Gli alunni:Marta Amato IIBLuisa Bojancow IIFGennaro Salerno IIFMaria Mosella IIDEmanuele Pirozzi IIDpresenteranno il percorso del progetto, fino ai risultati conclusivi dell’indagine, con particolare attenzione alle metodiche biotecnologiche impiegate.

PROGETTO BIOTECNOLOGIE A SCUOLA – EUREKA 5

Diversità Genetica e Uguaglianza UmanaA cura di: Dr. Luigi Ippolito, D.ssa Federica DeSimone, Prof.ssa Francesca Uletto,

Prof. Vincenzo De Simone, Prof.ssa Monica Piedimonte

Gli alunni:Marta Amato IIB

Luisa Bojancow IIFGennaro Salerno IIFMaria Mosella IID

Emanuele Pirozzi IID

presenteranno il percorso del progetto, fino ai risultati conclusivi dell’indagine, con particolare attenzione alle metodiche biotecnologiche impiegate.

potenzialità e limiti della genetica forense

Chi è il colpevole ?Obiettivi del nostro lavoro

Utilizzare le procedure in uso presso i laboratori della scientifica per attribuire l’appartenenza di un campione di DNA ad un determinato individuo

Riconoscere sul DNA le sequenze geniche, caratteristiche di ciascun individuo, che ne consentano l’identificazione (LOCI)

Individuarne i segmenti terminali (PRIMERS) per procedere all’amplificazione (duplicazione)

Prelevare il nostro DNA Amplificarlo per disporre della giusta quantità di copie da analizzare Sottoporre i campioni ad elettroforesi per riconoscere le corrispondenze

fra le sequenze dei reperti con quelle del sospettatoPROCEDERE ALL’INCRIMINAZIONE !

le fasi del nostro lavoro

Individuazione delle sequenze geniche caratteristiche che consentano l’identificazione del DNA

Gli esseri umani dispongono di 23 coppie di cromosomi omologhi, uno di origine paterna, l’altro di origine materna

Su ciascun membro della coppia sono presenti gli stessi Geni ma non necessariamente le stesse varianti (Alleli) nei medesimi Loci

Allele per il gruppo sanguigno A

Allele per il gruppo sanguigno B

Locus per il geneGruppo sanguigno

Cromosomiomologhi

Il corredo cromosomico umano

Distribuzione di sequenze nel genoma umano

Pseudogeni

Frammenti genici

Introni, UTR

Geni48 Mb

Sequenzecorrelate1152 Mb

LINE640 Mb

SINE420 Mb

Elementi LTR250 Mb

Trasposoni DNA90 Mb

Microsatelliti90 Mb

Varie510 Mb

Ripetizioniintersperse

1400 Mb

Altre regioniintergeniche

600 Mb

Geni e sequenze correlate DNA intergenico1200 Mb 2000 Mb

Genoma Umano3200 Mb

5’-TATTTATTTATTTATTTATTTATTTATT-3’

5’- GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGA-3’

Polimorfismi e microsatellitiL’evoluzione ha accumulato nel tempo diverse mutazioni all’interno

dei singoli loci dando luogo a polimorfismi (varianti alleliche presenti in almeno l’1% della popolazione)

Nel DNA polimorfico sono presenti elementi genetici ripetitivi che in genere non codificano per un polipeptide

Gli elementi genetici ripetitivi includono i microsatelliti o STR ( short tandem repeats cioè ripetizioni brevi in tandem) costituiti da numerose ripetizioni di brevi sequenze di coppie di basi azotate dalle 5 alle 50 volte sullo stesso cromosoma.

Analizzando i polimorfismi in maniera approfondita, è possibile identificare un essere umano con un alto grado di affidamento.

Questo metodo fornisce il PROFILO GENETICO (IMPRONTE DIGITALI DI DNA) e fornisce un importante strumento nelle indagini investigative.

Attualmente, l'FBI utilizza tredici diversi loci polimorfici per ottenere l’impronta digitale del DNA.

l'analisi dei polimorfismi può aiutare a provare o smentire la paternità nei casi in cui è contestata la responsabilità di un bambino.

Abbiamo individuato 15 loci STR

Le nostre attività Laboratorio 1 - Bioinformatica

Progettazione dei primers

Ricerca al computer delle sequenze d’innesco (PRIMERS) per l’amplificazione dei loci individuati per l’identificazione del DNA

Invio delle sequenze al servizio CEINGE per richiedere la sintesi dei primers

Calcolo delle temperature di lavoro idonee per consentire il legame primer- DNA stampo

Prelievo ed estrazione del DNA

laboratorio 2

Prelievo ed estrazione del DNAIl nostro DNA è stato : prelevato dalle cellule della mucosa orale estratto da esse provocandone la lisi privato delle proteine associate lasciato precipitare in etanolo freddo.

Elettroforesi del NOSTRO DNA per controllare la riuscita dell’estrazione e le dimensioni

Assemblaggio delle reazioni di PCR

laboratorio 3

Elettroforesi su gel

Elettroforesi su gelAbbiamo caricato i nostri campioni di DNA nei pozzetti e li abbiamo sottoposti ad elettroforesi su gel di agarosio per separarli e distinguerli.

