Il Sistema Immunitario -...

Il Il SistemaSistema

ImmunitarioImmunitario

SARS virus

Parassiti nei globuli rossi

Fungi

Batteri

Patogeno è qualsiasi organismo dotato del potenziale di provocare una malattia.Divisi in 4 categorie:

batteri, funghi, virus, parassiti

Patogeno opportunista: colonizza l’organismo senza provocare una malattia.Può divenire patogeno se le difese sono indebolite.

L’organismo reagisce all’invasione di un patogeno con duetipi di risposta:

-Risposta immunitaria innata

-Risposta immunitaria acquisita>umorale (cellule B , anticorpi)

>cellulo-mediata (cellule Tc e Th)

Il Sistema immunitario deve essere in grado didisitinguere il self dal non-self (tolleranza verso il self)

innata acquisita

• aspecifica

• riconosce strutture comuni

• sempre operativa

• sempre uguale

• previene l’infezione

• specifica

• riconosce strutture

specifiche

• consegue al contatto

• potenziata da contatti

ripetuti

• richiede l’infezione

IMMUNITA’

IMMUNITA’ INNATA• Comprende 4 tipi di barriere:

– Anatomica• Cute

• Superficie delle mucose

– Fisiologica• Temperatura

• pH

• Fattori solubili

– Endocitica/fagocitica• fagocitosi

– Infiammatoria• Complesso Risposta infiammatoria

Cute: -barriera meccanica ritarda l’ingresso dei microbi- l’ambiente acido(pH 3-5) ne ritarda la crescita

Mucose: - la flora normale compete con i microbi per i siti di attacco e i nutrienti-il muco intrappola i microrganismi interi- Le ciglia spingono i microrgansimi fuori dal corpo

Temperatura: -la normale t inibisce la crescita di alcuni patogeni-la febbre inibisce la crescita di alcuni patogeni

pH: - l’acidità gastrica uccide la maggior parte dei patogeni ingeriti

Mediatori chimici: -lisozima scinde la parete batterica-interferone induce uno stato antivirale nelle cellule infettate

- Il sistema del complemento lisa i mocrorganismi e facilita la fagocitosi

• 1-2 adesione del batterio a lunghe evaginazioni della membrana(pseudopodi)

• 3- ingestione del batterio con formazione del fagosoma che si muoveverso il lisosoma

• 4- fusione del fagosoma e lisosoma con rilascio di enzimi lisosomiali nelfagosoma

• 5- digestione del materila ingerito• 6- rilascio di prodotti di digestione della cellula

Fagocitosi

Il danno tissutale provoca il rilascio di vari fattori vasoattivi e chemiotattici. Questi fattori inducono aumento del flusso sanguigno nell’area, aumento della permeabilità capillaree afflusso dei globuli bianchi, tra cui fagociti e linfociti.

Le proteine seriche contenute nell’essudato hanno proprietà antibatteriche e i fagociti incominciano a fagocitare i batteriTra i principali mediatori chimici ci sono: proteine della fase acuta

istaminachinine

INFIAMMAZIONE

Il Sistema immunitario: meccanismi di base

Componenti del sistema immunitario: organi linfatici e leucociti.

Organi linfatici: i leucociti si sviluppano fino alla maturità negli organi linfatici PRIMARI (il midollo osseo e nel caso dei linfociti T, il timo). Gli organi linfatici periferici mostrano un’architettura reticolare che intrappola materiale estraneo presente nel sangue (milza), nella linfa (linfonodi), nell’aria (tonsille e adenoidi) e in cibo e acqua (appendice vermiforme e placche di Peyer nell’intestino).

Leucociti: si dividono in neutrofili, monociti e macrofagi (dai monociti), cellule fagocitarie che “inglobano e distruggono” agenti estranei e detriti; gli eosinofili ed i basofili proteggono invece dai grandi parassiti e sono coinvolti nelle reazioni allergiche.

Linfociti: si dividono in B (cellule B) e T (cellule T), specifici rispetto agli agenti esterni. Ilinfociti non B e non T sono “natural killer (NK)” antivirali.

Organi del Sistema immunitario

Tonsille e adenoidi

Linfonodi

Midollo osseo

Appendicite

Vasi linfatici

Linfo nodi

Timo

Placche di Peyer

Milza

Vasi linfatici

Linfonodi

CELLULE

Cellule della linea linfatica

• Linfociti sono il 20-40% dei globuli bianchi e 99% delle cellule presenti nella linfa

• Nel corpo umano ci sono circa 1011 linfociti

• Circolano nel sangue e nella linfa e possono migrare nei diversi tessuti e organI linfatici

• Si dividono in – Linfociti B– Linfociti T– Linfociti null (cellule natural Killer)

Linfociti B• Maturano nel midollo osseo

• Esprimono sulla superficie un recettore (Ab) specifico per un antigene (Ab=antibody anticorpo)

• Dopo l’incontro con l’Ag maturano e si differenziano in Linfociti B della memoria e linfociti effettori (plasmacellule)

