TOSSICOLOGIA-9

TEST DI TOSSICITA’

JeanJeanJeanJean----FranFranFranFranççççois DESAPHY ois DESAPHY ois DESAPHY ois DESAPHY

Farmacologia e Tossicologia, 2015Farmacologia e Tossicologia, 2015Farmacologia e Tossicologia, 2015Farmacologia e Tossicologia, 2015

Test di Tossicità

2011© J.F. DESAPHY

Ogni sostanza chimica introdotta sul mercato o in fase di sviluppo deve

essere soggetta alla sperimentazione tossicologica per soddisfare le

normative delle agenzie governative.

Anche i prodotti di scarto dei processi industriali

sono soggetti ai test di valutazione tossicologica.

Alcuni organismi di tutela in Italia:

ISS: Istituto Superiore della Sanità (www.ISS.it)

AIFA: Agenzia Italiana del Farmaco

(www.agenziafarmaco.it)

ASL: agenzie sanitarie locali

2011© J.F. DESAPHY

ISS

ISS

2008© J.F. DESAPHY

ISS

2008© J.F. DESAPHY

SVILUPPO DEL FARMACO

2009© J.F. DESAPHY

Scoperta e selezione delle molecole

Studi pre-clinici

Richiesta di autorizzazione per sperimentazione sull’uomo

Studi clinici Fase 1 (volontari sani)

Studi clinici Fase 2 (studio pilota in pazienti)

Studi clinici Fase 3 (studio su larga scala in pazienti)

Richiesta di autorizzazione all’immissione in commercio

Immissione sul mercato

Farmacovigilanza

3

6

11

anni

0

Obiettivi

2008© J.F. DESAPHY

Valutazione della tossicità

determinazione del potenziale di ogni sostanza ad agire come veleno

e delle condizioni con cui questo potenziale può realizzarsi

determinazione dei meccanismi di tossicità

Valutazione del rischio

accertamento quantitativo della probabilità del manifestarsi degli

effetti tossici di una sostanza in determinate condizioni

Regolamentazione

controllo della produzione, trasporto, vendita, utilizzo, e smaltimento

delle sostanze chimiche considerate tossiche

Test di Tossicità

2008© J.F. DESAPHY

Proprietà chimiche e fisiche

sostanza in oggetto, probabili contaminanti, intermedi di sintesi,

prodotti di scarto, metaboliti

Esposizione e destino ambientale

Studi di degradazione (idrolisi, fermentazione, fotoreazioni, ecc...)

Degradazione nel suolo e/o nell’acqua in varie condizioni

Mobilità e dissipazione nell’ambiente

Accumulo nelle piante e negli animali, nel cibo

Effetti su animali selvatici

in animali scelti: mammiferi selvatici, uccelli, pesci ed invertebrati

tossicità acuta, accumulo, funzione riproduttiva

Test in vivo

Test in vitro

Test di Tossicità in vivo

2008© J.F. DESAPHY

Saggi in vivo

Tossicità acuta

DL50 e CL50 orale, dermica, inalatoria

irritazione oculare (vietato in molti paesi)

irritazione e sensibilizzazione cutanea

Tossicità subcronica

30-90 giorni per via alimentare, dermica, inalatoria

���� determinazione del NOAEL

Tossicità cronica e sulla funzione riproduttiva (~2 anni)

per via alimentare (inclusi test di oncogenesi)

teratogenicità e riproduzione (multi-generazionale)

Saggi specifici

neurotossicità, cardiotossicità, metabolismo

farmacodinamica, comportamento

�Somministrazione in vivo della sostanza (per via orale, cutanea, inalatoria,

iniettiva): acuta, subcronica, cronica

�Valutazione della mortalità (DL con tossicità acuta)

�Analisi dei segni clinici di tossicità

�Esame patologico post-mortem per la valutazione di anomalie tessutali

Mortalità (tossicità acuta)

2008© J.F. DESAPHY

DL50: dose che uccide la metà degli animali

% c

um

ula

tiva d

i anim

ali m

ort

i

5 5,6 6 6,7 7 7,8 8,98

dose di farmaco (mg/kg)

Num

ero

di anim

ali m

ort

i

dose di farmaco (mg/kg)

5 5,6 6 6,7 7 7,8 8,98

Istogramma delle frequenze Curva cumulativa

100 %

50 %

DL50

DL50

2008© J.F. DESAPHY

Esempio di variabilità:

Sostanza chimica Specie/genere via DL50 (mg/kg)

N-metil-N-(1-naftil)- topo/M orale 371

Fluoracetamide dermica 402

sottocutanea 250

ratto/M orale 115

dermica 300

sottocutanea 78

Fattori di variabilità della DL50:

Specie salute temperatura

Razza stato nutrizionale orario

Età contenuto intestinale stagione

Peso via di somministrazione ciclo giorno/notte

Genere stabulazione errori umani

Tossicità subcronica

2008© J.F. DESAPHY

•Prova di una ampia gamma di dosi

•Almeno due specie diverse

•Determinazione del NOAEL: “No Observed Adverse Effect Level”

dose massima che non produce effetti avversi

•Determinazione dell’ADI: “acceptable daily intake”

quantità giornaliera di un composto chimico che,

assunto per tutta la vita, non produce effetti tossici apprezzabili

•Determinazione della RfD: “reference dose”

Dose giornaliera di riferimento per l’esposizione cronica orale

Segni clinici di tossicità

2008© J.F. DESAPHY

•Aspetto (mortalità e morbidità; condizioni della pelle, del pelo, delle mucose)

•Occhi (esame oftalmologico di cornea e retina)

•Consumo di cibo ed acqua / valutazione del peso corporeo

•Anomalie comportamentali

•Frequenza respiratoria / EEG / ECG / EMG (encefalo, cardio, mio)

•Ematologia (emoglobina, ematocrito, eritrociti, leucociti, piastrine, coagulazione)

•Ematochimica (bilancio elettrolitico, acido-base, glucosio, azoto ureico, lipidi,

sieroproteine, indicatori di danno d’organo (transaminasi e fosfatasi

per il fegato; 3-metil-istidine e creatin-chinasi per il muscolo)

•Analisi delle urine (pH, densità, zuccheri, proteine, chetoni e bilirubina,

urine delle 24 ore, tossici e metaboliti)

•Analisi delle feci (sangue occulto, contenuto in fluidi, tossici e metaboliti)

Esame patologico post-mortem

2008© J.F. DESAPHY

Cartilagine

Cavità nasale

Cieco

Cervello

Cistifellea

Colon

Digiuno

Duodeno

Esofago

Ghiandole mammarie

Ghiandole salivari

Ileo

Ipofisi

Laringe

Linfonodi

Midollo spinale

Milza

Muscoli della coscia

Nervo sciatico

Occhi

Ossa

Ovari

Paratiroidi

Pelle

Polmoni e bronchi

Prostata

Reni

Retto

Stomaco

Surrene

Testicoli

Timo

Utero

Vescica

Vescicole seminali

+ Masse anomale

Necropsia

Prelievo e processo organi

Peso

Osservazione

Istologia

Inclusione dei tessuti

Colorazione

Microscopia ottica

Immuno-istochimica

Inclusione dei tessuti

Anticorpi monoclonali

Microscopia ottica

Regolazione della

sperimentazione animale

2014© J.F. DESAPHY

DIRETTIVA 2010/63/UE DEL PARLAMENTO EUROPEO E DEL CONSIGLIO

del 22 settembre 2010

sulla protezione degli animali utilizzati a fini scientifici

Test di Tossicità in vitro

2008© J.F. DESAPHY

• Colture primarie di cellule di mammifero

• Metabolismo organospecifico ben riprodotto durante le prime ore

• Quantità limitata di cellule, problemi di purezza delle cellule

• Capacità di proliferazione limitata (non adatte allo studio della mutagenesi)

• Linee cellulari

• Organo-specificità del metabolismo molto ridotta

• possibilità di manipolazione genetica (OGM)

• Batteri

• Metabolismo specifico

• possibilità di manipolazione genetica (OGM)

• struttura cromosomica diversa

• Frazioni subcellulari di organi

• Metabolismo sbilanciato verso l’attivazione

• Metabolismo extra-cellulare

• Co-coltura

• Necessita la formazione di contatti inter-cellulari

Attività metabolica in vitroTipo cellulare

Enzima Epatociti V79 Salmonella

(coltura primaria) (linea cellulare) (batteri)

Citocromo P-450 ++ -- --

UDP-glucuronosil-transferasi ++ -- --

Glutatione S transferasi ++ ++ ++

N-acetiltransferasi ++ --* ++

Fenolsulfotransferasi ++ -- --

Epossido idrolasi ++ -- --

* presente nel clone V79NH

2009© J.F. DESAPHY

Frazione S9

Attività ridotta

cit P-450 monossigenasi

UDP-glucuronosil-transf

Miscela S9

Attività ripristinata

cit P-450 monossigenasi

Attività ridotta

UDP-glucuronosil-transf

Sbilanciamento verso

l’attivazione metabolica

+ NADP

+ isocitrato

NADPH

Isocitrato deidrogenasi

S9: Frazione subcellulare di fegato di ratto

Test con i batteri

Test di mutazione genica

Test di delezione

perdita della funzione di alcuni geni

Test di retromutazione (test di Ames)

riacquisto di una funzione genica

persa in seguito ad una mutazione

Test di riparazione del DNA

ceppi con diversi capacità di riparazione del DNA

2008© J.F. DESAPHY

Test di AmesCeppi di Salmonella typhimurium che necessitano l’apporto di istidina esogena in

seguito a mutazioni nei geni che codificano per gli enzimi della biosintesi

dell’aminoacido. Si misura la capacità del composto in esame di retro-mutare

(reversioni) il gene.