Abbiamo letto al transilluminatore UV i nostri risultati

Amplificazione del DNA estratto col metodo della PCRIl termociclatore, in seguito a cicli successivi di riscaldamento e raffreddamento,In presenza di DNA, DNA polimerasi termostabile , PRIMERS e deossinucleotidi,duplica il segmento milioni di volte

Laboratorio 4 - Bioinformatica Dopo aver appreso le metodologie biotecnologiche alla base della genetica forense, per ottenere risultati più simili a quelli reali , anziché usare i campioni del nostro DNA , separati con ELETTROFORESI SU GEL e soggetti a qualche imprecisione legata all’inesperienza, abbiamo utilizzato CAMPIONI REALI (anonimi) , provenienti dal servizio CEINGE dell’Università Federico II di Napoli, analizzati con ELETTROFORESI CAPILLARE.

Mediante l’impiego di fluorocromi (molecole in grado di dare fluorescenza), la migrazione delle molecole è registrata da un rilevatore,analizzata e visualizzata in un unico grafico caratterizzato da una successione di picchi di colori diversi, corrispondenti alle emissioni fluorescenti dei vari fluorocromi.

L’esito di questo procedimento è un diagramma colorato(un elettroferogramma)

Per entrambi i gruppi di campioni è stato usato un Kit commerciale a 15 loci STR

Pannelli di marcatori fluorescenti

picchi di fluorescenza degli alleli di ciascun locus del campione

picchi di fluorescenza degli alleli di ciascun locus di riferimento

Abbiamo analizzato gli elettroferogrammi dei 18 campioni

Li abbiamo confrontati con quelli di riferimento

Abbiamo individuato i diversi alleli di ciascun locus prescelto

Li abbiamo registrati in una tabella

D8S11 D21S11 D7S820 CSF1PO D3S1358THO1 D13S317D16S539D2S1338D19S433VWA TPOX D18S51 AMEL D5S818 FGA L&H12,15 30,32.2 8 12 16,17 6,9 8,12 10,11 18,23 12,13 14,17 8,11 14,17 M 12 22,23 112,14 29,31.2 9 ,10 12 16,18 6,9.3 9,12 12,13 16,24 14.2,16.2 14,16 8,11 12,14 M 12,13 21,26 212,15 29,32.2 9,12 10,11 17,18 9,9.3 11,12 12 17,23 12,14 13,17 11 19,21 M 12,13 19,22 310,11 31.2,32.211 10,12 16,17 7,9.3 8,11 11,12 18,25 13.2 16,18 10,11 15,23 M 12,14 19,23 414,15 30 10,13 12 15,17 6,7 10,14 12 18,23 14,14.2 16,17 9,10 12,15 M 13 21,23 512,15 31.2,32.29 10,13 17,18 7,9 11,12 12 19,23 12,14 14,17 11 19,21 F 11,12 19,24 613,16 29,30 10,12 11,12 15,17 6,8 8,11 11 18,24 14,16,2 18,20 8 12,13 F 10,11 20,21 711,13 27,32.2 10 12,13 14,19 7,9 8,9 12,13 16,17 12,15.2 15,16 8 12,14 M 12 20,22 813 30 10,11 10,12 14,15 8,9.3 11 11,12 19,23 14,15 17,18 8 15,19 F 11 23,24 912,13 30 8,9 10,11 16,19 7 9 12 19 13,16 17,18 8 16,17 M 12 20,23 1011,13 27,32.2 10 12,13 14,19 7,9 8,9 12,13 16,17 12,15 15,16 8 12,14 M 12 20,22 1115 29,30.2 12 11,13 17,18 9,9.3 11,12 12 17,20 14,14.2 13,16 8,11 13,19 M 10,13 21,22 1213,14 28,29 10,13 11,12 17 6,7 8,12 11,13 17,19 13 17,18 8,9 15,18 M 12,13 22 1312,15 29,32.2 9,12 10,11 17,18 9,9.3 11,12 12 17,23 12,14 13,17 11 19,21 M 12,13 19,22 1411,14 28,32.2 10 10 16,17 7,8 11,12 12 18,19 14 16,18 8,10 12,16 F 12 21 1512,14 29,31.2 9,10 12 16,18 6,9.3 9,12 12,13 16,24 14.2,16.2 14,16 8,11 12,14 M 12,13 21,26 1612,15 28 11,12 10,11 15,17 8 12 13 23,25 13,14 18 8 16,21 M 12,13 21,26 1712,13 28,32.2 10,12 10,11 15,17 7 11,13 11,12 19,24 14 16,18 8,10 12,16 M 12 21,23 18

Lettura e analisi degli elettroferogrammi

I nostri risultati

IL SOGGETTO NUMERO 16 È IL COLPEVOLE !

Il profilo del suo DNA è identico a quello prelevato sulla scena del crimine (n° 2)

IL SOGGETTO NUMERO 17 È IL PADRE DEL NUMERO 18 !Il profilo del DNA di quest’ultimo corrisponde per il 50% degli alleli a quello del padre.

Il campo d’azione della genetica forense oggi è quello di identificare l’appartenenza del DNA ad un determinato individuo tracciandone il profilo ( DNA fingerprinting) e di individuare in esso relazioni parentali

conclusioni

Da oltre 10 anni si sta affermando la tendenza a correlare il comportamento umano ad alcune caratteristiche genetiche ,così da condurre ad una diversa determinazione della pena

ma…..

Avere predisposizioni genetiche non è essere determinato geneticamente

PREDISPOSIZIONE GENETICA

DETERMINISMO GENETICOambiente

mutazioni

Interazione e regolazione

genica

Libero arbitrio