Biofisica

L’analisi informatica per la comprensione della struttura e funzione delle proteine: le SIMULAZIONI AL CALCOLATORE

Di che cosa trattiamo?

Alcuni cenni sulla struttura delle PROTEINE

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La struttura delle biomolecole è un argomento di grande interesse per molti settori della ricerca di base e applicativa

STRUTTURA

Funzione

Meccanismo

Origine/Evoluzione

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La FISICA fornisce metodi computazionali e approcci sperimentali molto potenti per indagare la struttura delle macromolecole biologiche.

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Le più importanti tecniche sperimentali e teoriche per l’analisi

delle strutture di macromolecole

Microscopie

Simulazioni al computer di dinamiche molecolare e interazioni molecolari

Spettroscopie

Difrattometria ai raggi X

Modellistica molecolare

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Le proteine e gli acidi nucleici sono polimeri

Le macromolecole sono costruite collegando insieme unità strutturali definite MONOMERI

Proteine

20 amminoacidi

4 basi nucleotidiche

Acidi nucleici

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LE PROTEINE (dal greco protos: principale) SONO LE MACROMOLECOLE PIU’ ABBONDANTI E SVOLGONO SVARIATE FUNZIONI, ad es.:

La proteina cheratina è il componente

strutturale dei capelli, squame,

corna, lana, unghie etc.

La luce prodotta dalle lucciole coinvolge la

proteina luciferina;

Gli eritrociti contengono la

proteina emoglobina che

trasporta l’ossigeno;

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Contengono 20 amminoacidi uniti tramite un legame “peptidico”covalente

Il legame peptidico

Amminoacido

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La sequenza degli amminoacidi costituisce la struttura primaria

Ogni pallina corrisponde ad un amminoacido

Ribonucleasi: Mr 17000 da, 124 aa., secreta dal pancreas.Catalizza l’idrolisi di acidi nucleici ingeriti con la dieta

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Le proteine hanno diversi livelli di struttura

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Molte malattie sono dovute al difettoso ripiegamento di una

proteina

Alcune patologie derivano da proteine che non sono in grado di raggiungere la loro struttura funzionale e che tendono a formare grossi aggregati (fibrille o forme amiloidi): Alzheimer, Parkinson, encefalopatia spongiforme, diabete di tipo II.

In altri casi mutazioni puntiformi generano proteine che non raggiungono la loro locazione finale o che non sono più in grado di svolgere la loro funzione perché incapaci di legare i loro substrati.

Fibrosi cistica: difetto nella proteina transmembrana che agisce come un canale degli ioni cloro nelle cellule epiteliali (CFTR: 1480 amminoacidi). La mutazione più comune è la delezione di un amminoacido (Phe 508) e la proteina mutata non si avvolge correttamente.

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Il problema del “folding”: che cosa determina la struttura tridimensionale

delle proteine?

In genere la sequenza amminoacidica contiene la informazione completa per il raggiungimento della struttura funzionale

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DETERMINAZIONE DELLA STRUTTURA TRIDIMENSIONALE

DELLE MACROMOLECOLE BIOLOGICHE A LIVELLO ATOMICO

= determinare le coordinate spaziali xyz per ogni singolo atomo, ovvero le posizioni reciproche degli atomi nello spazio

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TECNICHE SPERIMENTALI

X-ray crystallography(Kendrew and Perutz - 1961)

Diffrazione di raggi X incidenti su cristalli di biomolecole -> dipende dalla spaziatura tra gli atomi

NMR spectroscopy(Ernst and Wuthrich - 1983)

Assorbimento di radio frequenze da parte di biomolecole (solo certi tipi di nuclei) IN SOLUZIONE e immerse in un campo magnetico -> dipende dall’intorno del nucleo

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NMR Raggi X

Con NMR si ottengono delle famiglie di strutture: si hanno informazioni sulla mobilità delle porzioni di macromolecola, ma in molti casi il

risultato finale è molto simile

Mioglobina

Confronto NMR - diffrazione ai raggi X

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TECNICHE COMPUTAZIONALI

L’utilizzo COMPLEMENTARE di tecniche di tipo sperimentale e di tipo

computazionale è l’approccio ottimale per lo studio dei sistemi e dei processi

biologici.

