Cours d’immunologie – DES Biologie médicale (USSL & USSC)

Adrien Six – septembre 2009 1

1DESCLI2009, Phnom Penh

ET01 & ET02Introduction aux techniques

immunologiques (Immunochimie)

Adrien Six (adrien.six@upmc.fr) Phnom PenhUniversité Pierre et Marie Curie septembre 2009

DES de Biologie MédicaleEnseignement d’Immunologie

2DESCLI2009, Phnom Penh

Introduction aux techniques immunologiques (Immunochimie)

1. Principe de la réaction Ag-Ac - Rappel2. Réactions de précipitation3. Réactions d’agglutination4. RIA; ELISA5. Immunoprécipitation; Western blot6. Immunofluorescence7. Techniques de tri cellulaire8. Conclusion

3DESCLI2009, Phnom Penh

Introduction aux techniques immunologiques (Immunochimie)

1. Principe de la réaction Ag-Ac - Rappel2. Réactions de précipitation3. Réactions d’agglutination4. RIA; ELISA5. Immunoprécipitation; Western blot6. Immunofluorescence7. Techniques de tri cellulaire8. Conclusion

4DESCLI2009, Phnom Penh

Réaction antigène/anticorps

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Réaction antigène/anticorps

6DESCLI2009, Phnom Penh

Production d’anticorps

monoclonaux

7DESCLI2009, Phnom Penh

Introduction aux techniques immunologiques (Immunochimie)

1. Principe de la réaction Ag-Ac - Rappel2. Réactions de précipitation3. Réactions d’agglutination4. RIA; ELISA5. Immunoprécipitation; Western blot6. Immunofluorescence7. Techniques de tri cellulaire8. Conclusion

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Précipitation en milieu liquide

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9DESCLI2009, Phnom Penh

Précipitation interfaciale

Techniquedu “ring test”(test qualitatif)

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Diffusion unidimensionnelle

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Diffusion simple bidimensionnelle

Technique de Mancini

Immunodiffusion radiale

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Précipitation en milieu solideTechnique d’Ouchterlony

Immunodiffusiondouble

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Immunoélectrophorèse (Grabar/Williams)Combine électrophorèse et immunodiffusion double:1. Séparation électrophorétique

d’une source d’antigènes selon leur charge

2. Immunodiffusion radiale des antigènes séparés

3. Immunodiffusion d’une source d’anticorps déposée dans une gouttière sur l’un ou l’autre des côtés des antigènes séparés

4. Formation éventuelle d’arcs de précipitation

Analyse qualitative

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Immunoélectrophorèse en fusée

- Analyse quantitative- Nécessité que l’Ag soit chargé négativement

Technique de Laurell:

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Immunoélectrophorèse bidimensionnelle

Analyse qualitative & quantitative16DESCLI2009, Phnom Penh

Introduction aux techniques immunologiques (Immunochimie)

1. Principe de la réaction Ag-Ac - Rappel2. Réactions de précipitation3. Réactions d’agglutination4. RIA; ELISA5. Immunoprécipitation; Western blot6. Immunofluorescence7. Techniques de tri cellulaire8. Conclusion

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17DESCLI2009, Phnom Penh

Réaction d’agglutination

Qualitatif: très sensible; Quantitatif: peu précis18DESCLI2009, Phnom Penh

Test de Coombs directRecherche d’anticorps anti-Rhésus chez le nouveau-né

19DESCLI2009, Phnom Penh

Test de Coombs indirectRecherche d’anticorps anti-Rhésus chez la mère

20DESCLI2009, Phnom Penh

Introduction aux techniques immunologiques (Immunochimie)

1. Principe de la réaction Ag-Ac - Rappel2. Réactions de précipitation3. Réactions d’agglutination4. RIA; ELISA5. Immunoprécipitation; Western blot6. Immunofluorescence7. Techniques de tri cellulaire8. Conclusion

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RIA/ELISA

RadioImmunoAssay/Enzyme-linked ImmunoSorbentAssay22DESCLI2009, Phnom Penh

ELISA indirect

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ELISA sandwich

24DESCLI2009, Phnom Penh

ELISA compétitif

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ELISpot

26DESCLI2009, Phnom Penh

Introduction aux techniques immunologiques (Immunochimie)

1. Principe de la réaction Ag-Ac - Rappel2. Réactions de précipitation3. Réactions d’agglutination4. RIA; ELISA5. Immunoprécipitation; Western blot6. Immunofluorescence7. Techniques de tri cellulaire8. Conclusion

27DESCLI2009, Phnom Penh

Immunoprécipitation

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Western blot1

2

3

4

5

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29DESCLI2009, Phnom Penh

Introduction aux techniques immunologiques (Immunochimie)

1. Principe de la réaction Ag-Ac - Rappel2. Réactions de précipitation3. Réactions d’agglutination4. RIA; ELISA5. Immunoprécipitation; Western blot6. Immunofluorescence7. Techniques de tri cellulaire8. Conclusion

30DESCLI2009, Phnom Penh

Immunofluorescence - principe

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Immunofluorescence - exemple

Coupe de pancréas:Anticorps « vert » dirigé contre GAD (glutamic acid decarboxylase) marque les cellules β des îlots de LangerhansAnticorps « orange » dirigé contre l’hormone glucagon marque les cellules α

32DESCLI2009, Phnom Penh

Cytométrie de flux (1)

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33DESCLI2009, Phnom Penh

Cytométrie de flux (2)

34DESCLI2009, Phnom Penh

Cytométrie de flux (3)

35DESCLI2009, Phnom Penh

Introduction aux techniques immunologiques (Immunochimie)

1. Principe de la réaction Ag-Ac - Rappel2. Réactions de précipitation3. Réactions d’agglutination4. RIA; ELISA5. Immunoprécipitation; Western blot6. Immunofluorescence7. Techniques de tri cellulaire8. Conclusion

36DESCLI2009, Phnom Penh

Tri cellulaire par « panning »

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37DESCLI2009, Phnom Penh

Tri cellulaire par cytométrie

38DESCLI2009, Phnom Penh

Tri cellulaire magnétique

39DESCLI2009, Phnom Penh

Introduction aux techniques immunologiques (Immunochimie)

1. Principe de la réaction Ag-Ac - Rappel2. Réactions de précipitation3. Réactions d’agglutination4. RIA; ELISA5. Immunoprécipitation; Western blot6. Immunofluorescence7. Techniques de tri cellulaire8. Conclusion

40DESCLI2009, Phnom Penh

Sensibilité des techniques de détection

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41DESCLI2009, Phnom Penh

PCR-ELISA

A. VanderBorght et al. (1999) J.Immunol.Methods 223:47.

42DESCLI2009, Phnom Penh

Immuno-PCR

M. C. Case et al. (1999) J.Immunol.Methods 223:93.

43DESCLI2009, Phnom Penh

Panama-blot

D. Stahl et al. (2000) J.Immunol.Methods 240:1.44DESCLI2009, Phnom Penh

Immunoproteomics

Francisco J. Quintana, Peter H. Hagedorn, Gad Elizur, Yifat Merbl, Eytan

Domany, and Irun R. Cohen. Functional immunomics: Microarray

analysis of IgG autoantibody repertoirespredicts the future response of mice to

induced diabetes.PNAS 101:14615-14621, 2004.