ALMA MATER STUDIORUM - UNIVERSITA’DI BOLOGNA

Dottorato di Ricerca in Oncologia Coordinatore Chiar.mo Prof. Sandro Grilli

CARATTERIZZAZIONE MOLECOLARE

DEL SARCOMA SINOVIALE MONOFASICO:

LA REGIONE CROMOSOMICA 3p21.3-p23

Presentata dalla Dott.ssa . Relatore Laura Pazzaglia Chiar.mo Prof. Mario Mercuri

Anno Accademico 2004-2005 XVIII ciclo

INDICE

1 – INTRODUZIONE pag. – I sarcomi delle parti molli 3 – Il sarcoma sinoviale 5 – caratteristiche istopatologiche 6 – corso e prognosi 8 – trattamento 8 – caratteristiche immunoistochimiche 6 – citogenetica 9 – Alterazioni cromosomiche e cancro 11 – Il cromosoma 3p 12 – Il gene MLH1 14 – Il gene RASSF1 16

– Le applicazioni della Real Time PCR nella ricerca sul cancro 18

2 – SCOPO DELLA TESI 20 3 – MATERIALI E METODI Analisi genetica – Casistica 21 – Microdissezione 22 – Estrazione del DNA e DOP-PCR 22 – CGH-Microarrays 23 – Real Time PCR 24 – Il metodo del 2-

���CT 28

– QuMA 31 Analisi d’espressione

– Casistica 34 – Estrazione dell’RNA 34 – Retrotrascrizione 36 – Analisi d’espressione mediante Real Time PCR 36 – Immunoistochimica 38

4 – RISULTATI pag. Analisi genetica – CGH-Microarray 39

– QuMA 42

Analisi d’espressione

– Analisi espressione genica di MLH1 e RASSF1 43 – Analisi espressione proteica di MLH1 e RASSF1 45 5 – DISCUSSIONE 47 6 – BIBLIOGRAFIA 53

INTRODUZIONE

I sarcomi delle parti molli

I Sarcomi delle parti molli sono un complesso gruppo di lesioni rare di origine mesenchimale molte

delle quali distinguibili dalle altre solo attraverso un’attenta indagine istologica ed

ultramicroscopica. Si presentano più frequentemente come una massa asintomatica in un’estremità

del corpo, tuttavia possono localizzarsi ovunque ed in particolare nel tronco, nel retroperineo, nella

testa e nel collo. Rappresentano meno dell’1% dei tumori totali negli adulti e dal 7 al 10% dei

tumori totali nei bambini. Più del 95% sono benigni, fra i maligni i più frequenti sono l’ istiocitoma

fibroso maligno (35%), il liposarcoma (25%), il sarcoma sinoviale (10%) ed il leiomiosarcoma

(10%) (Tab.1).

In generale i sarcomi delle parti molli non sembrano originare da trasformazione

maligna o dedifferenziazione di tumori benigni degli stessi tessuti, inoltre, in

contrasto con l’ampia varietà di tipi istologici, presentano molte caratteristiche

cliniche e patologiche in comune. Ad esempio, il comportamento clinico di molti di

questi tumori è simile e, come definito dal sistema di stadiazione, è determinato dalla

localizzazione anatomica (profondità), dal grado istologico e dall’ estensione del

tumore.

La loro diagnosi è problematica poiché sono tumori rari, di cui il 15-20% poco

differenziati, con un’ampia varietà cellulare tale da rendere la loro classificazione

difficile. Inoltre, sottotipi istologici morfologicamente simili presentano differenze

citogenetiche e molecolari che ne influenzano la prognosi.

La mortalità associata ai sarcomi delle parti molli è circa del 50% probabilmente per

la propensione di questi tumori a sviluppare metastasi. Il pattern dominante di

metastasi è ematico. La metastasi linfonodale è in genere rara, con l’eccezione di

alcuni tipi istologici (1).