I limiti dell’una sono infatti superati dall’altra

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Limiti delle tecniche sperimentali

risoluzione SPAZIALE misure ad alta risoluzione di strutture molecolari sono possibili solo per sistemi relativamente rigidi

risoluzione ENERGETICA analisi delle energie di interazione atomica difficoltosa

risoluzione TEMPORALE i primissimi eventi dei processi biologici sono di difficile misurazione

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Limiti delle tecniche computazionali

Sistemi biomolecolari troppo complessi si devono utilizzare approssimazioni

Simulazione del comportamento nel tempo di un sistema molecolare su un computer solo un numero limitato (<NA) atomi o di gradi di libertà (di solito 102-105 atomi), per un limitato periodo di tempo (103-104 picosecondi) può essere simulato piccoli sistemi, con tempi di rilassamento brevi e/o utilizzo dei dati sperimentali per restringere il numero di conformazioni possibili

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Alcune Applicazioni

MODELLIZZARE la struttura tridimensionale a risoluzione atomica della molecola

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Effettuare MUTAZIONI puntiformi, che possono fornire indicazioni utili per il riconoscimento del sito attivo o di strutture indispensabili all'attività della molecola o dirette ad una certa funzione.

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Studiare le VARIAZIONI CONFORMAZIONALI provocate dall’interazione della proteina con uno o più LIGANDI, la quale fornisce l’attivazione (o inattivazione) necessaria per compiere la propria funzione biologica (o per impedirla).

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Monitorare i CAMBIAMENTI STRUTTURALI indotti su peptidi o proteine da parte di MEMBRANE BIOLOGICHE, i quali sembrano essere fondamentali per il riconoscimento con il recettore o per oltrepassare la fase lipidica e raggiungere zone altrimenti inaccessibili.

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Comprendere il processo di FOLDING delle proteine, ovvero il meccanismo di ripiegamento con cui raggiungono la confomazione biologicamente attiva.

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Applicazioni FARMACOLOGICHE: viene fornita un’indicazione specifica, o quanto meno restrittiva, della struttura opportuna in funzione del bersaglio del farmaco. In questo campo, la costruzione di strutture calibrate permette di ridurre la ricerca ad un ristretto raggio d’azione.

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Ipotesi termodinamica di Anfinsen (per proteine a singolo dominio)

L’informazione codificata nella sequenza amminoacidica di una proteina determina completamente la sua struttura nativa

Lo stato nativo è il minimo assoluto dell’energia libera della proteina

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che viene usata come STAMPO.

Permette di costruire la struttura tridimensionale di

una proteina

sulla base della SIMILARITÀ DI SEQUENZA con un’altra proteina

di struttura NOTA

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Si basa sulle seguenti osservazioni:

le proteine appartengono ad un numero limitato di famiglie strutturali

proteine della stessa famiglia hanno strutture tridimensionali molto simili

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E’ molto importante l’allineamento di sequenza con la proteina “stampo”

4mdh.aa 1 SEPIRVLVTG AAGQIAYSLL YSIGNGSVFG KDQPIILVLL DITPMMGVLD 11BMD 1 KAPVRVAVTG AAGQIGYSLL FRIAAGEMLG KDQPVILQLL EIPQAMKALE *.** *** *****.**** . *. * ..* ****.** ** .* * *. 4mdh.aa 51 GVLMELQDCA LPLLKDVIAT DKEEIAFKDL DVAILVGSMP RRDGMERKDL 11BMD 51 GVVMELEDCA FPLLAGLEAT DDPDVAFKDA DYALLVGAAP RKAGMERRDL **.***.*** .*** . ** * ..**** * *.***. * *. ****.** 4mdh.aa 101 LKANVKIFKC QGAALDKYAK KSVKVIVVGN PANTNCLTAS KSAPSIPKEN 11BMD 101 LQVNGKIFTE QGRALAEVAK KDVKVLVVGN PANTNALIAY KNAPGLNPRN * * *** ** ** ** * ***.**** ***** * * *.**.. * 4mdh.aa 151 FSCLTRLDHN RAKAQIALKL GVTSDDVKNV IIWGNHSSTQ YPDVNHAKVK 11BMD 151 FTAMTRLDHN RAKAQLAKKT GTGVDRIRRM TVWGNHSSTM FPDLFHAEVD *. .****** *****.* * * * .. . .******* .**. ** * 4mdh.aa 201 LQAKEVGVYE AVKDDSWLKG EFITTVQQRG AAVIKARKLS SAMSAAKAIC 11BMD 201 GRP----ALE LVDME-WYEK VFIPTVAQRG AAIIQARGAS SAASAANAAI .. * * . * ** ** *** **.* ** * ** ***.* 4mdh.aa 251 DHVRDIWFGT PEGEFVSMGI ISDGNSYGVP DDLLYSFPVT IKDKTWKIVE 11BMD 246 EHIRDWALGT PEGDWVSMAV PSQGE-YGIP EGIVYSFPVT AKDGAYRVVE .*.** .** ***. ***.. *.*. **.* . ..****** ** . ..** 4mdh.aa 301 GLPINDFSRE KMDLTAKELA EEKETAFEFL SSA 11BMD 295 GLEINEFARK RMEITAQELL DEMEQVKALG LI ** **.*.* .*..** ** .*.* .

