando un certo numero dicoppie successive di angoli diedrici (ψ eϕ) hanno valori compresi fra -60° e -50°.

In questo modo i piani peptidici sidispongono in maniera elicoidale intornoad un asse longitudinale.

…generalmente

destrogira…..

…con un giro (passo)

di elica lungo

0,56 nm

Ci sono3,6 amminoacidi per giro

…tenuta assiemeda

legami idrogenotra ilC =O

di un legame peptidicoe l’N-H

del legame peptidicodel

IV amminoacido successivo

Legami H intracatena

L’alfa elica “vista” dall’alto

Lo spazio internoè quasi nullo, non contiene

molecole d’acquaed è quindiidrofobico

All’esternosono

proiettati gliR polari

La prolina NON può formare l’elicaL’N non ha infatti alcun H

disponibile per fare ponti idrogeno, e fa parte di un anello rigido (il legame N-Ca è bloccato)

CaCa

(6% dei legami peptidici)

Non tutti gli amminoacidi sono compatibili con l’alfa elica

Gly è troppo piccola(di fatto è raramente presente)

Ser, Asp e Aspn: formano troppi legami H

Ile ed il Trp sono troppo ingombranti

Glu e Lys sono carichi (a pH 7)

Ala, invece, forma spontaneamente l’elica

Pro : anello rigido, no ponti H

Queste informazioni valgono nel caso in cui molti di

questi a.a. siano vicini. Altrimenti (eccetto la Pro e Gly)

li troviamo a formare l’alfa elica

STRUTTURA SECONDARIA

Foglietto o lamina

si formano legami H intercatena tra filamenti di almeno 5-10 residui amminoacidici, organizzati in modo che lo scheletro covalente risulti in un andamento a zig-zag; i legami si possono formare anche intracatena tra residui distanti tra di loro nella sequenza primaria

(Pauling e Corey)

…..anche in questo caso i legami H intercorrono

tra ilC O e l’N-H

di due legami peptidici;

ma, diversamente che nell’alfa elica, i legami H

sono intercatena(tra a.a. distanti nella sequenza)

Nel foglietto beta, i gruppi R giacciono sopra e sotto il piano del legame peptidico

Disposizione dei foglietti

antiparallela

parallela

è la più stabile, perché ……

l’H del legame Hè in linea con O e N

I valori tipici per un foglietto sono ϕ = -120° e ψ = 105° nel fogliettoparallelo oppure ϕ = -135° e ψ = 140° nel foglietto antiparallelo

L’intervallo dei valori che possono essere assunti dagli angoli ϕ o ψ èmolto ristretto

Quali a.a. favoriscono la struttura beta?

STRUTTURA SECONDARIA

Ripiegamento ( turn)

Si trova in ripiegamenti o anse,dove la catena polipeptica cambia direzione

Collega tratti successivi in a eliche o in foglietto ,Es. collegamento di foglietti antiparalleli

Ripiegamento bÈ un ripiegamento a 180° di una sequenza di 4 residui

Si forma un legame H tra il C=O del primo e NH del quarto residuo, il secondo e terzo residuo non partecipano attivamente

Pro in posizione 2 (tipo I) Gly in posizione 3 (tipo II)(Pro in cofigurazione cis)

L’alfa elica e la struttura beta possono combinarsi tra di loro per dare origine a motivi proteici

(fanno parte della struttura III)

Tuttavia ci sono proteine a SOLA struttura II. Qual è la loro funzione?

Di per sé, la struttura secondaria è rigida, prevalentementeidrofobica,

e spesso forma macro-aggregati fibrillari;

proprietà ideali per unafunzione strutturale (collagene, cheratine etc)

Tipica delle proteine FIBROSE : struttura lineare con conformazione a filamento (prevalenza di un tipo di struttura secondaria)

Il motivo dell’elica superavvolta nelle proteine:motivo coiled coil proposto da Pauling nel 1953

Fascio di a eliche che si superavvolgono tra di loro

Es. miosina, a-cheratina

MiosinaLa regione C-term (coda) della miosina (filamento spesso) del muscolo

è formata da due alfa eliche avvolte

La regione N-term (testa) ha invece struttura globulare (III) e ha funzione enzimatica,

(idrolisi di ATP)

che, in presenza di Ca2+, porta allo scorrimento dei filamenti spessisu quelli sottili di F-actina (formata da mononomeri globulari diG-actina) e quindi alla contrazione

Struttura coiled coil= regione superavvolta

Alfa cheratine (filamenti intermedi del citoscheletro)(nei capelli, lana, pelo, unghie, zoccoli, corna, artigli, starti esterni della pelle, etc.)

