DIPARTIMENTO MEDICINA MOLECOLARE - marionegri.it · immunitaria post-trapianto e per prevenire il...

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ATTIVITÀ DI RICERCA

Il Dipartimento di Medicina Molecolare è stato istituito nel 2000 pres-so i laboratori del Mario Negri di Bergamo e coordina il lavoro di sei la-boratori e sei unità. L’attività del Dipartimento è strettamente collegata a quella del Dipartimento di Medicina Renale del Centro di Ricerche Cliniche per le Malattie Rare “Aldo e Cele Daccò”.Questi i principali obiettivi del Dipartimento:• Identificazione di mediatori e di meccanismi d’azione responsabili della perdita di funzionalità renale nelle malattie renali; sviluppo di strategie terapeutiche con farmaci innovativi e cellule staminali di diversa origine per rallentare la progressione della malattia renale verso l’insufficienza renale terminale e indurre regressione del danno cronico al rene.• Studio dei meccanismi di rigenerazione del rene indotta da terapie renoprotettive. Identificazione di progenitori renali e loro ruolo nella rigenerazione del rene. • Correzione mediante tecnica CRISPR/Cas9 della mutazione genica in cellule sta-minali pluripotenti indotte (iPSC) da paziente con malattia genetica rara.• Generazione di tubuli renali umani usando cellule di pazienti, 3D printing e sistemi di coltura 3D, come strumento per mimare le malattie paziente-specifiche, testare farmaci e identificare nuovi composti con potenziale terapeutico.• Generazione di cellule umane che producono e secernono eritropoietina per curare l’anemia.• Analisi dei meccanismi e dei fattori responsabili della perdita di tromboresistenza dell’endotelio nelle microangiopatie trombotiche. Test di nuovi farmaci che inibisco-no l’attività del complemento.• Sviluppo di nuove strategie, tra cui la terapia genica, per modulare la risposta immunitaria post-trapianto e per prevenire il rigetto acuto e cronico del trapianto d’organo; studio di possibili vie immunologiche che portino alla tolleranza dell’or-gano trapiantato.• Studio delle basi molecolari e genetiche di malattie rare come la sindrome emo-litico uremica/ porpora trombotica trombocitopenica, la glomerulopatia a deposi-ti di C3, la glomerulonefrite membranoproliferativa, la glomerulosclerosi focale e segmentale, e la malattia del rene policistico; valutazione di alterazioni genetiche responsabili dello sviluppo di malattie rare e caratterizzazione di polimorfismi gene-tici che predicono la risposta dei pazienti alla terapie farmacologiche per malattie mono e poligeniche. Sviluppo di strategie di terapia genica per la cura di malattie rare genetiche.

CAPO DIPARTIMENTO

Ariela Benigni, Dr. Sci. Biol, Ph.D

Laureata in Scienze Biologiche all’U-niversità di Milano, con un Dottorato di Ricerca presso l’Università di Ma-astricht in Olanda, Ariela Benigni dal 1991 è anche Segretario Scientifico dell’Istituto Mario Negri di Bergamo. È Editor in Chief della rivista Nephron. Il suo nome figura ai primi posti della classifica dei Top Italian Scientists. Ha avuto incarichi di spicco in ambito inter-nazionale, presso l’Università di Oxford e in collaborazione con l’Organizzazione Mondiale della Sanità. È autrice di oltre 280 pubblicazioni scientifiche su riviste internazionali e fino ad oggi ha formato più di 70 giovani ricercatori. Nel 2016 è stata inserita tra le 100 esperte nel sito www.100esperte.it, una banca dati online, che raccoglie 100 nomi e CV di esperte nell’ambito delle Science, Te-chnology, Engineering and Mathemati-cs (STEM), promossa dall’Osservatorio di Pavia e l’associazione Gi.U.Li.A. Dal 2017 è Membro della Commissione “Innovation and Discovery Task Force” dell’American Society of Nephrology.

e-mail: [email protected].: +39 035 421 31

DIPARTIMENTOMEDICINA MOLECOLARE

DIPARTIMENTI e LABORATORI

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PRINCIPALI RISULTATI (2017)

• L’inibizione della via alternativa del complemento protegge il trapianto di organo solido dal danno da ischemia/riperfusione e dal rigetto cellulare acuto.• Cellule T regolatrici generate in-vitro rilasciano vescicole con attività immunosoppressiva.• Scoperto un nuovo meccanismo di rigenerazione tissutale da parte di cellule stromali mesenchimali che avviene attraverso lo scambio di mitocondri tra cellule danneggiate.• Cellule stromali di origine renale o da cordone ombelicale proteggono la struttura renale dal danno cronico, analoga protezione avviene con medium condizionato di questi due tipi cellulari.• Messa a punto di un nuovo metodo di isolamento di cellule staminali pluripotenti rare dal sangue del cordone ombelicale con potenziale rigenerativo.• Identificato il meccanismo molecolare di danno al rene da chemioterapici, come gli inibitori di BRAF e MEK.• Identificazione dell’interazione tra le proteine della coagulazione e le proteine del si-stema del complemento come un nuovo meccanismo alla base della trombosi.• Caratterizzazione genetica di pazienti con gravidanza complicata da sindrome emo-litico uremica atipica.• Scoperti nuovi geni ibridi derivati dalla fusione del fattore H e fattore H relati in pazienti con sindrome emolitico uremica atipica e glomerulopatia a depositi di C3.• Generate cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) da paziente con mutazione in PAX2 ed affetto da glomerulosclerosi segmentale focale (FSGS)• Ottenuti i podociti da iPSC di un paziente con mutazione in PAX2 ed affetto da FSGS• Corretta la mutazione genica in iPSC di un paziente affetto da FSGS mediante tec-nica CRISPR Cas9• Identificate alterazioni cellulari che portano alla formazione di lesioni crescenteriche• Ingegnerizzato il rene di primati non umani con un vettore adeno-associato di sierotipo 9• Generazione di tubuli renali umani mediante sistemi di coltura 3D, tecnologie di 3D bioprinting e cellule di pazienti affetti da malattia del rene policistico (PKD).• Identificazione di un nuovo composto con potenziale terapeutico per il trattamento di PKD.• Generazione di tubuli renali a partire da cellule derivate da paziente con mutazione in PAX2 ed affetto da glomerulosclerosi segmentale focale (FSGS). • Identificazione di anomalie nello sviluppo renale embrionale, potenzialmente coinvol-te nella patogenesi della FSGS. • Generazione di cellule umane in grado di produrre e secernere eritropoietina per curare l’anemia.• dentificazione di un nuovo meccanismo alla base della riattivazione di geni fetali in reni danneggiati da malattie croniche, tra cui il diabete. • Nuova applicazione per un farmaco ipoglicemizzante nella malattia renale non-diabetica• Scoperto un nuovo ruolo di ADAMTS13 indipendente dall’attività antitrombotica