I stogenesi Basso grado Alto-grado

Fibroso Fibrosarcoma a gradi 1,2 Fibrosarcoma infantile

Fibrosarcoma a gradi 3,4

Fibroistiocitico Dermatofibrosarcoma protuberans Fibroxantoma atipico

Istiocitoma fibroso maligno

Adiposo Liposarcoma (ben differenziato, mixoide)

Liposarcoma (pleomorfico, a cellule rotonde, dedifferenziato)

Muscolare liscio

Leiomiosarcoma a gradi 1,2 Leiomiosarcoma a gradi 3,4

Muscolare striato

Rabdomiosarcoma (embrionale, alveolare, pleomorfico)

Vascolare Emangioendotelioma Sarcoma di Kaposi Emangiopericitoma

Angiosarcoma Sarcoma di Kaposi Emangiopericitoma

Sinoviale Sarcoma sinoviale

Neurale Neurinoma maligno Neuroepitelioma periferico Sarcoma di Ewing / PNET

Cartilagineo Condrosarcoma (mixoide, sinoviale)

Condrosarcoma mesenchimale

Osseo Osteosarcoma

Istogenesi incerta

Sarcoma alveolare Sarcoma epitelioide Sarcoma a cellule chiare dei tendini

Tabella 1. Classificazione dei sarcomi delle parti molli (modificata da Campanacci M. “Soft tissue Tumors” 1999).

Il sarcoma sinoviale

I l Sarcoma Sinoviale (SS) è un tumore maligno che colpisce maggiormente i

maschi dai 15 ai 40 anni. Nell'80% dei casi si localizza negli ar ti, sia infer ior i che

super ior i e solo nel 10% all' interno di ar ticolazioni (fig.1); generalmente si trova

vicino ad un'ar ticolazione maggiore, strettamente connessa ai tendini (1).

Figura 1 - Casistica degli Istituti Ortopedici Rizzoli di Sarcoma Sinoviale. I casi sono classificati in base a età, sesso e sede del tumore. Tipicamente le cellule sinoviali sono simili a quelle fibroblastiche (2,3) tuttavia il

sarcoma sinoviale non assomiglia al normale tessuto sinoviale e la presenza di

questo tumore in altre localizzazioni ha contr ibuito alla conclusione che questo

non abbia or igine sinoviale (4) ma der ivi dal tessuto mesenchimale (2)(4)(5).

Infatti sono stati r ipor tati in letteratura siti inusuali di localizzazione come il

retroper ineo (6), la pleura ed il polmone (7), il cuore (8), la pelle (9), la prostata

(10) ed il sistema nervoso centrale (11). La maggior par te dei SS sono

localizzati entro 5 cm dall’ar ticolazione e solo raramente coinvolgono le

membrane sinoviali. Le masse più grosse sono di solito ben delimitate,

fermamente attaccate alle strutture sottostanti e mostrano frequenti loci di

calcificazione. Grosse calcificazioni tendono ad indicare lesioni meno aggressive

e con una prognosi più favorevole. I tumor i meno differenziati mostrano aree di

necrosi, emorragie e margini infiltranti.

Caratteristiche istopatologiche

Microscopicamente i sarcomi sinoviali sono classificati in quattro sottogruppi in

base alla loro istomor fologia : tipo bifasico che presenta cellule epiteliali e cellule

fusate; tipo monofasico fibroso che presenta solo cellule fusate , tipo monofasico

epiteliale raro che presenza solo cellule epiteliali ed il tipo scarsamente

differenziato (1).

Nel SS bifasico che è stimato comprendere tra il 20% ed il 30% di tutti i

sarcomi sinoviali (12) vi è una distr ibuzione bilanciata delle due componenti. Le

cellule epitelioidi sono globose, cubiche o cilindr iche con grandi nuclei

vescicolar i, abbondante citoplasma e limiti ben definiti. Sono disposte in cordoni

solidi e spirali con spazi simili a cisti con secrezioni granular i od omogenee. Le

cellule fusate sono ben or ientate, all’apparenza uniformi con r idotto e indistinto

citoplasma e nucleo ovale. Queste formano solide e compatte masse con noduli

ir regolar i.

Nel tipo monofasico (fig.2) fibroso le cellule fusate sono la componente

pr incipale della lesione e solo piccoli foci di cellule epiteliali sono visibili. Questo

è il sottotipo più comune, stimato tre il 60 e il 75% ( 13).

Nel tipo monofasico epiteliale raro prevalgono formazioni pseudoghiandolar i.

I l tipo scarsamente differenziato non presenta una distinzione chiara tra le due

componenti e frequentemente mostra un aspetto simile all’emangioper icitoma

con spazi vascolar i ben dilatati (3). In rar i casi è tutto interamente scarsamente

differenziato ed è usuale r iconoscere aree di tipo bifasico.