Due catene di a-cheratina con la stessa direzionalità (2 a-eliche) si avvolgono su stesse per dare origine ad una struttura coiled coil

Andamento elicoidale del superavvolgimentoè sinistrorso

Passo dell’elica di 5.15-5.2 Å anziché 5,4 Å

Strutture avvolte coiled coil generano protofilamenti e protofibrille

Ponti S-S trasversaliintercatena possonotenere compattee superavvoltele alfa eliche.

A seconda del numero,il proto-filamentoe la microfibrillasaranno più omeno rigidi(poco nella lana;di piùnel capello; moltonel becco e negli artigli)

Ponti disolfuro stabilizzano le singole a-eliche di cheratina

La “ permanente”

Lamine antiparallele rappresentano la principale struttura delle fibre della seta: la fibroina

Lunghi tratti di glicina, alanina e serina impilati

aa con catene laterali piccole:consentono una perfetta sovrapposizione dei foglietti

La struttura è flessibile, anche se non si può allungare, perché i foglietti sono tenuti insieme da interazioni deboli, a differenza che nella a-cheratina dove le eliche sono unite da ponti disolfuro

Alcune proteine fibrose hanno struttura a foglietto

Struttura a triplice elica allungata

Un altro esempio di proteina fibrosa:il collagene

Struttura secondaria unica: = -51°e Y=+153°Completamente distinta dalla struttura ad a-elica

COLLAGEN0

Unità strutturale

triplice elicadel tropocollageno

NON sono a eliche, ma eliche allungatecon passo di 0.92 nm (invece dei

0.56 nm dell’alfa elica)

Ciò è dovuto alla presenza della piccola Gly(nelle introflessioni) e della rigida Pro (nelle

estroflessioni) che provocano il“rilassamento” di ciascuna catena cui si possono associare le altre

catene attraverso legami H

Nella triplice elica non ci sono legami H intracatena, ma intercatena

tra l’-NH peptidico della Gly e il -COpeptidico di a.a. delle altre catene

La triplice elica risulta quindi compatta, idrofobica ed insolubile, adatta a formare fibre

Organizzazione “sovra”molecolare del tropocollagene

Un’ elica singola U n a t r i p l i c e e l i c a

I residui di Gly (in rosso) si adattano ai punti di contatto tra le eliche

Più unità di tropocollageno sidispongono – testa coda –in modo parallelo ma con unaleggera «sfalsatura» che renderagione delle striature trasversali

che si osservano al microscopioelettronico

Fibre di collageno

Ne collageno dei vertebrati è presente:Gly (35%),

Lys e idrossiLys (11%)Ala (11%)

Pro ed idrossiPro (21%)

Sono assenti:Cys e Trp

Il collageno contiene anche legami covalenti trasversali tra le catene laterali di Lys e His.

Tendono ad aumentare con l’età

La sequenza amminoacidica del collageno è costituita da un’unità tripeptidica ripetuta Gly-X-Y, dove X è spesso Pro e Y è spesso 4-Hyp

OH OH

OH

4-idrossi prolina

OH

3-idrossi prolina

I residui di idrossilisina possono essere glicosilati: La glicosilazione aumenta con l’età

Oltre alle proteine fibrose con funzione strutturale, le strutture secondarie possono anche formare proteine

integrali di membrana con una funzione più dinamica(recettori, canali, porine, trasportatori, etc)

ORGANIZZAZIONE STRUTTURALE DELLE PROTEINE

Il ripiegamento (folding) della catena polipetidica

Dalla struttura secondaria alla struttura terziaria

Quando la proteina si avvolge su stessa, gli amminoacidi che sono lontani possono interagire tra di loro

Con il calore, il pH o con la forza ionica si rompono i legami H della struttura II e pertanto si perde

la funzione della proteina

Denaturazione delle proteine: un fatto“sperimentale” ma anche un processo fisiologico

La perdita della struttura tridimensionale viene detta DENATURAZIONE

- tiene conto delle relazioni a lungo raggio nella sequenza amminoacidica

- È definita dalle interazioni tra le catene laterali degli amminoacidi lontani tra di loro