• Linfociti B della memoria esprimono lo stesso Ab delle cellule progenitrici

• Una plasmacellula sercerne più di 2.000 Ab al secondo

• Le plasmacellule muoiono in 1-2 settimane

Cellule T• Nascono nel midollo osseo e maturano nel timo

• Durante la maturazione esprimono sulla membrana uno specifico recettore per l’Ag: recettore del linfocita T (T cell receptor TCR)

• TCR riconosce Ag solo se è legato a proteine MHC, glicoproteine polimorfiche, presentate da altre cellule

• Ci sono 2 sottopopolazioni di linfociti T:– T helper (TH)

– Th1 e Th2

– T citotossiche (Tc) o killer

Zap 70

fyn lck

γγγγ εεεε

ζζζζ

Vββββ Vαααα

Cββββ Cαααα

CH1

CH2

CH3

CH2

CH3

CH1

CL CL

VL VL

VH VH

εεεε δδδδ

ζζζζ

Igα/Ιgβ Igα/Ιgβ

Blk, Fyn or Lyn

RECETTORE CELLULE B RECETTORE CELLULE T

• Antigeni sono sostanze in grado di indurre una risposta immunitaria

• Ci sono differenze fondamentali nel modo in cui i linfociti B e T riconoscno l’Ag

• Immunogenicità e antigenicità sono due propietàimmunologiche correlate, ma distinte

• Un antigene è un immunogeno e l’antigenicità è la sua capacità di reagire in maniera specifica con i prodotti finali delle risposte immuni

• "TUTTI GLI IMMUNOGENI SONO

ANTIGENI, MA NON TUTTI GLI

ANTIGENI SONO IMMUNOGENI".

APTENE: molecola solitamente di piccole dimensioni che hanno la proprietà di essere antigeniche, ma che di per sé non è in grado di evocare una risposta immunitaria (sono prive di immunogenicità).

Può diventare anche immunogenica se si lega a una molecola carrier.Può reagire con i prodotti di una risposta immune specifica.

EPITOPO O DETERMINANTE ANTIGENICO:

PARTE DI UN ANTIGENE CHE ENTRA IN CONTATTO CON IL SITO DI LEGAME DI UN ANTICORPO O COL RECETTORE PER L’Ag DELLE CELLULE T o B. (GLI EPITOPI SONO PRATICAMENTE LE PORZIONI PIÙIMPORTANTI DELL’ANTIGENE, CAPACI DI EVOCARE

LA RISPOSTA IMMUNITARIA).

Quando i farmaci diventano immunogeni

• I farmaci sono piccole molecole incapaci di scatenare la risposta immunitaria se non sono associate a una molecola più grande

• La penicillina in alcuni individui può reagire con alcune proteine dell’organismo per formare un derivato penicilloil-proteina (aptene-vettore), in cui il derivato penicillinico, il gruppo penicilloil, ha la funzione di epitopoaptenico

• Questo epitopo è riconosciuto dal sistema immunitario che produce Ab(IgE) contro di esso. Le IgE vengono trasportate in tutto l’organismo dove vengono riconosciute dai recettori per le IgE posti sui basofili (mast-cellule) e rimanere per molto tempo. Se a una persona che ha anticorpi IgE contro la penicillina viene somministrata penicillina, andrà incotro a reazione allergica

• 1-5% della popolazione ha questo problema

SISTEMA IMMUNITARIO ACQUISITO

Sistema immunitario specifico

LinfocitiLinfociti::

1.1.LinfocitiLinfociti TT

2.2.LinfocitiLinfociti BB

Origine

• La selezione clonale dei linfociti B e linfociti T è alla base della risposta innata

• Sia i linfociti B che T esprimono recettori dotati di una singola specificità

– Linfociti B esprimono immunogobuline (Anticorpi, Ab)

– Linfociti T esprimono recettori

• Ciascun linfocita da origine a un unico tipo di molecola

• Ciascun linfocita, stimolato dal patogeno da origine a una popolazione di cellule che esprimono tutte immunoglobuline o recettori delle cellule T identici (SELEZIONE CLONALE)

Zap 70

fyn lck

γγγγ εεεεζζζζ

Vββββ Vαααα

Cββββ Cαααα

CH1

CH2

CH3

CH2

CH3

CH1

CL CL

VL VL

VH VH

εεεε δδδδζζζζ

Igα/Ιgβ Igα/Ιgβ

Blk, Fyn or Lyn

Ogni linfocita B esprimesulla membrana 150.000 Anticorpi (recettori) identici per lostesso Ag

Esempio: SELEZIONE CLONALE nei linfociti B

Antibody Molecule Structure

Heavy Chain

Light Chainglobulardomainsdisulfide

bonds

h

CH1

CH

2C

H3

VH

CL

VL

C terminalend

N terminalend

Ag bindingregion

CHO

Ag

= Y

• 2 catene leggere identiche (L, light, 220 aminoacidi)• 2 catene pesanti identiche (H, heavy, 440 aminoacidi)• A forma di Y rovesciata• Ponti S-S fra le catene• 2 siti di legame per Ag (bivalenti)• Zona di riconoscimento per Ag o Fab (Fragment Antigen

Binding) con sequenza di aminoacidi relativamente variabile• Zona costante o Fc (Fragment cristallizzabile) con sequenza

di aminoacidi relativamente costante• REGIONI IPER VARIABILI• La variabilità della sequenza di aminoacidi è confinata in 3

regioni ipervariabili (5-7 aminoacidi per L, 6-17 aminoacidi per H)

• Il sito antigenico è composto dalle regioni ipervariabili della catena L e dalle regione ipervariabili della catena H

• Alta costante di affinità Ig-Ag (104-1011 l/mole)

Papain Cleavage

Papain Cleavage

Fc

2 Fab

Pepsin Cleavage

Pepsin Cleavage

Enzymatic degradationof Fc fragment.