DATI BIBLIOMETRICI(2017)

20 Pubblicazioni (con I.F.)

103,817Impact Factor

66H-index

(capo dipartimento)

LABORATORIBiologia Cellulare

e Medicina Rigenerativa

Fisiopatologia delle Malattie Renalie Interazione con altri Sistemi

Immunologiae Genetica delle Malattie Rare

Immunologia del Trapianto

Terapia Genicae Riprogrammazione Cellulare

UNITÀBiologia dello Sviluppo

Interazione Piastrine-Endotelio Vascolare

Modelli Sperimentali di Malattie Renali

Patologia e Immunopatologia

Genetica e Basi Molecolaridelle Malattie Renali

Biologia Cellulare dell’Autoimmunitàe del Rigetto al Trapianto

PUBBLICAZIONI SELEZIONATE (2017)

S. Tomasoni, P. Trionfini, N. Azzollini, L. Zentilin, M. Giacca, S. Aiello, L. Longaretti, E. Cozzi, N. Baldan, G. Remuzzi, A. Benigni. AAV9-mediated engineering of autotran-splanted kidney of non-juman primates. Gene Ther 2017;24:308-313.

P. Trionfini, A. Benigni A. MicroRNAs as Master Regulators of Glomerular Function in Health and Disease. J Am Soc Nephrol 2017;28:1686-1696.

F. Casiraghi, N. Azzollini, M. Todeschini, S. Fiori, R.A. Cavinato, P. Cassis, S. Solini, F. Pezzuto, M. Mister, J.M. Thurman, A. Benigni, G. Remuzzi, M. Noris. Complement alternative pathway deficiency in recipients protects kidney allograft from ischemia/reperfusion injury and allore-active T cell response. Am J Transplant 2017;17:2312-2325.

S. Aiello, F. Rocchetta, L. Longaretti, S. Faravelli, M. Todeschini, L. Cassis, F. Pezzuto, S. Tomasoni, N. Azzollini, M. Mister, C. Mele, S. Conti, M. Breno, G. Remuzzi, M. Noris, A. Benigni. Extracellular vesicles derived from T regulatory cells suppress T cell proliferation and prolong allograft survival. Sci Rep 2017;7:11518.

L. Perico, M. Morigi, C. Rota, M. Breno, C. Mele, M. Noris, M. Introna, C. Capelli, L. Longaretti, D. Rottoli, S. Conti, D. Corna, G. Remuzzi, A. Benigni. Human mesenchymal stromal cells tran-splanted into mice stimulate renal tubular cells and enhance mitochondrial function. Nat Commun 2017;8:983.

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L’attività del laboratorio è principalmente focalizzata sullo studio del-le cause genetiche di alcune malattie rare e sulla caratterizzazione molecolare e biochimica delle conseguenze funzionali delle muta-zioni. Le patologie oggetto di studio sono: 1) Sindrome emolitico uremica atipica (aHUS); 2) Porpora trombotica trombocitopenica (TTP); 3) Glomerulonefrite membranoproliferativa e glomerulopatia e depositi di C3 (MPGN/C3G) 4) Sindrome nefrosica steroido resistente (SRNS); 5) Glomerulopatia a depositi di fibronettina ; 6) Malattia del rene policistico.Il laboratorio ha contributo alla scoperta di numerose anomalie genetiche (muta-zioni e formazioni di geni ibridi) che causano iperattivazione del sistema del com-plemento nella aHUS e nella MPGN/C3G o alterazioni della funzione del podocita nella SRNS. Le ricerche sono inoltre volte a chiarire l’impatto degli specifici difetti genetici sul decorso clinico delle malattie, la risposta ai farmaci e il rischio di ri-correnza dopo trapianto di rene. Mediante studi in vitro e in vivo in modelli animali vengono investigati i meccanismi di attivazione e regolazione della via alternativa del complemento, le relazioni tra il sistema del complemento e la trombosi (in particolare il fattore di von Willebrand) e le conseguenze funzionali delle muta-zioni e dei riarrangiamenti genomici. Inoltre si studiano in vitro ed ex-vivo gli effetti di nuovi farmaci inibitori del complemento nel correggere tali difetti.Mediante il sequenziamento di nuova generazione (sequenziamento di pannelli di geni o dell’intero esoma) il laboratorio ricerca nuove cause genetiche delle malattie rare oggetto di studio, e i determinati genetici della formazione di au-to-anticorpi.Dal 2010 il laboratorio esegue indagini di diagnostica genetica in convenzione con il SSN per numerose malattie rare.


Gli studi svolti nel Laboratorio nel 2017 hanno documentato che il fattore di von Willebrand (VWF), una proteina multimerica che ha un ruolo centrale nell’emo-stasi , è in grado di attivare il sistema del complemento e questo fenomeno può contribuire ad indurre trombosi nei vasi della microcircolazione. Abbiamo studiato 20 pazienti con una rara forma genetica di porpora trombotica trombocitopenica (TTP), nei quali i multimeri di VWF non sono inattivati dal normale taglio proteo-

CAPO LABORATORIO

Marina Noris, Dr. Chim. Farm. Ph.D

Laureata in Chimica e Tecnologie Far-maceutiche (1986) presso l’Università degli studi di Roma “La Sapienza”, lavora presso l’Istituto Mario Negri dal 1987: come borsista dal 1987 al 1992, come ricercatrice dal 1992 al 1996 e come responsabile di Labora-torio dal 1996.