Figura 2 - Sarcoma sinoviale monofasico. Sono ben visibili le cellule fusate. (Ematossilina/Eosina, 10x)

Corso e prognosi

Clinicamente si presenta come una massa localizzata in profondità, dolente alla

palpazione ed infatti il dolore può essere il pr imo sintomo della malattia. I l

tumore ha crescita lenta ed insidiosa ed i sintomi durano dai 2 ai 4 anni, anche se

possono ar r ivare fino ai 20 anni. La crescita avviene usualmente a livello dei

tendini, delle mucose, dello scheletro e del muscolo e su diversi piani,

infiltrandosi tra la struttura e creando tappi intravascolar i. Un decorso clinico

favorevole è spesso associato con lo stato della malattia alla diagnosi. Un recente

studio ha mostrato che la sopravvivenza a 10 anni di pazienti con tumore

pr imar io era del 55%, con recidiva locale era del 11%, con metastasi del 15% e

con recidiva più metastasi dello 0% (14). Alcuni fattor i prognostici favorevoli

sono la dimensione del tumore più piccola di 5 cm, la giovane età del paziente, la

locazione distale nelle estremità (2), il basso rappor to apoptotico del tumore (15)

e la bassa immunoreattività al K i-67 (2).

Trattamento

I l sarcoma sinoviale è molto maligno e poco radiosensibile, la miglior condotta

terapeutica consiste nell’ intervento demolitore, sacr ificando strutture di

impor tanza funzionale o amputando l’ intero ar to. La chirurgia conservativa

r isulta difficile per la grandezza caratter istica del tumore. Quando possibile,

l’ intervento conservativo è spesso associato a chemioterapia adiuvante. Da

alcuni anni il protocollo prevede pr ima dell’ intervento operator io il trattamento

radioterapico. Locali recidive sono comuni dopo 10 anni dall'operazione. Nel

50% dei casi è stata evidenziata la presenza di metastasi. La sede più frequente è

il polmone (94% dei casi) ma metastasi sono state r ilevate anche nei linfonodi e

nel midollo osseo (2).

Caratteristiche immunoistochimiche

La distinzione di questo tumore da altr i sarcomi poco differenziati r isulta

difficile da un esame istopatologico. In clinica i sarcomi sinoviali vengono

caratter izzati mediante il loro profilo immunoistochimico. La citocheratina

(marker citoplasmatico per le cellule epiteliali) e l’EMA (antigene epiteliale di

membrana) r isultano positivi sia nella componente a cellule epiteliali che nella

componente a cellule fusate. Usualmente sia il tipo monofasico che il tipo

bifasico mostrano reattività alla vimentina, un marker mesenchimale (2).

Citogenetica

Molti studi hanno individuato nel sarcoma sinoviale la presenza di una traslocazione bilanciata

specifica e ricorrente (16): t(x;18)(p11.2;q11.2).

Questa traslocazione, specifica per i sarcoma sinoviale, è un marker diagnostico

estremamente utilizzato.

La traslocazione t(x;18) o altre var ianti traslocazioni che coinvolgono questi due

cromosomi si trovano in un’alta porzione di sarcomi sinoviali indifferentemente

dal sottotipo istologico. Questo sembrerebbe indicare un suo ruolo nel processo

di tumor igenesi piuttosto che di differenziazione epiteliale (17).

A livello molecolare, un’ identica traslocazione citogenetica r iguarda il gene SS18

(SYT) in 18q12 ed uno dei due geni cor relati SSX1 e SSX2 (raramente SSX4),

entrambi localizzati in Xp11.2, e por ta alla formazione di un gene di fusione

chimer ico SS18/SSX1 o SS18/SSX2 (13).

Studi citogenetici hanno dimostrato l’esistenza di un’ampia gamma di

aber razioni numer iche secondar ie in aggiunta alla traslocazione t(X;18) (18).

Ulter ior i studi mediante CGH (Comparative Genomic Hybr idization) hanno

r ivelato soprattutto nel sarcoma sinoviale di tipo monofasico, amplificazioni e

perdite di inter i cromosomi o par te di essi, ma con alcuni cromosomi più alterati

di altr i (19). In par ticolare le aber razioni più frequenti sono r isultate

l’amplificazione del cromosoma 8q e di alcune regioni del 12q, la delezione della

regione 13q21-31 e la perdita del cromosoma 3p.