F(ab’)2

Funzione effettrice

Si lega a FcR(Mac, Mono)

Si lega a FcR(neutrofili; NK cells)

C fissazione(legame a C1q )

Legame a C4b

Classi di anticorpi

Esistono 2 tipi di catene leggere

– K (uomo 60%)

− λ (uomo 40%)

Esistono 5 classi di catene pesanti:

µ, γ, α, δ, εµ, γ, α, δ, εµ, γ, α, δ, εµ, γ, α, δ, ε

Ognuna di queste diverse catene pesanti è chiamata ISOTIPO

Ogni Ab è formato da 2 catene pesanti e 2 catene leggere identiche H2L2, oppure è un multimero di questa struttura base a 4 catene (H2L2)n

5 Classi di anticorpi nell’uomo

• Classe catena sottoclassi catena formula

pesante leggera molecolare

ΙgG γ γ1γ2γ3γ4 Κ, λ γ2Κ2, γ2 λ2

IgM µ nessuna Κ, λ (µ2Κ2)n(µ2λ2)n n=1 o 5

IgA α α1, α2 Κ, λ (α2Κ2)n(α2λ2)n n=1,2,3,4

IgE ε nessuna Κ, λ (ε2Κ2) (ε2λ2)

IgD δ nessuna Κ, λ (δ2Κ2) (δ2λ2)

Immunoglobuline: struttura

IgA

IgM

IgG, IgD, IgE, and IgA

Funzione degli anticorpi

• IgG:• Coinvolte nella risposta umorale• 70% delle Ig sieriche• Azioni:

– Opsonizzazione

– Neutralizzazione di microbi e tossine

– Attivazione del complemento per via classica

– Attraversare la placenta

• IgM:• Primi a comparire nel sangue in risposta ad antigeni• Potere agglutinante a causa dei molteplici siti disponibili• Attivatori del Complemento• Non attraversano la placenta

• IgA:• Ig dimeriche• Sintetizzate da linfociti B dei tessuti linfoidi associati alle mucose• Presenti nelle secrezioni, latte, saliva, lacrime, etc.

– Impediscono l’aderenza di microrganismi.

– Scarsa attività opsonizzante

– Attivazione del complemento per via alternativa

• IgE:• Reazioni di ipersensibilità di Tipo I (asma, febbre da fieno)

provocando il rilascio di citochine e mediatori infiammatori.• Attivi nelle infezioni da parassiti favorendo l’attività citotossica degli

eosinofili.

• IgD:• Ig di membrana espresse sulla superficie dei linfociti.• Ruolo non chiarito, ma sono importanti drante la differenziazione dei

linfociti B.

Ruolo delle IgE nella secrezione di istamina

IgE Ag

Vescicole diistamina

Rilascio di istamina

Recettore Fcper IgE

Istamina

Vasodilatazione, reazioniallergiche

mastocita

Caratteristiche delle risposte immunitarie

• Versatilità: numero di potenziali Ag>108:

� Molecole fisiologiche

� Virus

� Cellule

� Molecole non fisiologiche (intolleranze a materiali sintetici)

• Memoria: La prima esposizione a Ag provoca la produzione di Ab che rendono la seconda esposizione a Ag meno dannosa della prima

• Umorali: Produzione di Ab solubili che circolano nel sangue

� Formazione del complesso Ab-Ag

� Precipita con la sostanza estranea (complemento) o marcatura per la distruzione (macrofagi)

• Cellulari: Produzione di cellule(linfociti T) dagli organi linfoidi

� 1012 linfociti nell’organismo

Teoria della selezione clonale

• Il sistema immunitario è composto da milioni di cloni provenienti da un progenitore comune

• Ogni linfocita:

� E’ destinato a reagire con un Ag specifico prima dell’esposizione a Ag

> “Pronto per l’uso”, e non “fatto su misura”

� Possiede recettori (Ig) sulla superficie che riconoscono un solo Ag

� Prolifera e matura solo dopo il riconoscimento

• 3 stadi di sviluppo delle cellule:

� Cellule vergini (o naïve)

� Cellule memoria che vivono a lungo (mesi/anni)

� Cellule attivate che producono Ab e vivono pochi giorni

Come distinguere il self dal non-self?