Nel 2006 ha conseguito il titolo di PhD in Genetica presso l’Università di Ma-astricht.

Dal 2013 è membro dell’European Complement Network Board. Da lu-glio 2015 è “Associated Editor” del Journal of Immunology. Membro del Research Club “Top Italian Women Scientists 2016” promosso da Onda.

E’ autrice di circa 180 pubblicazioni su riviste scientifiche internazionali in-dicizzate e di numerosi capitoli di libri, nei settori della genetica e della cura di malattie rare nefrologiche e dell’immu-nologia del trapianto.


LABORATORIO DI IMMUNOLOGIAE GENETICA DELLE MALATTIE RARE


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litico a causa di mutazioni nel gene ADAMTS13 . In collaborazione con l’Unità Interazione piastrine-endotelio vascolare, abbiamo osservato che il siero di que-sti pazienti attiva la via alternativa del complemento sulla superficie delle cellule endoteliali e l’anomalia è corretta aggiungendo al siero TTP ADAMTS13 ricom-binante, che previene l’accumulo di multimeri VWF sulle cellule. Attraversi studi meccanicistici abbiamo documentato che VWF interagisce tramite il suo dominio A2 con il frammento C3b del fattore C3 del complemento e causa attivazione della via alternativa fino alla formazione dei prodotti terminali C5a e C5b-9. Infine abbiamo dimostrato che in condizioni di deficienza di ADAMTS13 quali si osser-vano nei pazienti con TTP, i prodotti di attivazione del complemento formati dai multimeri del VWF alterano le proprietà antitrombogeniche delle cellule endoteliali e causano formazione di trombi.In uno studio multinazionale nell’ambito del progetto europeo EURenOmics ab-biamo analizzato i parametri clinici e la frequenza di mutazioni nei geni del com-plemento in donne che avevano sviluppato sindrome emolitico uremica atipica durante la gravidanza o dopo il parto. Il 53% delle pazienti ha presentato una malattia molto severa e ha sviluppato insufficienza renale terminale. Abbiamo identificato mutazioni nel 56% delle pazienti, soprattutto nei geni CFH e CFI.


Interaction between Multimeric von Willebrand Factor and Complement: A Fresh Look to the Pathophysiology of Microvascular Thrombosis. Bettoni S, Galbusera M, Gastoldi S, Donadelli R, Tentori C, Spartà G, Bresin E, Mele C, Alberti M, Tortajada A, Yebenes H, Remuzzi G, Noris M.J Immunol. 2017 Aug 1;199(3):1021-1040.

Hemolytic Uremic Syndrome in Pregnancy and Postpartum. Bruel A, Kavanagh D, Noris M, Delmas Y, Wong EKS, Bresin E, Provôt F, Brocklebank V, Mele C, Remuzzi G, Loirat C, Frém-eaux-Bacchi V, Fakhouri F. Clin J Am Soc Nephrol. 2017 Aug 7;12(8):1237-1247.

Cluster Analysis Identifies Distinct Pathogenetic Patterns in C3 Glomerulopathies/Immune Com-plex-Mediated Membranoproliferative GN. Iatropoulos P, Daina E, Curreri M, Piras R, Valoti E, Mele C, Bresin E, Gamba S, Alberti M, Breno M, Perna A, Bettoni S, Sabadini E, Murer L, Vivarelli M, Noris M, Remuzzi G; Registry of Membranoproliferative Glomerulonephritis/C3 Glomerulopathy. J Am Soc Nephrol. 2018 Jan;29(1):283-294.

Genetics of Immune-Mediated Glomerular Diseases: Focus on Complement. Noris M, Remuzzi G. Semin Nephrol. 2017 Sep;37(5):447-463.

Kidney Transplantation in Patients With Atypical Hemolytic Uremic Syndrome: A Therapeutic Dilemma (or Not)? Noris M, Ruggenenti P, Remuzzi G. Am J Kidney Dis. 2017 Dec;70(6):754-757.

STAFFMarina Noris, Dr.Chim.Farm.Ph.D.

Capo Laboratorio

Roberta Donadelli, Dr.Sci.Biol.Capo Unità Genetica e Basi Molecolari

delle Malattie Renali

Immagini rappresentative al microscopio confocale di cellule endoteliali umane in coltura esposte a

siero di pazienti con porpora trombotica trombocitopenica (TTP) e deficit genetico di ADAMTS13. Si

osservano i multimeri di fattore von Willebrand (in rosso) sulla superficie delle cellule che colocalizza-

no con i depositi dei frammenti attivi (C3b in verde) del complemento.

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Terapie cellulari con cellule staminali adulte, di diversa origine, e di progenitori renali per rigenerare il rene in modelli di danno renale acuto e cronico: identificazione dei meccanismi di riparo/rigene-razione; Isolamento progenitori renali da tessuto renale e urine; Terapia cellulare con cellule staminali embrionali ed iPS (pluripotenti indotte) differenziate in progenitori renali nelle malattie renali acute e croniche; Studio dell’organogenesi renale e dei meccanismi importanti per il normale svi-luppo dell’organoGenerazione di tessuti renali funzionanti a partire da cellule staminali umane per valutare la capacità integrativa delle cellule umane nel tessuto renale e per svilup-pare nuove terapie per le malattie renali croniche.Ruolo della Shigatossina nella patogenesi del danno renale tipico della forma epidemica di Sindrome Emolitico uremica; Tossicità delle proteine plasmatiche e ruolo dell’attivazione del complemento e del C3a nel danno a livello glomerulare (podociti, cellule parietali ed endoteliali) in vitro ed in modelli di malattie renali croniche.Studio dei meccanismi legati all’attivazione del complemento e al deficit di ADAM-TS13 che favoriscono la trombosi nella sindrome emolitico uremica e nella por-pora trombotica trombocitopenica. Test biochimici per diagnosi e monitoraggio della terapia nelle microangiopatie trombotiche.Studio in vitro dell’attività di nuovi farmaci anti-complemento.


