Dottorato inMedicina materno-infantile, pediatria dello sviluppo e dell’educazione, perinatologia

(XXI ciclo, 3° anno)

Università degli Studi di Trieste

BURLO GAROFOLOIstituto di ricovero e cura a carattere scientificoDipartimento di Scienze della Riproduzione edello Sviluppo

Dott. Vecchiet Monica

GLUTINE E CELIACHIAGLUTINE E CELIACHIA

LA MALATTIA CELIACALA MALATTIA CELIACA

autoimmunitàautoimmunitàtTgtTg

CDCD

0.5-1% della 0.5-1% della popolazionepopolazione

dietadietaglutineglutine

geneticageneticaHLA-DQ2 HLA-DQ2 HLA-DQ8HLA-DQ8

cellule Tcellule T

agenti infettiviagenti infettivi

PROTEINE DEI CEREALIPROTEINE DEI CEREALI

ALBUMINE acqua

GLOBULINE sali

PROLAMINE alcol

GLUTENINE acidi

SOLUBILITÀ

FUNZIONE

Riserva

Strutturali e metaboliche

Protettive

ANTICORPI : ANTICORPI : phage displayphage display

DNA da linfociti B intestinali

VH VH

VL VLCH1

CH2

CH3

CH2

CH3

CH1

CLCL

costruzione dell’Ab in forma di scFv

display sulla superficie del fago

selezione su Ag di interesserecupero degli Ab specificicontro l’Ag di interesse

È possibile ricreare l’intero repertorio anticorpale di un individuo mediante il trasferimento di alcuni geni del suo sistema immunitario in un batterio e la successiva espressione degli Ab in fusione con proteine fagiche

ANTIGENE - GLUTINEANTIGENE - GLUTINE

METODO di SILANO

115.5

64.2

48.8

37.1

25.919.4

82.2

Glut’Glia G

T

GlutGlut’a

lch

Glut alch

Glia FGlia’

MWKDa

(The Journal of Biological Chemistry, 1967, 242(3), 445-50)(Nahrung Food, 1999, 43(3), 175-84)

(Ferrante, Masci et al., 2006, 6(6), 1908-14)

Anticorpo - scFv 1Anticorpo - scFv 1

GlutGlut a

lch

Glia FGlia G

T

MW

64.248.8

37.1

82.2

115.5

KDa

Le condizioni denaturantiLe condizioni denaturantidell’SDS-PAGEdell’SDS-PAGE

modificano l’epitopo riconosciutomodificano l’epitopo riconosciutodal frammento anticorpaledal frammento anticorpale??

Glia FGlia G

T

L’epitopo si trovaL’epitopo si trovasu aggregati di gliadine?su aggregati di gliadine?

Anticorpo - scFv 2Anticorpo - scFv 2

GlutGlut a

lch

Glia FGlia G

T

35.2

22.4

KDa

pH 10 pH 3

MW + Glut

KDa

181.8

155.5

64.2

37.1

25.919.4

82.2

48.8

115.5

82.2

64.2 48.8 37.1

MW + Glut

pH 10 pH 3

25.9 19.4

KDa

I dimensione

II d

ime

nsi

on

e

SEQUENZIAMENTO PROTEICOSEQUENZIAMENTO PROTEICO

Centro di Spettrometria di Massa Proteomica e Biomolecolaredell’Istituto di Scienze dell’Alimentazione-CNR di Avellino

Start – End

Observed Mr(expt) Mr(calc) Delta Miss

Sequence

68 – 74 846.4600 845.4527 845.4395 0.0132

0 R.TPFPQTR.G

75 – 90 2001.8300

2000.8227

2000.8000

0.0228

0 R.GEQHSSCQTVQHQCCR.Q

91 – 100

1181.6700

1180.6627

1180.6564

0.0063

0 R.QLVQIPEaAR.C

103 – 130

3298.5600

3297.5527

3297.6378

-0.085

0

0 K.AIQSVEEAIIQQQPQQQWNEPQQEAHLK.S

134 – 159

3107.5100

3106.5027

3106.4820

0.0207

0 R.MSLQTLPSMCNIYVPVQCQQQQQLGR.Q

Start

- End

Observed

Mr(expt)