* aa identici. aa simili

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Dopodichè si procede con…

…la costruzione dello scheletro…

…l’inserimento delle catene laterali…

…l’inserimento dei loop corrispondenti a “buchi” nell’allineamento…

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…l’ottimizzazione del modello..

…e il controllo della sua qualità

…per concludere con…

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HEADER OXYGEN TRANSPORT 22-JAN-98 1A3N TITLE DEOXY HUMAN HEMOGLOBIN COMPND MOL_ID: 1; COMPND 2 MOLECULE: HEMOGLOBIN; COMPND 3 CHAIN: A, B, C, D; COMPND 4 BIOLOGICAL_UNIT: ALPHA-BETA-ALPHA-BETA TETRAMER SOURCE MOL_ID: 1; SOURCE 2 ORGANISM_SCIENTIFIC: HOMO SAPIENS; SOURCE 3 ORGANISM_COMMON: HUMAN; SOURCE 4 TISSUE: BLOOD; SOURCE 5 CELL: RED CELL KEYWDS OXYGEN TRANSPORT, HEME, RESPIRATORY PROTEIN, ERYTHROCYTE EXPDTA X-RAY DIFFRACTION AUTHOR J.TAME,B.VALLONE REVDAT 1 29-APR-98 1A3N 0 REMARK 1 REMARK 2 REMARK 2 RESOLUTION. 1.8 ANGSTROMS. REMARK 3

Esempio: Deossiemoglobina umana (1a3n)

[…]

http://www.rcsb.org/pdb

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ATOM 1 N VAL A 1 10.720 19.523 6.163 1.00 21.36 N

ATOM 2 CA VAL A 1 10.228 20.761 6.807 1.00 24.26 C

ATOM 3 C VAL A 1 8.705 20.714 6.878 1.00 18.62 C

ATOM 4 O VAL A 1 8.164 20.005 6.015 1.00 19.87 O

ATOM 5 CB VAL A 1 10.602 22.000 5.966 1.00 27.19 C

ATOM 6 CG1 VAL A 1 10.307 23.296 6.700 1.00 31.86 C

ATOM 7 CG2 VAL A 1 12.065 21.951 5.544 1.00 31.74 C

ATOM 8 N LEU A 2 8.091 21.453 7.775 1.00 16.19 N

ATOM 9 CA LEU A 2 6.624 21.451 7.763 1.00 17.31 C

ATOM 10 C LEU A 2 6.176 22.578 6.821 1.00 18.55 C

ATOM 11 O LEU A 2 6.567 23.730 7.022 1.00 18.72 O

ATOM 12 CB LEU A 2 6.020 21.707 9.129 1.00 18.34 C

ATOM 13 CG LEU A 2 6.386 20.649 10.198 1.00 17.39 C

ATOM 14 CD1 LEU A 2 5.998 21.119 11.577 1.00 17.99 C

ATOM 15 CD2 LEU A 2 5.730 19.337 9.795 1.00 16.96 C

ATOM 16 N SER A 3 5.380 22.237 5.852 1.00 15.02 N

ATOM 17 CA SER A 3 4.831 23.237 4.928 1.00 16.59 C

ATOM 18 C SER A 3 3.725 24.027 5.568 1.00 14.84 C

ATOM 19 O SER A 3 3.095 23.717 6.591 1.00 14.40 O

ATOM 20 CB SER A 3 4.308 22.429 3.727 1.00 16.47 C

ATOM 21 OG SER A 3 3.076 21.786 3.991 1.00 14.91 O

…

X Y Z

coordinatetipo diatomo

tipo diamminoacido

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1a3n

Deossiemoglobina catena A

C

O

N

S

EME

Fe

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http://www.umass.edu/microbio/rasmol/index2.htm

RASMOL v 2.7

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e il RICONOSCIMENTO MOLECOLARE (DOCKING).