Nell’ambito del progetto europeo HEALTHF4-305446, abbiamo identificato un nuovo meccanismo di riparo/rigenerazione renale indotto dalle cellule stroma-li mesenchimali umane (MSCs) da cordone ombelicale, che limitano il danno mitocondriale a carico delle cellule prossimali tubulari in un modello di malattia renale acuta. Le MSCs regolano la biogenesi mitocondriale nei tubuli prossimali

incrementando l’espressione di Sirtuina 3, di PGC1a e la biosintesi di NAD+ e, favorendo così le difese antiossidanti e la produzione di ATP. Inoltre, le MSCs pro-

CAPO LABORATORIO

Marina Morigi, Dr. Sci. Biol. Ph.D.

Laureata in Scienze Biologiche nel 1987 presso l’Università degli Studi di Milano. Ha conseguito il titolo di Ph.D. presso l’Università di Maastricht, Olan-da, nel 2005.

1984: ha iniziato la sua attività di ri-cerca al Mario Negri di Bergamo pri-ma come tesista e poi borsista. Nel 1991 ha svolto un periodo di studio a Boston, al Brigham and Women’s Hospital, presso il laboratorio del Dr. P. Marsden.

1996-1999: è stata Capo Unità di Bio-logia della Cellula Renale ed Endote-liale; dal 2000 è Capo del Laboratorio di Biologia Cellulare e Xenotrapianto, rinominato nel 2010 come Laboratorio di Biologia Cellulare e Medicina Rige-nerativa.


LABORATORIO BIOLOGIA CELLULAREE MEDICINA RIGENERATIVA


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muovono la formazione di connessioni intercellulari -regolando l’apparato micro-tubulare- tra cellule epiteliali tubulari danneggiate adiacenti, favorendo lo scambio di mitocondri e la rigenerazione cellulare. Nell’ambito dello stesso progetto europeo, è stato comparato l’effetto renopro-tettivo di cellule stromali mesenchimali (MSCs) umane ottenute da cordone om-belicale (CO) e da rene (R) con l’effetto dei loro medium condizionati (MC) in un modello di malattia renale cronica indotta da riduzione della massa renale. I dati dimostrano che sia le due popolazioni cellulari e i rispettivi MC sono in grado di limitare a livello glomerulare la perdita di podociti e le alterazioni a carico delle cellule endoteliali, riducendo la glomerulosclerosi. In questo modello le R-MSCs sono le più efficaci nel ridurre la proteinuria. Studi sono in corso per identificare i meccanismi/mediatori alla base dell’effetto renoprotettivo. Le cellule definite ‘very small like embryonic stem cells’ (VSELs) rappresentano una rara popolazione cel-lulare presente in diversi tessuti. In collaborazione con la Fondazione IRCCS Poli-clinico San Matteo di Pavia, abbiamo messo a punto un metodo per l’isolamento delle VSELs dal sangue del cordone ombelicale. Queste cellule sono in grado di differenziare nei tre foglietti embrionali e, mediante esposizione ad un proto-collo differenziativo da noi messo a punto, in progenitori renali. I progenitori renali derivati dalle VSELs hanno mostrato, quando iniettate in topi con insufficienza renale acuta indotta da cisplatino, di migliorare la funzione renale e di rigenerare il tessuto renale danneggiato. Il glomerulo è particolarmente suscettibile al danno indotto da chemioterapici, sebbene i meccanismi di tale tossicità non siano stati completamente identificati. Gli inibitori di BRAF e MEK , due importanti regolatori della proliferazione cellulare, sono terapie efficaci contro il melanoma metastatico, ma poco è noto della loro nefrotossicità. Abbiamo dimostrato che l’inibizione di BRAF e MEK induce un danno diffuso alla struttura dei podociti e rarefazione dei capillari glomerulari nella biopsia di un paziente durante il trattamento farmacologico. La funzione renale e il danno glomerulare revertono rapidamente dopo la sospensione dei farmaci. L’inibizione di BRAF riduce l’espressione di importanti marker strutturali del podo-cita, portando ad un’alterata filtrazione. Entrambi gli inibitori BRAF e MEK alterato le proprietà funzionali glomerulari inibendo il sistema VEGF nei podociti.


Perico L, Morigi M, Rota C, Breno M, Mele C, Noris M, Introna M, Capelli C, Lon-garetti L, Rottoli D, Conti S, Corna D, Remuzzi G, Benigni A. Human mesenchymal stromal cells transplanted into mice stimulate renal tubular cells and enhance mito-chondrial function. Nat Commun. 2017 Oct 17;8(1):983.

Zoja C, Buelli S, Morigi M. Shiga toxin triggers endothelial and podocyte injury: the role of complement activation. Pediatr Nephrol. 2017 Dec 6.

Monti M, Imberti B, Bianchi N, Pezzotta A, Morigi M, Del Fante C, Redi C, Perotti C. A Novel Method for Isolation of Pluripotent Stem Cells from Human Umbilical Cord Blood. Stem Cells Dev. 2017 Sep 1;26(17):1258-1269.

Perico L, Mandalà M, Schieppati A, Carrara C, Rizzo P, Conti S, Longaretti L, Benigni A, Remuzzi G. BRAF Signaling Pathway Inhibition, Podocyte Injury, and Nephrotic Syndrome. Am J Kidney Dis. 2017 Jul;70(1):145-150.

Goodship, T.H.J., Cook, H.T., Fakhouri, F., Fervenza, F.C., Fremeaux-Bacchi, V., Kavanagh, D., Ne-ster, C.M., Noris, M., Pickering, M., Rodriguez de Cordoba, S., Roumenina, L.T., Sethi, S., Smith, R.J., Galbusera, M., Ruggenenti, P. Atypical hemolytic uremic syndrome and C3 glomerulopathy: con-clusions from a “Kidney Disease: Improving Global Outcomes” (KDIGO) Controversies Conference. Kidney Int 2017; 91:539-551.

STAFFMarina Morigi, Dr.Sci.Biol.Ph.D.