I dati in letteratura sono comunque ancora limitati e mostrano r isultati

var iabili e difficilmente cor relabili con la differenziazione tumorale. Nella

tabella 2 sono r ipor tate le più frequenti alterazioni r iscontrate.

Acquisizione di materiale

genetico

Perdita di materiale

genetico

1 q24-qter 1cen-p36

2p 2q31.1-2q37.3

2q13-22 3p

3q 3cen-3q23

8q 5p11-5p15.3

9p11-24.3 9p13.1-9p24.3

12q14-15 9q11-9q34.3

12q23-qter 10q21

14p11-p23.3 11q14-qter

16p 13q12-34

17q22-qter 14q11.1-23.3

19p13.3-q13.4 16q

21p13-q22.3 Xq21-qter

Tabella 2 - Più frequenti alterazioni genetiche del sarcoma sinoviale monofasico r iscontrate in letteratura (NCBI database)

Alterazioni cromosomiche e cancro

La relazione tra alterazioni cromosomiche e cancro costituisce uno dei più complessi problemi della

r icerca oncologica a causa della difficoltà di distinguere fra effetto casuale, concomitante o

conseguente del danno sullo sviluppo del tumore. E’ possibile che le aberrazioni cromosomiche

possano attivare, con r iassetti cromosomici e con l’amplificazione genica, protooncogeni cellular i

oppure determinare la perdita, nel caso di delezioni, di onco-soppressor i, la cui espressione è r istretta

a momenti specifici durante la crescita tumorale. I prodotti dei protooncogeni sono proteine la cui

normale funzione è di regolare le r isposte della cellula ai segnali proliferativi esterni, sono quindi

coinvolti nell’embriogenesi, nella proliferazione e nel differenziamento cellulare (20).

I prodotti dei geni oncosoppressori inibiscono gli eventi che possono condurre ad una

proliferazione anomala delle cellule: prevengono la progressione del ciclo cellulare,

inducono l’apoptosi, sovrintendono la stabilità del genoma e mantengono basso il

tasso di mutazione garantendo un’accurata replicazione.

I geni oncosoppressori non possono essere tuttavia così facilmente individuati, in

quanto la loro ipotizzata funzione nella regolazione della crescita cellulare può essere

indirettamente dedotta solo nelle situazioni patologiche, quando essi sono inattivati o

addirittura mancanti. La genetica degli oncosoppressori è recessiva: esperimenti di

fusione genica mostrano che il fenotipo trasformato può essere corretto in vitro

attraverso la fusione della cellula trasformata con una cellula normale. Per quanto

detto, le cellule eterozigoti per il gene, che presentano un allele normale ed un allele

mutato, hanno un fenotipo normale. Tuttavia esistono numerosi meccanismi che

conducono alla cosiddetta “perdita di eterozigosi” , cioè la perdita del gene normale e

da qui la predisposizione della cellula al fenotipo trasformato. Fra questi, la delezione

dell’ allele normale, del braccio o dell’ intero cromosoma su cui mappa il gene

selvaggio; la perdita del cromosoma su cui è localizzato il gene normale seguito dalla

duplicazione del cromosoma che porta l’ allele mutato e infine la ricombinazione

mitotica.

I geni oncosoppressori possono essere inattivati anche a seguito di mutazioni

puntiformi e per eventi di metilazione del DNA. Il più probabile meccanismo

attraverso il quale la metilazione inibisce la trascrizione è la riduzione dell’ affinità di

legame tra fattori di trascrizione e le corrispondenti sequenze bersaglio. Nelle cellule

tumorali il livello di metilazione è generalmente ridotto e questo cambiamento può

contribuire alla instabilità genomica. Tuttavia, nello stesso tumore, accanto alla

ipometilazione è stata osservata anche la metilazione aberrante di geni normalmente

non metilati (21).