STRUTTURA TERZIARIA

= DISPOSIZIONE NELLO SPAZIO DEGLI ATOMI DI UNA PROTEINA

La struttura terziaria rappresenta la conformazione tridimensionale degli atomi che compongono una proteina di sequenza definita

(585 aa, 64.5 kDa)Albumina

Struttura terziaria delle proteine

Proteine GLOBULARI : catene ripiegate con conformazione sferoidale (combinazioni multiple di strutture secondarie)

1) legami NON covalenti-legami ionici-interazioni idrofobiche-legami ad idrogeno-interazioni di van der Waals

2) Legami covalenti-ponti disolfuro S-Stra residui di cisteina(in alcune proteineextracellulari)

La struttura III è stabilizzata da:

Avviene a seguito dell’ossidazione dei gruppi SH di due Cys vicinali (non necessariamente contigue)

Durante il ripiegamento le proteine formano spesso ponti disolfuro non presenti nelle proteine native, che poi si trasformano in quelli corretti mediante interscambio di ponti disolfuro

PDI : Protein disolfuro isomerasi

Le proteine possono essere classificate in due gruppi principali:

-Proteine fibrose : le catene polipeptidiche sono disposte in lunghi fasci o foglietti

-Proteine globulari: le catene polipeptidiche sono ripiegateed assumono forme globulari o sferiche

Insolubili in acquaHanno di solito struttura secondariaTipiche dei tessuti connettivi Ruolo strutturale

Solubili in acquaHanno struttura terziariaProteine cellulariEnzimi e proteine regolatrici

La catena polipeptidica si ripieganelle regioni dovenon c’è struttura II

Dalla sequenza amino acidica si può predirrefacilmente dove ci saranno i ripiegamenti (random coil),

Favoriscono il ripiegamento:Pro

Glu / Lys vicinaliTrp vicinali

La struttura globulare origina se la struttura II si ripiega:

l’interno diventa idrofobico mentre all’esterno sono esposti a.a. polari che rendono solubile la proteina.

MOTIVO (o struttura supersecondaria o ripiegamento)

Avvolgimento polipeptidico caratteristico formato da uno o più elementi di struttura secondaria e da elementi di connessione

DOMINI

Nelle proteine più grandi, specie in quelle globulari, si riconoscono delle porzioni, definite domini, con specificità strutturale e funzionale

I domini sono unità strutturali indipendenti ognuna delle quali ha le caratteristiche di una piccola proteina globulare

Combinando strutture II diverse (a elica, foglietto e random coil)

è possibile creare diverse forme nello spazio

Diverse strutture funzionali

Fare molte proteine diverse

In realtà ci sono domini strutturali comuni

Esempio: gliceraldeide 3 fosfato deidrogenasi

Ripiegamento di Rossman:lega il dinucleotide NAD+

Dominio che lega la gliceraldeide 3 fosfato

Structural classification of proteins (SCOP)

Le strutture delle proteine sono divise in 4 classi principali:

tutto atutto

a/a +

http://scop.mrc-lmb.cam.ac.uk/scop

Proteine con somiglianze significative nella struttura primaria/terziaria e nella funzione sono raggruppate in una stessa FAMIGLIA di PROTEINE

Proteine “tutte alfa”

Proteine “tutte beta”

Proteine “alfa/beta”(con strutture a e alternate)

Proteine “alfa + beta”(con strutture a e distanziate)

Le proteine si ripiegano spontaneamente nella loro conformazione nativa in condizioni fisiologiche

E’ la struttura primaria delle proteine a determinarne la struttura

3-D

1950: C. AnfinsenRIBONUCLEASI

Trattamento con agenti denaturanti

Avvolgimento casuale,proteina ridottaNo attività enzimatica

Se rimossi: la ribonucleasiriacquistava l’attività enzimatica

Simulazione al computer di una via di ripiegamento di un dominio di 36 amminoacidi della villina

In realtà molte proteine necessitano di un “aiuto” per il correttoripiegamento in vivo

I chaperoni molecolari sono delle proteine specializzate

Ripiegamento “assistito”

Hsp70 : si legano a regioni di polipepetidi non ripiegate e ricche di residui idrofobici impediscono aggregazioni improprie

Chaperonine : complessi proteici sofisticati necessari per il ripiegamento di alcune proteine cellulari che non si organizzano spontaneamenteIn E. coli sistema GroEL/GroES