Capo Laboratorio

Barbara Imberti, Dr.Sci.Biol.Ph.D.Capo Unità Biologia dello Sviluppo

Miriam Galbusera, Dr.Sci.Biol.Capo Unità Interazione

Piastrine-Endotelio Vascolare

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Il Laboratorio si occupa dell’identificazione di nuovi target e di stra-tegie innovative per inibire la risposta innata e adattativa verso l’organo trapiantato e promuovere l’induzione di tolleranza immu-nologica. Le proprietà immunomodulatorie di terapie cellulari e dei nuovi farmaci vengono studiate in modelli sperimentali di trapianto di rene e di cuore con la prospettiva di identificare il meccanismo di azione e disegnare il miglior protocollo da trasferire in clinica. Il Laboratorio inoltre effettua la caratterizzazione funzionale e fenotipica dei linfociti isolati dai pazienti con trapianto di rene o di fegato ed inseriti in studi clinici tra i quali la terapia cellulare con cellule mesenchimali stromali. La valutazione del fenotipo e l’alloreattività dei linfociti T e B viene effettuata prima e a vari tempi dal trapianto per identificare sia i meccanismi d’azione che i parametri immunologici di “tolleranza” in base ai quali stabilire se è possibile iniziare la riduzione dei far-maci immunosoppressori. L’Unità che fa parte del Laboratorio studia il ruolo dell’immunità innata e adattativa nel trapianto di rene, soprattutto come il danno ischemico attivi ed influenzi le cellule del sistema immunitario. Una particolare attenzione è rivolta alla biologia delle cellule dendritiche residenti nel rene e non, ed ai meccanismi attraverso i quali queste cellule possono attivare o disattivare la risposta al trapianto di rene.


L’attivazione del sistema del complemento, in particolare attraverso la via alter-nativa, è un processo implicato sia nel danno da ischemia/riperfusione che nella risposta cellulare adattativa al trapianto di rene. Topi deficienti per il fattore B del complemento (specifico attivatore della via alternativa) o topi wild-type trattati con un anticorpo anti-fattore B subiscono un minore danno da ischemia riperfusione in seguito a trapianto di rene allogenico e mostrano un significativo prolunga-mento della sopravvivenza. In vitro le cellule T e le cellule dendritiche deficienti di fattore B o trattate con l’anticorpo specifico hanno ridotte capacità di attiva-zione/stimolazione in reazioni linfocitarie miste. L’attività immunosoppressiva dei dnIKK2-Treg di ratto, un particolare tipo di linfociti T regolatori, avviene esclu-sivamente grazie al rilascio di vescicole extracellulari, gli esosomi. Gli esosomi rilasciati da dnIKK2-Treg contengono specifici miRNA e l’enzima iNOS, che, una

CAPO LABORATORIO

Federica Casiraghi, Chemist, Ph.D

Perito chimico industriale e ha conse-guito il titolo di PhD presso l’Università di Maastricht, in Olanda, nel 2015. Ha iniziato a lavorare all’Istituto Mario Ne-gri nel 1989.

2006-2015: è stata capo dell’ Unità di Biologia Cellulare e Molecolare della Tolleranza al Trapianto.

E’ capo laboratorio dal 2015. Si oc-cupa di immunologia del trapianto con particolare attenzione alle terapie cellulari e farmacologiche di induzione e mantenimento della tolleranza al tra-pianto.

e-mail: [email protected].: +39 035 4535 361/357

LABORATORIOIMMUNOLOGIA DEL TRAPIANTO


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volta liberati all’interno dei linfociti T bersaglio, ne impediscono l’attivazione, bloc-cando il ciclo cellulare e inducendo apoptosi, e li trasformano in linfociti T regola-tori. Inoltre, in un modello sperimentale di allotrapianto di rene, somministrare gli esosomi rilasciati da dnIKK2-Treg ai ratti riceventi, prolunga la sopravvivenza del rene trapiantato e ne protegge la funzionalità.


Casiraghi F, Perico N, Remuzzi G. Mesenchymal stromal cells for tolerance induction in organ transplantation. Hum Immunol. 2017, pii: S0198-8859(17)30573-6.

Casiraghi F, Azzollini N, Todeschini M, Fiori S, Cavinato RA, Cassis P, Solini S, Pezzu-to F, Mister M, Thurman JM, Benigni A, Remuzzi G, Noris M. Complement Alternative Pathway Deficiency in Recipients Protects Kidney Allograft From Ischemia/Reperfu-sion Injury and Alloreactive T Cell Response. Am J Transplant. 2017, 17(9): 2312-2325.

Aiello S, Rocchetta F, Longaretti L, Faravelli S, Todeschini M, Cassis L, Pezzuto F, Tomasoni S, Azzollini N, Mister M, Mele C, Conti S, Breno M, Remuzzi G, Noris M, Benigni A. Extracellular vesicles derived from T regulatory cells suppress T cell proliferation and prolong allograft survival. Sci Rep. 2017, 7(1):11518.

STAFFFederica Casiraghi, Chemist, Ph.D.

Capo Laboratorio

Sitiana Aiello, Dr.Sci.Biol.Capo Unità Biologia Cellulare dell’

Autoimmunità e del Rigetto al Trapianto

Schema che descrive il meccanismo attraverso il quale le microvescicole rila-sciate dai linfociti T regolatori inibiscono l’attivazione dei linfociti T

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Generazione di cellule pluripotenti indotte (iPSC) a partire da cellule somatiche adulte umane e sviluppo di protocolli differenziativi per ottenere progenitori renali, podociti e cellule endoteliali e studiare i meccanismi molecolari alla base delle malattie renali legate a mu-tazioni genetiche e ottenere strutture renali in vitro per testare nuovi farmaci.Utilizzo della tecnica CRISPR/Cas9 per correggere la mutazione genica in iPSC derivanti da pazienti con malattie genetiche con l’obiettivo di comprendere la funzione biologica della mutazione.Delezione di un gene in iPSC mediante la tecnica CRISPR/Cas9 per studiarne la funzione o per mimare malattie genetiche in vitro. Sviluppo di tecniche di terapia genica in vivo per correggere difetti genetici in malattie rare e per prevenire il rigetto nel trapianto d’organo utilizzando tecniche di trasferimento genico non-integrative, quali vettori adenovirali e adeno-associati, e tecniche integrative come il sistema del trasposone Sleeping Beauty. Analisi del tessuto renale, in pazienti e in modelli sperimentali, al fine di studiare i meccanismi di progressione delle nefropatie, sia acute che croniche, e identifica-re trattamenti farmacologici che possano rallentarne o regredirne la progressione. Oltre alle tecniche di microscopia ottica e a fluorescenza per analisi morfologiche del tessuto renale e per lo studio dell’espressione di proteine ci serviamo di so-fisticati microscopi elettronici, a trasmissione e a scansione per studiare più in dettaglio le alterazioni tipiche delle diverse patologie, con particolare attenzione all’ultrastruttura e funzione del filtro glomerulare.