I l cromosoma 3p

Fra le molteplici aberrazioni che caratterizzano il sarcoma sinoviale, di notevole interesse risulta la

perdita del braccio corto del cromosoma 3. Delezioni del 3p sono frequenti in molti tumori

dell’adulto: polmone, mammella, ovario, testicolo e carcinomi della testa e del collo (22). Su questo

cromosoma mappano numerosi geni oncosopressori (fig.3) : VHL in 3p25-26 (von Hippel-Lindau

disease), RAR-� in 3p24 (retinoic acid receptor), RASSF1 in 3p21.3 (RAS association domain

family 1), FHIT in 3p14.2 (fragile histidine triad) e il gene MLH1 in 3p21.3-p23 (mutL homolog 1)

(23,24,25).

Figura 3 - Schema del braccio corto del cromosoma 3.

Il gene VHL è coinvolto nella regolazione della risposta trascrizionale all’ ipossia (26). E’ associato

con il cancro ereditario della sindrome di von Hippel-Lindau (23), che predispone l’ individuo

affetto ad una varietà di tumori, e mostra frequentemente perdita di eterozigosi nel tumore

polmonare (27).

L’acido retinoico è coivolto nello sviluppo e nella differenziazione (28) quindi è evidente

l’ importate ruolo che gioca il gene RAR-� nella regolazione della crescita delle cellule epiteliali e

nella tumorigenesi (29). Una diminuzione dell’espressione di RAR-� è stata trovata in molti tumori

umani (30), la metilazione della regione promotrice è stata evidenziata come meccanismo di

inattivazione di quasto gene (31).

Per quanto riguarda il gene FHIT è ormai ampiamente dimostrato il suo coinvolgimento nello

sviluppo di differenti tipi di tumori sporadici, includendo il tumore polmonare.

Il gene MLH1 coinvolto nel meccanismo del riparo del DNA ed il gene RASSF1 verranno discussi

più dettagliatamente nella sezione successiva.

In particolare la perdita di eterozigosi della regione 3p21.3 è estremamente comune in molti tumori

tra cui il tumore polmonare, il carcinoma mammario, il carcinoma ovarico, i tumori del naso-

faringe e quelli renali (22,32,33,34).

Il braccio corto del cromosoma 3 sembra dunque essere il luogo dove durante lo sviluppo tumorale,

potenzialmente avviene l’ inattivazione di numerosi geni.

MLH1

Il gene MLH1 è stato identificato per la prima volta nel cancro ereditario non

poliposo al colon (HNPCC) come un locus frequentemente mutato. È l’omologo

umano del gene mutL di E.coli, il quale codifica per una proteina che fa parte del

sistema di riparazione degli errori di appaiamento (MMR- mismatch repair) .

Il prodotto di MLH è una proteina di 84.6 kDa caratterizzata da una sequenza di 150

aminoacidi tipica delle proteine omologhe a MutL e MutS (fig.4). La regione

comprende un dominio elica-giro-elica associato ad un sito di legame per nucleotidi

adeninici e a un sito di legame per lo ione magnesio. MLH1 forma eterodimeri con le

altre proteine (MLH3,PMS1,PMS2) e fa parte del complesso di sorveglianza del

genoma associato a BRCA1 (BASC) (35).

Figura 4 - Diagramma della proteina MLH1. I numeri dentro i blocchi blu indicano gli esoni dai quali è traslata ogni parte della proteina. I tre blocchi gialli rappresentano il dominio ATPase, il dominio di interazione omologo MutS e il dominio di interazione PMS2/MLH3/PMS1.C:carbossi-terminale; N: Amino-terminale.(Da: www.infobiogen.fr “ Atlas of genetics and cytogenetics in oncology and haematology”).

Le funzioni del sistema MMR sono quelle di correggere gli errori di appaiamento fra

le basi e di eliminare le anse che possono risultare dopo la replicazione del DNA o

dopo eventi di ricombinazione. Del sistema fanno parte proteine con funzione

elicasica, polimerasica ed endonucleasica. La proteina MLH1 ha particolare affinità

di legame per gli appaiamenti errati GT e possiede un basso livello di attività

ATPasica (36).

Perdita o mutazioni di questo gene sono state riscontrate, oltre al colon retto, anche

in diversi altri tipi di tumori: renale (37), pancreatico (38), gastrico (39), ovarico

(40).

Sono state individuate diverse isoforme della proteina, frutto di eventi di splicing

alternativi. L’espressione del gene viene regolata dall’ ipermetilazione del promotore

in un’ isola CpG putativa a monte del sito di inizio della trascrizione (41,42,43).