Mr(calc) Delta Miss

Sequence

2 - 10 1128.5400

1127.5327

1127.5507

-0.018

0

2 L.WLATMKTMF.I

16 - 26 1029.5800

1028.5727

1028.5866

-0.013

9

1 L.ALAASTAIAQL.E

35 - 43 1135.5200

1134.5127

1134.4989

0.0139

0 F.GQCQHHQQL.G

35 - 48 1689.7900

1688.7827

1688.7801

0.0026

1 F.GQCQHHQQLGQQQL.L

35 - 49 1802.8800

1801.8727

1801.8642

0.0085

2 F.GQCQHHQQLGQQQLL.D

121 - 129

1065.5200

1064.5127

1064.4887

0.0241

0 W.NEPQQEAHL.K

147 - 157

1355.6700

1354.6627

1354.6663

-0.003

6

0 Y.VPVQCQQQQQL.G

158 - 165

985.5200

984.5127

984.5101

0.0027

0 L.GRQQQQQL.Q

158 - 169

1483.7700

1482.7627

1482.7539

0.0088

1 L.GRQQQQQLQEQL.K

158 - 175

2188.0800

2187.0727

2187.0854

-0.012

7

2 L.GRQQQQQLQEQLKPCATF.L

166 - 175

1221.5700

1220.5627

1220.5859

-0.023

2

1 L.QEQLKPCATF.L

digestione con tripsina

digestione con chimotripsina

riduzione, alchilazione e digestione con endopeptidasi

spotspot ALTO (35.2 KDa) ALTO (35.2 KDa)

LWLATMKTMFWLATMKTMF ILALLALAASALAAS TAIAQLTAIAQLETIC SQGFGQCQHHGQCQHH QQLGQQQLLQQLGQQQLLD

51 QMKPCVAFVQ HQCSPVRTTPFTTPF PQTRGEQHSSPQTRGEQHSS CQTVQHQCCRCQTVQHQCCR QLVQIPEQARQLVQIPEQAR

101 CKAIQSVEEAAIQSVEEA IIQQQPQQQWIIQQQPQQQW NEPQQEAHLNEPQQEAHLKK SMRMSLQTLPMSLQTLP SMCNIYSMCNIYVPVQVPVQ

151 CQQQQQLGRCQQQQQLGRQQ QQQQLQEQLKQQQQLQEQLK PCATFPCATFLQHQC RPMTVPFPHT PVQKPTSCQN

201 VQSQCLAAS TDPRAIPLPS HS

aa identificati in seguito a digestione con tripsinaaa identificati in seguito a digestione con tripsina

aa identificati in seguito a digestione con chimotripsinaaa identificati in seguito a digestione con chimotripsina

aa sovrapponibili dalle due digestioniaa sovrapponibili dalle due digestioni

gi/32400760 LMW-GS del Triticum aestivum PM 25.9 KDa e P.I. 8.4

CARATTERISTICHE DI gi/32400760CARATTERISTICHE DI gi/32400760

LWLATMKTMFLWLATMKTMF ILALLALAASILALLALAAS TAIAQTAIAQLETLETIICC SQGFGQCCQHH QQLGQQQLLD

51 QMKPCCVAFVQ HQCCSPVRTTPF PQTRGEQHSS CCQTVQHQCCCCR QLVQIPEQAR

101 CCKAIQSVEEA IIQQQPQQQW NEPQQEAHLK SMRMSLQTLP SMCCNIYVPVQ

151 CCQQQQQLGRQ QQQQLQEQLK PCCATFLQHQCC RPMTVPFPHT PVQKPTSCCQN

201 VQSQCCLAAS TDPRAIPLPS HS

- propeptidepropeptide di 2525 aa, invece di 2020

- inizio della proteina con LETLET, invece di METMET

- no peptidi che attivano i linfociti T intestinali

Glia α-2 PQPQLPYPQ

Glia α-9 PFPQPQLPY

Glia α-20 FRPQQPYPQ

Glia α- QGSFQPSQQ

Glia γ2 FPQQPQQPF

Glia γ1 PQQSFPQQQ

Glia γ30 IIQPQQPAQ

Glt-156 FSQQQQSPF

Glt-17 FSQQQQQPL

Glt QGYYPTSPQ

Glu-5 QLPQQPQQF

- 14 cisteine14 cisteine invece di 88

CONCLUSIONICONCLUSIONI

In base alle informazioni ottenute dalle sequenze, In base alle informazioni ottenute dalle sequenze, si può iniziare a chiarire la tipologia delle proteinesi può iniziare a chiarire la tipologia delle proteineimplicate nella risposta immunogenica della CDimplicate nella risposta immunogenica della CD

Probabilmente dovremmo considerareProbabilmente dovremmo consideraretutto il gruppo delle prolamine tutto il gruppo delle prolamine

tra le proteine immunogene della CDtra le proteine immunogene della CDe non solo la gliadinae non solo la gliadina

Dai risultati di immunoblotting si evidenziail riconoscimento delle glutenine

LAVORO IN CORSOLAVORO IN CORSO

Clonazione della proteina gi/32400760Clonazione della proteina gi/32400760perper verificare il suo coinvolgimento nella CD