La generazione di podociti umani in vitro offre un’opportunità unica per lo studio delle malattie renali. Il laboratorio ha sviluppato un protocollo che permette di ottenere podociti umani da iPSC. Il protocollo di differenziamento è altamente effi-ciente e permette di generare podociti maturi e funzionali che esprimono i marca-tori tipici dei podociti, quali synaptopodin, WT1, b-Actinina-4, P-caderina e nefri-na. I podociti sono in grado di internalizzare albumina e di integrarsi correttamente in strutture renali chimeriche quando combinate con cellule renali embrionali di topo a formare organoidi tridimensionali in vitro. La possibilità di generare iPSC

CAPO LABORATORIO

Susanna Tomasoni, Dr. Sci. Biol. Ph.D

Laurea in Scienze Biologiche nel 1991 all’Università degli Studi di Milano.

1994: è borsista presso la Renal Divi-sion al Brigham and Women’s Hospi-tal, Harvard Medical School (Boston, USA) e nel 1995 ottiene il titolo di Ph.D in Scienze Fisiologiche presso l’Uni-versità di Milano.

1995-2000: è ricercatrice presso l’I-stituto Mario Negri dove, dal 2000 al 2010 guida l’Unità di Terapia Genica.

2010: è Capo Laboratorio di Terapia Genica e Riprogrammazione Cellulare.


LABORATORIO TERAPIA GENICAE RIPROGRAMMAZIONE CELLULARE


IRFMN 109

da pazienti con malattie genetiche rare e di correggere il difetto genetico con CRISPR/Cas9 ci permette di studiare il ruolo della mutazione nelle cellule renali.La glomerulonefrite extracapillare è una patologia severa caratterizzata da una rapida perdita della funzionalità renale. Le lesioni crescenteriche caratteristiche di questa patologia derivano dalla proliferazione e migrazione incontrollata di una popolazione di cellule parietali epiteliali dette progenitori renali. Analizzando biop-sie di pazienti con glomerulonefrite extracapillare abbiamo descritto la sequenza di eventi responsabili dell’evoluzione delle lesioni crescenteriche. Inizialmente i macrofagi e l’enzima proteolitico da loro prodotto (MMP-12) si accumulano nei vari distretti del tessuto renale. Successivamente si osserva un aumento dell’e-spressione del recettore di tipo 1 dell’angiotensina II a livello glomerulare. Studi in vitro ci hanno permesso di capire il ruolo dell’angiotensina II e della chemochi-na SDF-1 (fattore derivato dalle cellule stromali-1) nell’interazione tra podociti e progenitori renali durante l’evoluzione della patologia. I risultati di questo studio supportano il trattamento con ACE inibitori in pazienti con glomerulonefrite extra-capillare.Il rigetto cronico rimane il principale ostacolo al successo del trapianto d’organo a causa degli attuali farmaci antirigetto che non sono efficaci nel contrastarlo. Un altro limite della terapia antirigetto che deve essere assunta cronicamente è di esporre il soggetto trapiantato al rischio di infezioni e tumori. Abbiamo pre-cedentemente dimostrato in roditori che il trasferimento genico di CTLA4Ig, una proteina con attività immunomodulatoria, nel rene del ratto donatore era in grado di prevenire l’insorgenza della nefropatia cronica, senza l’uso della terapia im-munosoppressiva. Recentemente abbiamo dimostrato che questo approccio è efficace anche in un modello sperimentale più vicino all’uomo. Infatti, in un mo-dello di autotrapianto di rene in primati non umani, abbiamo dimostrato che era possibile ingegnerizzare il rene donatore attraverso vettori adeno-associati (AAV9) codificanti per la proteina LEA29Y, una versione potenziata di CTLA4Ig.


Rizzo P, Novelli R, Rota C, Gagliardini E, Ruggiero B, Rottoli D, Benigni A, Remuzzi G. The Role of Angiotensin II in Parietal Epithelial Cell Proliferation and Crescent Forma-tion in Glomerular Diseases. Am J Pathol. 2017;187(11):2441-2450.

Tomasoni S, Trionfini P, Azzollini N, Zentilin L, Giacca M, Aiello S, Longaretti L, Cozzi E, Baldan N, Remuzzi G, Benigni A. AAV9-mediated engineering of autotransplanted kidney of non-human primates. Gene Ther. 2017 May;24(5):308-313.

Conti S, Perico L, Grahammer F, Huber TB. The long journey through renal filtration: new pieces in the puzzle of slit diaphragm architecture. Curr Opin Nephrol Hypertens. 2017;26(3):148-153.

Aiello S, Rocchetta F, Longaretti L, Faravelli S, Todeschini M, Cassis L, et al. Extracellular vesicles de-rived from T regulatory cells suppress T cell proliferation and prolong allograft survival. Sci Rep. 2017 Sep 14;7(1):11518.

Zanchi C, Macconi D, Trionfini P, Tomasoni S, Rottoli D, Locatelli M, et al. MicroRNA-184 is a down-stream effector of albuminuria driving renal fibrosis in rats with diabetic nephropathy. Diabetologia. 2017 Jun 60(6):1114-1125.

STAFFSusanna Tomasoni, Dr.Sci.Biol.Ph.D.