I difetti di ripiegamento delle proteine danno origine a numerose patologie

Es. malattie neurodegenerative

Una proteina solubile viene secreta da una cellula con un avvolgimento sbagliato e convertita in una fibra extracellulare insolubile amiloide

Es. proteina amiloide nella malattia di Alzheimer

Formazione di aggregati di proteine con avvolgimenti sbagliati

Es. a-sinucleina nel morbo di Parkinson oppure huntingtina nella corea di Huntington

Ripiegamento (folding)e maturazione delle proteine

(modifiche post-traduzionali)

Proteolisi

Glicosilazione

Molto di frequente, le proteine a struttura IIIhanno incorporato un gruppo

-essenziale per la loro funzionalità biologica –di natura non proteica (gruppo prostetico o coenzima)

PROTEINE CONIUGATE

Parte proteica (apoproteina):-impedisce l’ossidazione irreversibile del Fe2+

-rende possibile un legame reversibile dell’O2 all’eme-modula la funzione del gruppo eme

Eme:-struttura organica ad anello,-contiene un atomo di ferro, sito di legame per l’ossigeno-inserito in una tasca idrofobica della proteina (che impedisce l’ossidazione del Fe2+)

Mioglobina: parte proteica + parte non proteica

153 a.a. 1 eme

struttura compatta: 80% a elica, 20% random coil

assenza di Cys gli a.a. esterni e nelle anse sono polari

(Glu, Asp, Asn, Lys, Arg) gli a.a. interni sono prevalentemente apolari,

con due His (F8/E7) cruciali per legare l’O2

MioglobinaPresente nei muscoli di tutti i mammiferi

8 segmenti maggiori (A-H) ad a elica 7 segmenti non elicoidali

(AB, CD etc) 4 eliche terminano con Pro

Per funzionare correttamente, il Fe deve sempre stare

nello stato ridotto 2+ (II)

Il Fe ha sei legami di coordinazione:

4 con gli N degli anelli pirrolici 2 perpendicolari all’eme, di cui

uno lega l’His prossimale F8l’altro è libero oppure lega l’O2

L’ambiente idrofobico proteico impedisce che avvenga

l’ossidazione irreversibiledel Fe quando lega l’O2

His E7= istidina distale(forma un legame H con l’O2)

His F8= istidina prossimale(5a posizione di coordinazione del Fe)

Val e Phe (aa con catena laterale idrofobica)Mantengono in posizione l’eme

Alcune proteine sono intrinsecamente non strutturateIUP= Intrinsecally Unstructured Proteins

Non possiedono proprietà strutturali uniformiNon possiedono un struttura ripiegata Hanno una conformazione estesa ed elevata flessibilità intramoleclare

Tipica combinazione di aa che conferisce una carica netta e bassa idrofobicità

Alti livelli di E;K;R; G;Q;S e PBassa quantità di I;L;V;W;F;Y;C e N

2% negli Archea4,2 % nei batteri33% negli eucarioti

La % delle proteine che contengono lunghe regioni disordinate aumenta nel corso della evoluzione

Vantaggio: sono più malleabili

possono legare più ligandi adattando la loro strutturaConsentono un’interazione più estesa con altre proteine

Alcune proteine non strutturate ( in giallo e in rosso)legano i loro targets (in azzurro)avvolgendosi

intorno

Struttura quaternaria (IV)

Alcune proteine sono formate da più subunità, cioè da più catene polipeptidiche uguali o diverse tra di loro.

Tali proteine sono dette proteine oligomeriche.

La struttura quaternaria descrive l’assemblaggio delle diverse subunità.

STRUTTURA QUATERNARIA

MIOGLOBINA EMOGLOBINA

Le subunità sono legate con: -interazioni idrofobiche-interazioni elettrostatiche-legami H.

2 subunità tipo a (di 141 a.a.)2 subunità tipo (di 146 a.a.)

1a1

2 a2

Ciascuna subunità ha un gruppo eme

Quindi, invece che una solamolecola come nella mioglobina

Mb + O2 MbO2

l’emoglobina lega quattro molecole di O2Hb + 4O2 Hb(O2)4

L’Emoglobina funziona come un assemblaggio di quattro subunità (e quattro gruppi eme)

Funzionalmente l’Hb opera però più come due metà (a1 1, a2 2),

saldamente accoppiate attraverso legami idrofobici, H e salini

È contenuta negli eritociti