• L’organismo eredita tutti i geni dei recettori non-self, ma non i geni dei

recettori del self: NO!• Il sistema immunitario risponde alla presenza dei vari Ag, imparando a non

rispondere al self: NO!• La tolleranza verso il self non è congenita ma acquisita durante la vita

fetale

� Clonal deletion: eliminazione dei linfociti diretti contro il self

� Clonal anergy: i linfociti diretti contro il self sono inattivati ma vivi (lariattivazione conduce alle malattie autoimmuni, ad es lupus eritematoso)

Immunoglobuline

• 4 catene polipeptidiche

� 2 catene leggere identiche (L, light, 220 aa)

� 2 catene pesanti identiche (H, heavy, 440 aa)

� A forma di Y

� Ponti S-S fra le catene

• 2 siti di legame per Ag

• 3 zone:

� Zona cerniera (hinge region)

� Zona costante o Fc (FragmentCristallizzabile) con sequenza di aminoacidi relativamente costante

� Zona di riconoscimento per Ag o Fab(Fragment Antigen Binding) con sequenza di aminoacidi relativamente variabile

Struttura primaria

• Catene H e L: segmenti ripetuti di 110 aminoacidi con notevole analogia

• Dominii variabili (V) e costanti (C)

• Catena L=VL + CL

• Catena H=VH + CH1 + CH2 + CH3

CH3

CH2

CH1

VH

VL

CL

-S-S-

-S-S-

-S-S-

Catena pesante H

Catena leggera L

Part

e c

os

tan

teP

art

e v

ari

ab

ile

-S-S-

Sito di legame con Ag

Gerald M. EdelmanRockefeller University

New York, NY, USA

Rodney R. PorterUniversity of Oxford

Oxford, United KingdomPremio Nobel 1972

Isoforme della parte costante di Ig

• 5 isoforme H, determinano la classe

� IgM, isoforma µµµµ

� IgG, isoforma γγγγ

� IgA, isoforma αααα

� IgD, isoforma δδδδ

� IgE, isoforma εεεε

• 2 isoforme L, presenti in tutte le classi di Ig

� κκκκ e λλλλ

Paradosso

• Esistono 108 Ab differenti (un Ab per ogni Ag), ma il genoma umano contiene 20 000 geni al massimo:

� Come produrre più Ab di quanti sono i geni nel genoma?

• Ipotesi degli anni ‘70 (non si conoscevano i domini delle proteine):

� Un sito antigenico è determinato da 1 catena H e 1 catena L

� Se ci fossero 1000 geni per L e 1000 geni per H, ci potrebbero essere 1000x1000=106 differenti siti antigenici

� Problema: Il meccanismo dovrebbe essere così sofisticato che una parte dei geni che codificano le catene L e H (sempre quella!) rimane sempre costante, mentre il resto può mutare selvaggiamente: Bello ma FANTASCIENTIFICO !!!

• Oggi: Ricombinazione degli esoni

� Generazione di una grande variabilità di proteine differenti congiungendo segmenti separati di geni prima della trascrizione a RNA

� Avviene nelle cellule B prima dell’esposizione a qualunque Ag

Codificazione di κκκκL

• 1 sequenza leader (1 copia per gene) →→→→ 20 aa per trasportare Ig fuori dalla cellula (non mostrata)

• 1 segmento V (150 copie) →→→→ 95 aa (regione variabile)

• 1 segmento J (5 copie) →→→→ 13 aa (regione variabile)

• 1 segmento C (1 copia) →→→→ 110 aa (regione costante)

• Calcolo combinatoriale:

� 150 V x 5 J = 750 diverse catene κκκκL

� Giunzione V-J non ben definita, n. possibilità x 10

� Totale: 7500 combinazioni diverse per le catene κκκκL

Codificazione delle catene H

• Segmenti V: 80 copie

• Segmenti D: 50 copie

• Segmenti J: 6 copie

• Segmento C: 1 copia

• Calcolo combinatoriale:

� 80 V x 50 D x 6 J = 24 000 diverse catene H

� Giunzione V-J non ben definita, inserzioni random nelle giunzioni V/D e D/J

� Totale: 2.4 milioni di combinazioni

Calcolo combinatoriale per l’intero sito antigenico (catena L + catena H)

• Il sito antigenico è composto da 1 catena H e 1 L

• Totale delle combinazioni possibili per il sito:

• 7500 x 2.4 milioni = 18x109

� Questa enorme variabilità è generata da non più di 300 segmenti di DNA differenti

Susumu Tonegawa, Japan

Massachusetts Institute of Technology (MIT)

Cambridge, MA, USA

Premio Nobel 1987

Fusione di cellule somatiche e produzione di anticorpi monoclonali

di topo

amminoacidi + zuccheri

basi azotate

nucleotidi

DHFR dihydrofolate reductase

Tk Timidino-chinasi

HGPRT Ipoxantina-Guanina Fosforibosil-Trasferasi

DNA

via classica

via di salvataggio

aminopterina

Cellule eucariote possono sopravvivere al trattamento con aminopterina (inibitore della DHFR) utilizzando la via di salvataggio per la sintesi del DNA, purché non siano

mutate nei geni che codificano gli enzimi Tk (Timidino-chinasi) o HGPRT (Ipoxantina-Guanina Fosforibosil-Trasferasi)

G. Kohler e C. Milstein: Continuous cultures of fused cells secreting antibodies of predefined specificity

Nature 256: 495-497 (1975)

Partner della fusione:

• Cellule di mieloma di topo HGPRT- che proliferano ma non producono anticorpi

• Splenociti di topo iperimmune nei confronti di eritrociti di pecora.Gli splenociti sono HGPRT+ e possono produrre anticorpi ma non proliferano.