RASSF1

Il gene RASSF1 è lungo 11.6 Kb, è formato da sei esoni e contiene due promotori,

uno a monte del primo esone ed uno interno, localizzato fra due esoni. Sono stati

identificati sette trascritti (A, B, C, D, E, F e G), originati da eventi di splicing

alternativo e dalla diversa attività dei due promotori (fig.5).

La proteina Rassf1A ha una massa di circa 39 kDa ed è lunga 344 aminoacidi. È

caratterizzata all’ estremità C-terminale da omologia di sequenza (55%) con la

proteina murina Nore1 e con la proteina del ratto Maxp1, entrambe appartenenti alla

famiglia degli effettori RAS. All’N-terminale contiene una regione ricca di residui di

cisteina, simile al dominio C1 (dominio di legame del diacil glicerolo), tipico della

famiglia delle proteine chinasi C. Sempre all’N-terminale sono presenti un dominio

SH3 e un dominio di associazione a Ras (RA).

Rassf1A può indurre l’ arresto del ciclo cellulare partecipando al punto di controllo

sovrinteso dalla famiglia di proteine Rb (Rb, p107 e p130) fra la fase G1 ed S,

durante il quale l’ iperfosorilazione di Rb da parte dei complessi CDK4-ciclina D e

CDK2-ciclina E, consente la progressione del ciclo in fase S. La proteina Rassf1A

regola negativamente l’accumulo delle cicline D endogene attraverso un meccanismo

post-trascrizionale, bloccando le cellule in G1 (44). I meccanismi molecolari con cui

agisce sono tuttora da chiarire.

Un’ulteriore funzione di controllo attribuita alla proteina è quella di regolare la

stabilità dei microtubuli, garantendo perciò il corretto attacco ai cromosomi e la

stabilità del fuso mitotico (45).

Rssf1A risulta inoltre coinvolta nella progressione della mitosi perché regola la

stabilità delle cicline della fase M inibendo il complesso APC-Cdc20 (46) e mostra

attività apoptotica.

L’ inattivazione epigenetica di RASSF1 è stata osservata di frequente in molti tumori

solidi e in diversi tipi di cancro sporadici (47, 48, 49).

Il ruolo di Rassf1 come importante oncosoppressore è stato confermato da studi di

espressione genica su cellule tumorali transfettate con RASSF1A con i quali sono

stati individuati oltre 60 geni potenzialmente regolati dal suo prodotto, fra cui

numerosi con un ruolo nella genesi dei tumori (50).

Figura 5 - Mappa dei loci, dei trascritti e dei domini proteici di RASSF1.

A.Struttura esone (blocco)-introne (linea) del locus RASSF1 con la localizzazzione delle isole CpG nelle regioni promotrici di RASSF1A e RASSF1 C .B.Schema del trascritto di RASSF1A e sequenza della proteina. Sono visibili la regione src omologa 3 (SH3)-binding, il dominio putative diacylglycerol (DAG)-binding, la sequenza PEST, il dominio RAS association. C. Schema del trascritto di RASSF1C e sequenza della proteina. D.Schema del trascritto di RASSF1F e sequenza della proteina (modificata da Burbee DG et al. J Natl Cancer Inst.2001 May 2;93(9):691-9)

Le applicazioni della Real Time PCR nella r icerca sul cancro

Grazie alla sua semplicità concettuale e di realizzazione, la Real Time PCR è ormai

una delle tecniche di biologia molecolare più utilizzata per lo studio del quadro delle

alterazioni dei geni e della loro espressione in diverse condizioni patologiche. La

PCR quantitativa e in particolare il metodo Real Time, trova infatti applicazione in

moltissimi settori di ricerca che mirano a individuare le possibili variazioni genetiche

in determinate condizioni patologiche. Nei laboratori clinici e di ricerca la PCR

quantitativa è utilizzata per la diagnosi di malattie infettive, la quantificazione della

carica virale, la diagnosi di malattie con componente genetica e lo studio delle

aberrazioni cromosomiche (squilibrio allelico, amplificazioni, traslocazioni,

delezioni).

La PCR quantitativa costituisce un mezzo potente attraverso il quale si possono

ottenere preziose informazioni sulla genesi e sullo sviluppo delle neoplasie. Per

esempio, l' identificazione di trascr itti tessuto-specifici è alla base

dell' individuazione di quei geni implicati nello sviluppo di patologie tumorali che

possono costituire bersagli molto specifici per nuovi farmaci.