Comprende tecniche come:

la RICERCA DEL MINIMO DELL’ENERGIA CONFORMAZIONALE,

la DINAMICA MOLECOLARE,

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Ad ogni conformazione molecolare è associata unaENERGIA POTENZIALE

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La forma più semplice DELL’ENERGIA POTENZIALE di una molecola è :

ENERGIA pot =Energia di ALLUNGAMENTO dei legami

+ Energia di PIEGAMENTO degli angoli dilegame

+ Energia di TORSIONE degli angoli diedri

+ Energia delle interazioni di NON-LEGAME: repulsioni steriche, interazioni di Van der Waals, interazioni elettrostatiche

bending

stretching

torsion

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Ipotesi termodinamica di Anfinsen (per proteine a singolo dominio)

L’informazione codificata nella sequenza amminoacidica di una proteina determina completamente la sua struttura nativa

Lo stato nativo è il minimo assoluto dell’energia libera della proteina

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Termodinamica del folding visto come imbuto di energia liberaSi raggiunge il

minimo energetico assoluto percorrendo anche strade diverse

Ogni minimo relativo corrisponde a stati intermedi metastabili

Le interazioni idrofobiche di residui non polari provocano il “collasso idrofobico”

Scendendo verso il basso si ha una diminuzione delle specie

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Strategie di ricerca del minimo assoluto

Esistono metodi computazionali di ricerca del minimo assoluto che implicano il campionamento dello spazio conformazionale:-il campionamento energetico sistematico-l’annealing simulato-la ricerca casuale

enorme onere computazionale

utilizzabili solo per peptidi corti

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Permette lo studio di processi dinamici complessi che avvengono nei sistemi biologici. Studia sia transizioni

conformazionali che vibrazioni locali, ad esempio:

stabilità delle proteine

variazioni conformazionali

folding proteico

trasporto ionico

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Calcola la TRAIETTORIA di un sistema molecolare

= la configurazione molecolare in funzione del

tempo, ovvero come variano nel tempo le posizioni,

le velocità e le accelerazioni degli atomi della

molecola.

La traiettoria è generata da integrazioni simultanee dell’ equazione del moto di Newton

Fi = mi ai

per tutti gli atomi del sistema molecolare

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3. delle accelerazioni : sono determinate da una relazione che lega la forza che agisce su un atomo all'energia potenziale.

Per calcolare una traiettoria c'è bisogno:

1. delle posizioni inziali ri : si ricavano da strutture sperimentali (cristallografia raggi X, NMR ecc.) o ottenute con modeling;

2. delle velocità iniziali vi : si ottengono dalla distribuzione delle velocità alla temperatura assegnata;

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Struttura iniziale

rimuove interazioni di Van der Waals forti che porterebbero a distorsioni locali

nel caso si usi un solvente esplicito, aggiungere le molecole d’acqua

per equilibrarlo con la struttura

la simulazione prosegue finchè sono stabili nel tempo la struttura, la pressione, la temperatura (si riscalano le velocità), l'energia

Fase di simulazione vera e propria

Minimizzazione dell’ energia

Solvatazione della proteina

Minimizzazione dell’ energia in presenza

del solvente

Fase di riscaldamento

Fase di equilibrazione

si lancia la MD con velocità iniziali a bassa temperatura nuove velocità riassegnate periodicamente a T leggermente più alta e così via fino al raggiungimento della T di simulazione desiderata.

Protocollo di simulazione

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Analisi dei risultati

Campionamento periodico di coordinate (e velocità)

Calcolo dell’energia potenziale media in funzione del tempo

Calcolo della differenza con la struttura di partenza in

funzione del tempo

Calcolo della superficie accessibile al solvente e del

raggio di girazione, in funzione del tempo

Calcolo della struttura media

0 500 1000 1500 2000-900

-800

-700

-600

-500

-400

-300

-200

-100

0

100

200

Ene

rgia

pot

enzi

ale

(Kca

l/mol

)

tempo (ps)

Residue number10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130

100ps

200ps

300ps

400ps

500ps

600ps

700ps

800ps

900ps

1000ps

1100ps

1200ps

1300ps

1400ps

1500ps

1600ps

1700ps

media

-helix

-strand

S1 H1 H2 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10

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Riconoscimento molecolare

E’ il punto di partenza per quasi tutti i processi biologici. Le molecole interagiscono in una maniera altamente specifica: modello CHIAVE-SERRATURA (Fisher e Ehrilch)

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La complementarità geometrica e chimica fra piccole molecole biologiche (LIGANDI) e le strutture dei loro bersagli macromolecolari (RECETTORI) gioca un ruolo molto importante all’interno dei processi biologici.