Fotografia originale dei primi ibridomi

Immunizzazione

verifica della rispostaimmunitaria specifica

splenectomia

sospensione di splenociti(108 cellule) in terreno

senza siero

coltura di celluledi mieloma HGPRT-1

2

3

4

centrifugazione

risospensionein terreno senza siero

(2 x 107 cellule)

1

23

4

unione delledue sospensioni

di cellule

centrifugazione

sospensionemieloma-splenociti

trattamentocon PEG del pellet perindurre lafusione

diluizione gradualedel PEG in terreno

senza siero

risospensionein terreno

HAT

centrifugazione

PIASTRAMENTO

La selezione viene effettuata in terreni di coltura selettivicontenent i ipoxantina, aminopterina e t imidina (HAT).

L’aminopterina è un analogo dell’acido folico, che blocca la sintesi delle purine e pirimidine endogene; quindi le cellule per

mltiplicarsi devono servirsi della via alternativa di biosintesi fornita dall’enzima HGPRT, che permette di utilizzare l’ipoxantina e la

timidina esogene presenti nel terreno HAT. Lecellule prive di

questo enzima muoiono in terreno HAT. I linfociti B e gliibridomi cellula B-cellula B, possiedono l’enzima HPRT e

sarebbero quindi capaci di moltiplicarsi in terreno HAT, ma non essendo immortali non sono capaci di sopravvivere a lungo in

coltura e muoiono dopo poco tempo. Gli ibridomi mieloma-

mieloma mancano dell’enzima HPRT e di conseguenzanon riescono a sopravvivere. Solo l’ibridoma cellula B-cellula

mielomatosa, che ha l’enzima HPRT fornitogli dalle cellule spleniche, può utilizzare l’ipoxantina e timidina esogene e quindi

sopravv ivere emol t ip l icars i ne l ter reno di selezione.

amminoacidi + zuccheri

basi azotate

nucleotidi

DHFR

Tk-

HGPRT-

DNA

via classica

via di salvataggio

aminopterina

Selezione di ibridi somatici. Cellule Tk- e cellule HGPRT- non possono crescere in un terreno nel quale sia presente l’Aminopterina: la via classica è bloccata dalla

Aminopterina, la via di salvataggio è inattiva se manca anche solo uno dei due enzimi.

Piastramento delle cellule in diluizione limite (almeno 1000subcolture) in piastre “Microtiter” in terreno selettivo HAT

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A

B

C

D

E

F

G

H

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A

B

C

D

E

F

G

H

Trasferimento di un’aliquotadi surnatante da ciascuna sub-coltura nella piastra-saggio,

rispettando le posizioni

Pozzetto rivestito con l’antigene

L’anticorpo specificoper l’antigene si lega

L’anticorpo che non riconosce l’antigene

non si lega

surnatante dallesubcolture

pozzetto conanticorpo specifico

pozzetto senzaanticorpo specifico

Aggiunta di un anticorpo anti-Ig di topoconiugato con l’enzima perossidasi (HRP)

HRP HRP

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A

B

C

D

E

F

G

H

OPD+

H2O2(incolore)

Reazionepositiva(colore)

Reazionenegativa

Dosaggio immuno-enzimatico

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A

B

C

D

E

F

G

H

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A

B

C

D

E

F

G

H

Nella piastra-saggio, alcuni pozzetti danno reazione positiva nei confronti dell’antigene. Le relative subcolture

vengono recuperate dalla piastra madre,riclonate, ricontrollate e coltivate in

fermentatori.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

ABCDEFG

H

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

ABCDEFG

H1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

ABCDEFG

H

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

ABCDEFG

H

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

ABCDEFG

H

Applicazioni degli anticorpi monoclonali

• Dosaggi immunologici per uso diagnostico e di ricerca• Purificazione di antigeni mediante immunoaffinità• Analisi e purificazione di sottopopolazioni cellulari

• Identificazione di antigeni differenziativi

• Anticorpi neutralizzanti infezioni virali e indagini sulla struttura/funzione di proteine

• Analisi del proteoma

VANTAGGI E LIMITI DEGLI ANTICORPI MONOCLONALI MURINIVANTAGGI E LIMITI DEGLI ANTICORPI MONOCLONALI MURINI

•• Gli anticorpi sono specifici per un Gli anticorpi sono specifici per un epitopoepitopo della molecola riconosciuta.della molecola riconosciuta.•• PossibilitPossibilitàà di produrre anticorpi nei confronti di antigeni ancora ignotidi produrre anticorpi nei confronti di antigeni ancora ignoti

o di miscele di antigeni.o di miscele di antigeni.•• PossibilitPossibilitàà di mantenere i cloni congelati per lunghi periodi di tempo.di mantenere i cloni congelati per lunghi periodi di tempo.•• PossibilitPossibilitàà di effettuare studi sugli di effettuare studi sugli mRNAmRNA dei singoli cloni e clonare ledei singoli cloni e clonare le

sequenze che determinano la specificitsequenze che determinano la specificitàà in sistemi in sistemi procarioticiprocarioticio o eucarioticieucariotici..