Recentemente è stata sviluppata una tecnica alternativa basata sulla Real Time

PCR chiamata Quantitative M icrosatellite Analysis (QuMA) che utilizza la

distr ibuzione dei loci microsatellitar i negli eucar ioti per individuare il guadagno

o la perdita del numero di copie di DNA (51). I microsatelliti sono piccole regioni

costituite da r ipetizioni in sequenza multipla di unità composte da mono, di-, tr i-

o tetra-nucleotidi allineate una dopo l’altra lungo un tratto di DNA. Sono stati

identificati microsatelliti conteneti tutte le combinazioni nucleotidiche ma la

classe piu abbondante nel genoma umano è costituita dal dimero CA (CA

repeat). La tecnica QuMA è stata utilizzata per studiare il guadagno e la perdita

del numero di copie di Dna nel tumore ovar ico (52) e per studiare le alterazioni

del cromosoma 1p e 19q nel oligodendroglioma (53). Questa metodologia sembra

essere comparabile con altre tecniche di analisi quali la CGH e permette

un’analisi più veloce e meno costosa del genoma tumorale.

SCOPO DELLA TESI

I l sarcoma sinoviale è un raro tumore maligno delle par ti molli, un complesso

gruppo di lesioni di or igine mesenchimale che presentano problemi sia di

carattere diagnostico, data la loro scarsa differenziazione e l’ampia var ietà

cellulare che ne rende difficile la classificazione, sia di carattere prognostico.

Esistono infatti a tutt’oggi pochi determinanti affidabili all’outcome clinico. E’

quindi evidente la necessità di cercare possibili nuovi marker che possano

aiutare la classificazione e predir re il compor tamento di questi tumor i in modo

da poter agire con terapie adeguate.

I l sarcoma sinoviale è caratter izzato dalla traslocazione t(x;18)(p11.2;q11.2),

che compor ta la fusione del gene SYT sul cromosoma 18 con i geni SSX1 o

SSX2 o raramente con SSX4 sul cromosoma X. I l trascr itto di fusione r isultante,

SYT-SSX1 o SYT-SSX2, è ormai utilizzato clinicamente nella diagnosi di questo

tumore. Studi citogenetici mediante CGH hanno mostrato molte alterazioni

cromosomiche secondar ie in diversi cromosomi soprattutto nel sarcoma

sinoviale monofasico (19) comunque i dati in letteratura sono ancora limitati e

mostrano r isultati var iabili e difficilmente cor relabili con la differenziazione

tumorale.

Lo scopo di questo studio è stato perciò quello di valutare gli aspetti molecolar i

di una ser ie di sarcomi sinoviali monofasici ad alto grado per meglio

caratter izzare i parametr i biologici indicativi dell’elevata aggressività di questo

tumore.

A tal fine è stata effettuata in 8 casi l’analisi del profilo genico per individuare le

possibili aber razioni genetiche e in una casistica più ampia è stata valutata

l’espressione dei geni RASSF1 e MLH1, contenuti nella regione cromosomica

3p21.3-p23, per studiare il loro ruolo nel complesso sviluppo di questo tumore.

MATERIALI e METODI

Analisi genetica

Casisitica

Lo studio è stato condotto su 8 casi clinici di sarcoma sinoviale monofasico delle

estremità selezionati dalla banca dell’ I stituto Or topedico Rizzoli da un gruppo

di esper ti patologi. La diagnosi è stata effettuata sui campioni colorati in

ematossilina-eosina in accordo con i cr iter i istopatologici e citogenetici (54). Per

tutti i campioni la percentuale di cellule tumorali era uguale o super iore al 90%.

Di ogni caso si disponeva sia di adeguato mater iale tumorale che del

cor r ispettivo tessuto sano adiacente. E’ stato possibile utilizzare sia il mater iale

fresco, conservato a -80°C presso la banca dei tessuti del Laborator io di Ricerca

Oncologica, che il cor r ispettivo pezzo fissato in formalina ed incluso in

paraffina. Sono stati considerati pazienti che al momento del prelievo istologico

non erano stati sottoposti a nessun tipo di terapia (radioterapia o chemioterapia)

preoperator ia. Le caratter istiche cliniche e patologiche dei pazienti sono

r ipor tate in tabella 3.