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La capacità di un recettore di agganciarsi al suo ligando selettivamente e con alta affinità è dovuta alla formazione di una serie di legami deboli (legami H, ionici, interazioni di Van der Waals) sommati ad interazioni favorevoli (es. idrofobiche).

Gli atomi del sito di legame forniscono l’impalcatura necessaria per conferire alla superficie un dato contorno e particolari proprietà chimiche

Variazioni anche piccole di tali amminoacidi spesso compromettono la funzionalità del recettore

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Metodi computazionali per la predizione della struttura 3D di complessi proteina-ligando.

Insieme di tecniche che consentono di simulare interazioni tra vari sistemi (sito attivo di un enzima e una nuova molecola di inibitore) e di valutare approssimativamente le nuove interazioni che si creano.

docking

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In quest’ultimo caso, viene trovato il corretto modo di legame di un composto tramite il campionamento dello spazio conformazionale nel sito di legame, attraverso la valutazione di funzioni che stimano l’energia di ogni combinazione confomazionale ligando-recettore.

Tali funzioni valutano fattori quali:

•Complementarità fra superficie

•Interazioni elettrostatiche e idrofobiche

•Energia libera di solvatazione

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AUTODOCK, DOCK, FlexX, GOLD, GRID…AUTODOCK, DOCK, FlexX, GOLD, GRID…

Algoritmi di docking.

Posizionano ligandi - rigidi o flessibili - in siti di binding proteici generalmente rigidi.

algoritmi

Prendendo in considerazione anche la flessibilità del recettore allora andrebbero considerati centinaia o anche migliaia di gradi di libertà.

Il ligando durante il binding cambia la sua struttura tridimensionale in termini di angoli di torsione per trovare il miglior adattamento spaziale ed energetico nel sito di binding della proteina. Questa assunzione segue il modello “chiave-serratura” citato in precedenza.

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Elemento chiave: scoperta di composti guida nuovi e innovativi

Composto guida = composto che mostra affinità per un dato recettore, che ha attività biologica e che può essere strutturalmente modificato per migliorare la

bioattività

farmaci

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1. Ricerca del composto guida (1-2 anni)2. Ottimizzazione del composto guida (1-2 anni)3. Saggi di attività in vitro e in vivo (1-2 anni)4. Test tossicologici (1-3 anni)5. Test per la sicurezza sull’uomo (1 anno)6. Test per l’efficacia sull’uomo (1-2 anni)

tempi per lo sviluppo di un nuovo farmaco

è di grande importanza l’identificazione RAPIDA E AFFIDABILE di ligandi ad alta affinità

Tempo totale per lo sviluppo di un nuovo farmaco: 6-12 anni

Costo totale: circa $ 500 000 000

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Screening sperimentale:

test in vitro di grandi librerie di composti. Ignora, in genere, le

proprietà strutturali del recettore

Metodi computazionali

detti Rational Design:si basano su informazioni strutturali del

recettore e/o del ligando

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Metodi computazionali

Struttura 3D del recettore NON nota Struttura 3D del recettore nota

Structure Based Drug DesignQSAR (Quantitaive Structure-Activity

Relationship)Stabilisce una relazione tra la struttura molecolare e l’attività biologica di una serie di composti attivi. Predice la attività e la affinità di composti non noti dall’analisi delle similitudini e differenze strutturali con composti noti, fornendo anche informazioni sui requisiti strutturali del recettore.

De Novo DesignI nuovi composti vengono generati

nel sito di legame a partire da atomi o

frammenti preposizionati nel

sito e che successivamente

vengono trasformati in

molecole intere da softwares specifici.

Screening VirtualeLibrerie di molecole

(esistenti o ipotetiche) vengono analizzate

cercando ligandi con caratteristiche in

accordo con i requisiti del sito di legame

Docking

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Le tecniche computazionali rappresentano uno strumento molto utile per:•la modellazione di sistemi proteici•la comprensione dei processi biologici•la comprensione della relazione struttura-attività•la scoperta e ottimizzazione dei composti guida farmacologici

Vantaggio dal punto di vista biologico, chimico e farmaceutico, riducendo i tempi e completando e

indirizzando le conoscenze sperimentali