•• Limitate applicazioni in immunoterapia: risposte immunitarie coLimitate applicazioni in immunoterapia: risposte immunitarie contro ntro le Ig di topo da parte dei pazienti.le Ig di topo da parte dei pazienti.

Solo in tempi relativamente recenti (Karpas, P.N.A.S. 2001) è stata isolata una linea di mieloma umano capace di fondersi con buona

efficienza con linfociti B umani, generando anticorpi monoclonali umani

mieloma umano

HGPRT-

linfociti B umani HGPRT+ S

Fusione e selezione in HATper favorire solo la crescita degli ibridi

e la produzione di anticorpi umani

Tecniche Tecniche immunoenzimaticheimmunoenzimatiche

La specificità delle reazioni antigene-anticorpo e la sensibilità di “marcatori” (isotopi, sostanze fluorescenti, radicali liberi, enzimi) possono essere combinate insieme per compiere un “dosaggio

immunologico”, ossia quantificare con precisione una sostanza antigenica.

La tecnica più usata è il dosaggio radioimmunologico (RIA), in cui il tracciante è costituito da un isotopo.

Vantaggi: - elevata sensibilità, della facilità con cui si ottengono le marcature

isotopiche- invariabilità delle cinetiche di reazione a seguito della marcatura

stessa.

Svantaggi:

- alti costi dei reattivi e delle apparecchiature, - deperibilità, pericolosità e difficoltà di smaltimento dei composti

radioattivi,

Quando il tracciante è costituito da un enzima, si parla di dosaggi immunoenzimatici (EIA).

In questo caso non viene misurato direttamente il marcatore, ma la sua attività nei confronti di un suo substrato specifico (ovvero la quantità di prodotto formato).

È da tener presente che l’attività enzimatica, come pure l’affinità fra Ab e Ag, può variare a seguito della coniugazione fra enzima e anticorpo (o antigene).

Vantaggi:

- minor costo, - assenza di rischi derivati dall’esposizione a radiazioni, - maggior praticità e versatilità.

Saggio competitivo direttoSaggio competitivo diretto

uso del coniugato Antigeneuso del coniugato Antigene--EnzimaEnzima

Una quantità fissa di antigene marcato e diluizioni decrescenti di antigene libero (come standard o nel campione) vengono messe a reagire insieme nei confronti di un anticorpo in difetto. In questo modo, l’antigene marcato e libero si troveranno a competere per un numero limitato di siti anticorpali. Dopo aver lavato il complesso, si aggiunge il substrato per l’enzima e si misura l’attività enzimatica spettrofotometricamente, fluorimetricamente o mediante chemioluminescenza. La concentrazione del prodotto enzimatico misurata risulterà inversamente proporzionale alla concentrazione dell’analita.

Saggio competitivo direttoSaggio competitivo diretto

uso del coniugato Anticorpouso del coniugato Anticorpo--EnzimaEnzima

Questo tipo di saggio competitivo coinvolge l’uso del coniugato anticorpo-enzima, con l’antigene immobilizzato sulla fase solida. La reazione di competizione avviene fra l’antigene immobilizzato e quello libero in soluzione come standard o proveniente dal campione, nei confronti dell’anticorpo marcato presente in concentrazione fissa e in difetto. La misura del prodotto della reazione enzimatica saràindirettamente proporzionale alla concentrazione di antigene presente nel campione.

Saggio competitivo indirettoSaggio competitivo indiretto

uso di un anticorpo secondariouso di un anticorpo secondario

La procedura implica l’uso di un anticorpo secondario marcato, in grado di riconoscere la regione costante dell’anticorpo primario, precedentemente incubato su fase solida.La reazione di competizione avviene fra l’antigene immobilizzato e quello libero in soluzione come standard o proveniente dal campione, nei confronti dell’anticorpo presente in concentrazione fissa.La misura del prodotto enzimatico sarà direttamente proporzionale nel caso della misura del titolo dell’anticorpo da determinare, mentre inversamente proporzionale per l’analita.

Saggio non competitivoSaggio non competitivo

Saggio ELISA a sandwich Saggio ELISA a sandwich

Questa metodica può essere utilizzata esclusivamente quando l’analitapossiede almeno due determinanti antigenici.

Un eccesso di anticorpo verso il primo sito antigenico viene immobilizzato sulla fase solida e incubato con diluizioni successive di antigene presente nel campione o in soluzioni standard. Dopo il lavaggio, il complesso Ag-Ab immobilizzato viene incubato con una concentrazione fissa di anticorpo marcato che andrà a legarsi al secondo sito antigenico dell’immunocomplesso. La misura del prodotto della reazione enzimatica risulterà direttamente proporzionalealla concentrazione dell’antigene da stimare.