Capo Laboratorio

IRFMN110


Il laboratorio ha sviluppato modelli sperimentali di malattie renali che riproducono caratteristiche cliniche e istopatologiche delle nefro-patie umane, con l’obiettivo 1) di comprendere i meccanismi di danno responsabili della progressione della malattia fino alla perdita della funzione renale, con particolare riguardo al ruolo di proteinuria, sistema del complemento e mediatori di infiammazione e fibrosi; 2) di identificare nuove molecole o combinazioni di farmaci per rallentare la pro-gressione della malattia verso l’insufficienza renale terminale o addirittura indurre regressione del danno cronico al rene. La diffusione epidemica del diabete e delle sue complicanze renali e cardiovascolari ci ha spinto a focalizzare parte dell’attività sulla nefropatia diabetica di tipo 2 utilizzando modelli nel ratto e nel topo per trovare nuovi bersagli terapeutici e molecole da poter combinare con la terapia standard (inibitori sistema renina angiotensina). Il laboratorio ha com-petenze di patologia e immunopatologia e di biologia molecolare applicate allo studio di reni e altri organi. Un’altra linea di ricerca riguarda il ruolo della Shigatossina nella patogenesi del danno microvascolare tipico della Sindrome Emolitico Uremica, la maggiore cau-sa d’insufficienza renale acuta del bambino. Utilizzando modelli in vivo e in vitro studiamo come attivazione e deposizione del complemento a livello glomerulare in risposta a Shigatossina, favoriscono trombosi microvascolare e danno ai po-dociti.


L’inibizione del trasportatore sodio-glucosio di tipo 2 (SGLT2) ha effetto renopro-tettivo in un modello di malattia renale non-diabetica Gli inibitori di SGLT-2 sono una classe di ipoglicemizzanti orali approvati per il trattamento del diabete di tipo 2, che al di là degli effetti sulla glicemia hanno pro-prietà pleiotropiche implicate nell’azione renoprotettiva nel diabete. In un modello murino di nefropatia non-diabetica indotta da sovraccarico di proteine, l’inibizione di SGLT2 riduceva la proteinuria e limitava disfunzione e perdita dei podociti, cellule glomerulari cruciali per il mantenimento della barriera di filtrazione. Con esperimenti in vitro, usando podociti esposti all’albumina abbiamo identificato un nuovo meccanismo d’azione per inibitori di SGLT2 che direttamente agiscono sui

CAPO LABORATORIO

Carlamaria Zoja, Dr. Sci. Biol. Ph.D

Si è laureata in Scienze Biologiche all’Università degli Studi di Milano nel 1979. PhD all’Università di Maastricht nel 2001.

Ha iniziato l’attività di ricerca nel 1979 nel Laboratorio di Nefrologia, Ospedali Riuniti di Bergamo.

1981-1983: borsista CEE all’Universi-tà Cattolica di Lovanio. Dal 1984 ricer-catrice dell’Istituto.

1990: capo unità, 1995: capo labo-ratorio. Brevi stages negli Stati Uniti a Cleveland e Boston. 2004-2007 membro del comitato editoriale “Jour-nal of the American Society of Ne-phrology”. 2010-2014 leader WP5.2, progetto europeo SysKid. Autrice di circa 170 pubblicazioni.

Fa parte del gruppo “Top Italian Wo-men Scientists 2016”. Finalista “Euro-pean Inventor Award 2017”.


LABORATORIO FISIOPATOLOGIA DELLE MALATTIE RENALI ED INTERAZIONE CON ALTRI SISTEMI


IRFMN 111

podociti mantenendo l’architettura del citoscheletro. Questi risultati suggeriscono che inibitori di SGLT2 rappresentino un’opzione terapeutica di possibile impiego in glomerulopatie proteinuriche non-diabetiche.La mancanza di ADAMTS13 nel diabete induce alterata attività di CamKII e dislo-cazione di Cx43 nei cardiomiocitiNei pazienti diabetici un difetto nell’attività della metalloproteasi ADAMTS13, che degrada i multimeri trombogenici di vWF, rappresenta un importante fattore di ri-schio per lo sviluppo di eventi cardiovascolari. La mancanza di ADAMTS13 favo-risce lo sviluppo di aritmie ventricolari nei topi diabetici. Investigando i meccanismi molecolari responsabili di questo fenomeno, abbiamo osservato un aumento del-la fosforilazione di CamKII associato alla dislocazione della proteina di giunzione ventricolare Cx43 nei cardiomiociti di topi ADAMTS13-/- diabetici. ADAMTS13, indipendentemente dalla sua ben nota attività anti-trombotica, svolge quindi un ruolo importante nella regolazione della funzione cardiaca in condizione diabetica.


Fenofibrate attenuates cardiac and renal alterations in young salt-loaded spontane-ously hypertensive stroke-prone rats through mitochondrial protection. Castiglioni L, Pignieri A, Fiaschè M, Giudici M, Crestani M, Mitro N, Abbate M, Zoja C, Rottoli D, Foray C, Fiordaliso F, Guerrini U, Tremoli E, Sironi L, Gelosa P.J Hypertens. 2017 Dec 22. [Epub ahead of print]

Shiga toxin triggers endothelial and podocyte injury: the role of complement activation.Zoja C, Buelli S, Morigi M. Pediatr Nephrol. 2017 Dec 6. [Epub ahead of print] Review.

MicroRNA-184 is a downstream effector of albuminuria driving renal fibrosis in rats with diabetic ne-phropathy.Zanchi C, Macconi D, Trionfini P, Tomasoni S, Rottoli D, Locatelli M, Rudnicki M, Vandesompele J, Mestdagh P, Remuzzi G, Benigni A, Zoja C. Diabetologia. 2017 Jun;60(6):1114-1125.

Human mesenchymal stromal cells transplanted into mice stimulate renal tubular cells and enhance mitochondrial function. Perico L, Morigi M, Rota C, Breno M, Mele C, Noris M, Introna M, Capelli C, Longaretti L, Rottoli D, Conti S, Corna D, Remuzzi G, Benigni A. Nat Commun. 2017 Oct 17;8(1):983.

Acute Kidney Injury and Hemolytic Anemia Secondary to Mycoplasma pneumoniae Infection.Carrara C, Abbate M, Sabadini E, Remuzzi G. Nephron. 2017;137(2):148-154.