La sensibilità dei ceppi viene aumentato da mutazioni ulteriori

Esistono ceppi ricombinanti per gli enzimi del metabolismo

2008© J.F. DESAPHY

Coltura di Salmonella

istidina-dipendenti

Miscela S9

Potenziale mutagene

coltura su

Agar senza

istidina

incubazione

2 giorni 37°Cmutagene

non-mutagene

Test di AmesCeppo mutazione uvrB rfa plasmidi mutagenesi

TA1535 hisG46 + + --------- sostituzione

TA100 hisG46 + + pKM101 sostituzione

TA1538 hisD3052 + + --------- frame-shift

TA98 hisD3052 + + pKM101 frame-shift

TA102 hisG428 - + pKM101, pAQ1 sostituzione

Sistema di riparazione per taglio

Mutazione in liposaccaridi

(aumentata permeabilità

di membrana)

Riparazione per ricombinazione

Aumenta la probabilità di errori

Multicopie di hisG428Tipo di

mutagenesi

evidenziato

TA 98TA 1538

TA 100

L’aflatossina B1 induce mutazioni

per sostituzione di basi

Nell’uomo, la tossina provoca

la mutazione AGG in AGT

nel codon 249 del Gene p53

associata al carcinoma

epatocellulare

2008© J.F. DESAPHY

Test con le cellule animaliTest indicatori

effetti valutati sulle cellule trattate

Legami covalenti col DNA

Rotture nella catena del DNA

Scambio di cromatidi fratelli

Riparazione del DNA

Test di aberrazioni cromosomicheeffetti valutati sulla cellula durante la fase mitotica

Test del micronucleoeffetti valutati sulle cellule figlie

Test di mutazione genicaperdita di funzione delle cellule figlie

Test di trasformazione cellulareacquisto di proprietà proliferativa

2008© J.F. DESAPHY

Test indicatori

•Formazione di legami covalenti del composto saggiato col DNA

•Composti radioattivi con 3H (costosi)

•Tecniche immunologiche (uso di anticorpi)

•Idrolisi seguita da separazione per HPLC degli aminoacidi modificati

•Idrolisi seguita da marcatura con 32P e separazione per cromatografia

•Induzione di rotture nella catena del DNA

•Eluizione alcalina

•Elettroforesi alcalina su gel di una singola cellula (test di Comet)

Lisi delle cellule trattate con detergenti e proteasi

Eluizione alcalina (pH 12-13) del DNA su filtro poroso

La quantità di DNA eluito dal filtro è proporzionale al numero di rotture

2008© J.F. DESAPHY

Test di aberrazioni cromosomiche

Incubazione di linee cellulari con potenziale clastogene

Blocco delle cellule in metafase con colchicina

Analisi citogenetica per evidenziare aberrazioni strutturali

2008© J.F. DESAPHY

cariotipocolorazione Fish

Fluorescence In situ hybridization

Trisomia 21Rotture del DNA

Scambi intercromosomici

Test del micronucleoCorpuscoli contenenti cromatina e circondati da membrana

costituiti da cromosomi interi o frammenti prodotti durante la divisione cellulare

dopo rotture cromosomiche o danneggiamento dell’apparato mitotico

Identificati al microscopio ottico dopo colorazione della cromatine

2008© J.F. DESAPHY

apoptosi

Si può praticare sia in vitro sia in vivo sul topo (si testano tre dosi di tossico

e si analizzano le cellule progenitrici dei globuli rossi)

Composto apoptotico

Composto

clastogeno

Composto

clastogeno

Test di mutazioni geniche•Test HPRT su cellule CHO (chinese hamster ovary)

6-tioguanina nucleotide citotossico

Basi puriniche libere nucleosidi monofosfatiIpoxantina fosforibosiltransferasi

sintesi DNA

Ipoxantina fosforibosiltransferasi

necrosi

Il composto saggiato in grado di mutare il gene che codifica per l’HPRT sul

cromosoma X renderà le cellule mutate resistenti alla presenza di 6-tioguanina nel

media di coltura

•Test della timidina chinasi su cellule di linfoma di topi (L5178K)

Trifluorotimidina (TFT) TFT fosforilato citotossicoTimidina chinasi

necrosi

2008© J.F. DESAPHY

Test di trasformazione cellulare•Test su linee cellulari di fibroblasti di topo

Cellule con capacità di crescita infinita ma soggette ad inibizione

della proliferazione per contatto con cellule vicine

Disinibizione della proliferazione con formazione di foci costituiti

da cellule ammucchiate facilmente individuabili dopo colorazione

mutagene

•Test su cellule embrionali di hamster siriano

mutagene

Queste cellule isolate da embrioni presentano il vantaggio di aver proprietà di

crescita normali e di possedere un’ampio corredo di enzimi metabolizzanti

Le cellule mutate si riconoscono dalla loro proprietà di crescita disordinata e da

un ratio citoplasma/nucleo assai diverso rispetto alle cellule normale.

2008© J.F. DESAPHY

FINE