Fattori che influenzano la scelta del metodoFattori che influenzano la scelta del metodo

•Le tecniche ELISA non competitive offrono una maggiore sensibilità rispetto alle competitive.

•La rilevabilità finale di un’analisi competitiva è limitata dalla costante di affinità dell’anticorpo usato.

•La sensibilità finale dei saggi non competitivi è determinata dal binding non specifico degli immunoreagenti marcati.

•Nei saggi competitivi diretti, dipende dal grado di purezza e dalla stabilità degli immunoreagenti, Ag o Ab, marcati con l’enzima.

•Quando di lavora con campioni reali (sieri, urine, tessuti, ecc), possono essere presenti proteine in grado di modificare i traccianti enzimatici (proteasi), oppure di inibirne l’attività.

•L’uso dell’anticorpo secondario consente un’amplificazione della risposta del saggio, poiché quando si lavora con il solo anticorpo primario la sensibilità dell’analisi è fortemente influenzata dall’affinità del sistema Ag-Ab-E.

Sensibilità

•concentrazione dell’analita,

•sensibilità del sistema di rivelazione,

•affinità dell’anticorpo da usare,

•tempo di incubazione

•tempo di sviluppo del prodotto enzimatico,

•precisione del saggio

• volumi impiegati.

Sensibilità (analitica) : capacità di un metodo di distinguere piccole variazioni di concentrazione di analita. Nella terminologia abituale immunochimica: capacità di un metodo di distinguere da zero piccole concentrazioni di analista, inversamente correlata al limite di rivelazione

o di misura, o alla minima concentrazione misurabile (rivelabilità).

Specificità (analitica) : capacità di un metodo di determinare

L’enzima da utilizzare in un saggio ELISA deve possedere i seguenti requisiti:

1 - deve essere stabile in un intervallo di temperatura compreso fra 25 e 37° C, con un tempo di vita di almeno sei mesi a 4° C

2 - deve essere disponibile commercialmente e ad un prezzo ragionevole

3 - la sua attività deve essere facilmente misurata con opportuni tests(colorimetrici, fluorimetrici, ecc.)

4 - deve essere facilmente dosabile e possedere un alto numero di turn-

over e inoltre il suo prodotto di reazione deve avere un alto coefficiente di estinzione molare

5 - non deve risentire degli effetti negativi della matrice in cui eventualmente è svolto il saggio

Gli enzimi normalmente più usati sono la perossidasi da rafano, la

Scelta dell’enzima

[ a n a l i t a ]

1 0 - 4 1 0 - 3 1 0 - 2 1 0 - 1 1 0 0 1 0 1

% A

/A0

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

ANALISI DEI DATIANALISI DEI DATI

Y = (a - d)/[1 + (x/c)b] + dModello logit-it logistico a “4

parametri”

a = valore asintotico del massimo (dose massima)

b = pendenza del tratto rettilineo della sigmoide

c = IC50, ovvero concentrazione dell’analita

nel campione in grado di legare il 50% dell’anticorpo

d = valore asintotico del minimo (dose 0)

Curva di concentrazione/risposta (curva standard, di calibrazione, di taratura) : espressione grafica dell’andamento della risposta del saggio al variare della concentrazione dell’analita (standard) utilizzata come scala di calibrazione per interpolare le risposte relative ai campioni incogniti.

Visualizzazione delle proteine nel gel

I due metodi piu’ usati sono:

Colorazione con il Coomassie Brilliant

Colorazione con l’argento “Silver staining” (puo’ essere

visualizzato ~1ng di proteina per banda)

Coomassie staining Silver staining

Western Blotting

Southern Blot: Per l’analisi del DNA.

(sonda = DNA o RNA).

Northern Blot: Per l’analisi dell’ RNA.

(sonda = DNA o RNA).

Western Blot: Per l’analisi delle proteine.

(sonda = anticorpo).

Cosa e’ un Western Blot?

Una tecnica in cui le proteine sono separate

mediante elettroforesi su gel e

successivamente trasferite su un supporto

(membrana o filtro). Successivamente una

specifica proteina viene identificata mediante

la sua reazione specifica con un anticorpo.

Qual e’ la proteina che mi interessa?

� SDS-PAGE (non certo)� Si basa sul confronto di peso molecolare

� Western blot (certo)� Si basa su una reazione specifica antigene-anticorpo

A cosa serve il Western Blot?

+

–

?

Quanta proteina di interesse c’e’?

A cosa serve il Western Blot?

Proteina

di interesse

Bande non

specifiche

[Proteina], pg

020406080

100

1 100 10000

Pg di ProteinaD

en

sit

a' m

ed

ia

(in

ten

sit

a')

Fasi di un Western Blot

Prima fase: elettroforesi su gel.

(Le proteine del campione vengono separate su un gel in base alle loro dimensioni)

Seconda fase: trasferimento su membrana.

(Le proteine nel gel sono poi trasferite su una

membrana di nitrocellulosa mediante un campo elettrico)

Terza fase: saturazione o “blocking”.

(La saturazione e’ usata per prevenire le interazioninon specifiche tra l’anticorpo e la membrana)

Fasi di un Western BlotQuarta fase: legame dell’anticorpo primario.