STAFFCarlamaria Zoja, Dr.Sci.Biol.Ph.D.

Capo Laboratorio

Daniela Corna, ChemistCapo Unità Modelli Sperimentali

di Malattie Renali

Mauro Abbate, Dr.Med.Capo Unità Patologia e Immunopatologia

Controllo BSA + veicolo BSA + inibitore di SGLT2

Immagini rappresentative dei podociti (cellule positive per la molecolaWT1, in rosso) presenti nei glomeruli renali di topi controllo e topi connefropatia indotta da sovraccarico di proteine (BSA) trattati o con ilveicolo o con l’inibitore di SGLT2 Come mostrato, il trattamento conl’inibitore di SGLT2 limita la perdita dei podociti nei topi con nefropatia.

WT1

IRFMN112


Il laboratorio di Organ Regeneration del Dipartimento di Medicina Molecolare di Bergamo si occupa di sviluppare nuovi approcci terapeutici per rigenerare tessuti e organi mediante l’utilizzo di cel-lule staminali. Le linee di ricerca del Laboratorio di Organ Regeneration sono: • Generazione di tessuti renali umani tridimensionali (organoidi). Gli organoidi vengono generati con cellule staminali, progenitrici renali, o pluripo-tenti indotte (hiPSCs) umane che vengono indotte a formare un tessuto renale si-mile a quello fetale mediante sistemi di coltura 3D. La maturazione degli organoidi si ottiene mediante il trapianto in vivo.• Costruzione di strutture tubulari epiteliali renali complesse e funzionanti usan-do cellule di pazienti, isolate dal rene o hiPSCs, 3D printing e sistemi di coltura 3D. Queste strutture vengono utilizzate per (i) riprodurre in vitro malattie renali, (ii) eseguire screening farmacologici personalizzati, (iii) individuare nuovi composti con potenziale terapeutico, e (iv) studiare lo sviluppo embrionale renale e sue anomalie.• Generazione di organoidi in grado di produrre eritropoietina utilizzando hiPSCs per curare l’anemia. • Studio dei meccanismi molecolari alla base della riattivazione dei programmi di sviluppo del rene, come risposta a stress cronici causati da alcune patologie (e.g. diabete) e sviluppo di strategie farmacologiche per promuovere la rigenera-zione in vivo.


Utilizzando 3D bioprinting, i nostri sistemi di coltura 3D in vitro e le cellule di pazienti affetti da malattia del rene policistico - ad oggi incurabile - abbiamo ge-nerato strutture tubulari paziente-specifiche in grado di formare cisti spontanea-mente. In questi tubuli abbiamo testato l’effetto di nuovi composti, che abbiamo comparato con farmaci noti, sulla riduzione del numero di cisti, contribuendo allo sviluppo di terapie personalizzate. Inoltre, utilizzando tubuli renali generati con hiPSCs derivate da paziente con una mutazione in PAX2 ed affetto da glomeru-losclerosi segmentale focale (FSGS), abbiamo individuato anomalie nei processi

CAPO LABORATORIO

Christodoulos Xinaris,Dr. Sci. Biol. Ph.D.

Laureato in Biologia nel 2002 presso l’Università di Atene.

Ha conseguito il titolo di Ph.D. nel 2007 presso la Scuola di Medicina di Atene. Nel 2008 si è trasferito presso l’IRCCS - Istituto di Ricerche Farma-cologiche ‘Mario Negri’ come ‘Marie Curie’ Fellow. Ha fatto esperienza in diversi laboratori di ricerca tra cui Uni-versità di Edimburgo, Scuola di Me-dicina di Vienna, European Molecular Biology Organization, focalizzando i suoi studi sullo sviluppo embrionale del rene, sulla biologia delle cellule staminali ed il loro ruolo nei processi rigenerativi.

Insegna periodicamente come Visiting Lecturer presso la Medical School dell’Università di Nicosia/St. George’s University di Londra.

Dal 2017 è capo del Laboratorio di Organ Regeneration.

Email: [email protected]. +39 035 42131

LABORATORIO DI ORGAN REGENERATION


IRFMN 113

di sviluppo, mai identificate prima, che possono avere un ruolo nella patogenesi della FSGS. Tutti questi studi sono oggetto di una pubblicazione scientifica che è attualmente in revisione.Abbiamo sviluppato un protocollo di differenziamento per la generazione di cellule umane in grado di produrre e secernere eritropoietina (EPO) quando esposte a condizioni di ipossia in vitro. Stiamo attualmente ottimizzando procedure spe-rimentali per la creazione di organoidi che possano essere (i) trapiantabili nei pazienti, (ii) in grado di maturare e (iii) produrre/secernere EPO in vivo in modo fisiologicamente controllato.Abbiamo recentemente identificato un meccanismo coinvolto sia nella regola-zione dello sviluppo degli organi sia nel metabolismo, che risulta ri-attivato la ne-fropatia diabetica. Attualmente, stiamo sviluppando nuovi approcci terapeutici in vitro ed in vivo per modulare - arrestando o revertendo - il fenomeno, allo scopo di promuovere la rigenerazione e il recupero funzionale del rene compromesso dalla malattia.


Benedetti V., Brizi V., Xinaris C., In press. ‘Generation of functional kidney organoids in vivo starting from a single-cell suspension’. Methods Mol Biol, Humana Press, Totowa, NJ.

Rodrigues-Diez R., Benedetti V., Remuzzi G., Xinaris C., 2017. ‘Tissue Engineering of Renal Tissue (Kidney)’, in Tissue Engineering for Artificial Organs: Regenerative Medi-cine, Smart Diagnostics and Personalized Medicine, Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim, Germany.

Benedetti V., Imberti B., Xinaris C., Remuzzi G., 2017. ‘Developmental Approaches to Kidney Rege-neration’, in Kidney Transplantation, Bioengineering and Regeneration, Academic Press, Elsevier Inc.

STAFFChristodoulos Xinaris Dr. Sci. Biol. Ph.D..

Capo Laboratorio

Nefrone in via di sviluppo in un organoide renale murino generato in vitro. Sono visibili il tubulo e il polo glomerulare.

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