(L’anticorpo riconosce la proteina specifica immobilizzata

sulla membrana)

Quinta fase: legame dell’anticorpo secondario.

(L’anticorpo secondario, coniugato a un enzima (AP o

HRP), riconosce specificamente l’anticorpo primario, gia’legato alla proteina sulla membrana)

Sesta fase: rivelazione o “detection”.

(L’enzima coniugato all’anticorpo secondario scinde un substrato che, in corrispondenza della proteina specifica,

sviluppa precipitato colorato o chemioluminescenza)

Le proteine nel gel sono ancora in soluzione� Le bande diffondono e si confondono col tempo

E’ necessaria l’immobilizzazione per:� Preservare in maniera permanente l’esperimento di

elettroforesi� Permettere il riconoscimento di proteine specifiche

La strategia piu’ comune e’ il trasferimento sumembrana� Fatta di Nitrocellulosa, PVDF (Polivinilidene fluoride) o nylon � Si usa l’elettroforesi, in un processo detto ‘blotting’

Western blot: seconda fase

Immobilizzazione e trasferimento



membrana

Elettroblotting� Apparato di trasferimento

� Il gel e’ messo tra strati di carta da filtro con la membrana a diretto contatto col gel sul lato verso l’elettrodo positivo

� Viene applicato un campo elettrico e le proteinemigrano fuori dal gel verso l’elettrodo positivo e silegano alla membrana

� Fatto a 4°C per evitare surriscaldamento, decomposizione del tampone e degradazionedelle proteine


Immobilizzazione e

trasferimento

Trasferimento dal catodo(-) all’ anodo (+)

1) Spugnette2) 3 fogli di carta da filtro

imbevuti di tampone di trasferimento

3) Gel4) Membrana5) 3 fogli di carta da filtro

imbevuti di tampone di trasferimento

6) Spugnette



Apparato per il trasferimento “Semi-dry”

Western Blotting+-

-

+

SDS-PAGE

Assemble ‘sandwich’

Buffer-soaked filter papers

Gel

Nitrocellulose membrane

Wet blotting

Electrode

Buffer

Direction of transfer

Semi-dry blotting

Graphite Electrode Plates

Nitrocellulose with bound proteins

Stained (Red Ponceau)

Componenti del tampone di trasferimento:

� 25mM Tris

� 190mM glicina

� 20% metanolo


Immobilizzazione e

trasferimento

Per saturare i siti idrofobiciliberi sulla membrana

Per prevenire il legamedell’anticorpo primario allamembrana stessa

Latte scremato o Albuminadi Siero Bovino (BSA)

Western blot: terza fase

saturazione o “blocking”

L’anticorpo primario riconosce la proteina di

interesse e non lega le altre proteine

immobilizzate sulla membrana

Anticorpi come sonde:

� Molto sensibili

� Possono essere “prodotti”

� Immunizzando una specie diversa (anticorpi policlonali)

� Generando anticorpi monoclonali (mAb)

� Economici

Western blot: quarta fase

incubazione con anticorpo

primario

Anticorpi

Ab + Ag AbAg

Kd

Kd = = 10-9 M[Ab]

[AbAg]

Anticorpi

Anticorpi (immunoglobuline, Ig)

Una proteina a forma di Y secreta nel sangue in risposta ad unospecifico antigene, come un batterio o un virus, che neutralizzal’antigene legandosispecificamente ed essoe producendo unarisposta immunitaria.

Anticorpi policlonali

Produzione

Immunizzazione ripetuta dell’animale con l’antigene (peptide, proteina purificata o ricombinante)

Il sangue e’ prelevato nel momento di picco di produzione dell’anticorpo ed e’ purificato ilsiero

Il “pool” degli anticorpi riconosce molti epitopidell’antigene usato per l’immunizzazione

Anticorpi monoclonali

Riconoscono solo un epitopo

Western blot: quarta fase

incubazione con anticorpo primario

Western blot: quinta fase

Incubazione con anticorpo secondario

Anticorpi

Anticorpo primario� Riconosce la

proteina

Anticorpo secondario

� Lega l’anticorpo primario

� Generalmente prodotto in una specie diversa

� Coniugato con un enzima

� Il substrato dell’enzimasara’ convertito in un prodotto colorato

� Puo’ anche essereradioattivo o fluorescente

Western blot: quinta fase

Incubazione con anticorpo secondario

Fosfatasi alcalina (AP) o perossidasi del rafano (HRP: horseradish peroxidase)� Conversione di un substrato colorimetrico in un

precipitato colorato

Substrati Chemioluminescenti� Emettono luce se convertiti dall’enzima

� Possono essere visualizzati su lastre radiografiche

Marcatura radioattiva

Anticorpi secondarii biotinilati

Western blot: sesta fase

rivelazione o “detection”

HRP

Western blot

HRP

substrato

luce

Anticorpo primario Anticorpo secondario Rivelazione

Il substrato metabolizzato dalla perossidasi (HRP) emette luce

pg proteina

Il Sistema Immunitario -...

Documents

Transcript of Il Sistema Immunitario -...