Caso

n° Sesso Età Sede Grado Massa,

cm Outcome Follow-up

mesi Ploidia

1 F 57 inf III > 5 DOD 8 diploide 2 F 55 inf IV > 5 DOD 2 diploide 3 M 46 inf III < 5 NED 40 diploide 4 F 45 sup III < 5 DOD 45 aneuploide 5 M 39 inf IV > 5 DOD 14 aneuploide 6 F 74 inf III > 5 NED 65 diploide 7 M 49 inf IV > 5 DOD 15 aneuploide 8 F 46 inf IV > 5 NED 41 aneuploide F=Femmina; M=maschio; NED= non evidenza di malattia; DOD = morto di malattia inf = arto inferiore; sup = arto superiore.

Tabella 3. Caratteristiche cliniche e patologiche degli 8 pazienti selezionati.

Microdissezione

Sezioni di tessuto fissate in formalina ed incluse in paraffina dello spessore di �

5µµµµm sono state tagliate al microtomo. Le sezioni sono state deparaffinate in

xilolo, reidratate attraverso passaggi in etanolo 100%, 70% ed in acqua

distillata. Infine sono state colorate con eosina Y e successivamente

microdissezionate mediante Laser Capture M icrodissection (LCM)(55)

utilizzando lo strumento PixCell Laser Capture M icroscope (Arcturus). Circa

2000 cellule sono catturate mediante impulsi laser (30µµµµm) r imanendo attaccate

ad una membrana termoplastica posta su una piccola cap trasparente. In questo

modo è stato possibile ottenere cellule tumorali e cellule sane dallo stesso

campione.

Dopo la microdissezione dal tessuto posto sulla cap è stato immediatamente

estratto il DNA.

Estrazione del DNA e DOP-PCR

L’estrazione e la pur ificazione di DNA è stata effettuata mediante il KIT

Dneasy QIAamp DNA M icro della Quiagen seguendo il protocollo.

Il DNA estratto è stato utilizzato direttamente come templato per la DOP-PCR. La

DOP-PCR è stata effettuata usando il primer universale 6-MW (5’ -

CCGACTCGAGNNNNNNATGGG-3’ ) ed il termociclatore GENENCO PTC-200

come descritto in letteratura (56).

La reazione è stata condotta in un volume finale di 50 µl. La miscela conteneva: 2 µl

di Primer; 5µl TAPS Buffer; 2.5 µl W 1 Buffer; 1µl DNTPs 10mM; 0.5µl Amplitaq

e 39 µl DNA.

I primi 9 cicli di reazione sono stati effettuati in condizione di bassa stringenza

(denaturazione a 94°C per 30 secondi , appaiamento a 30° per 180 secondi, slope da

30° a 72° C per 210 secondi ed estensione a 72° C per 180 secondi) seguiti da 29

cicli in condizione di alta stringenza (denaturazione a 94°C per 30 secondi,

appaiamento a 62° per 90 secondi e estensione a 72°per 120 secondi) e da una

estensione finale per 480 secondi a 72°C.

CGH-Microar rays

L’analisi CGH-Microarrays è stata effettuata mediante il Vysis GenoSensor System

seguendo l’apposito protocollo. Il chip contiene 287 cloni di DNA target (P1, PAC o

BAC cloni) rappresentanti regioni cromosomiche importanti in citogenetica ed

oncologia. 100 ng di DNA neo e sano (prodotti di PCR) sono stati marcati, attraverso

una reazione di random priming reaction, rispettivamente con Cy3-dCTP and Cy5-

dCTP. L’ ibridazione su Genosensor TM Array 300 v.1.0 è avvenuta in incubatore a

37° C per 72 ore. Dopo una serie di lavaggi (3 per 10 minuti in 50%

2XSSC/formamide 40°C ; 4 per 5 minuti in 1XSSC a temperatura ambiente e 1 per 5

minuti in acqua distillata) i microarrays sono stati contrastati con 4,6 diamidino-2-

penylindole (DAPI IV) solution e analizzati.

Il software del Vysis GenoSensor System, dopo aver trasformato l’emissione di fluorescenza relativa a Cy3 in verde, quella relativa a Cy5 in rosso e quella relativa al DAPI in blu, esegue un processo di normalizazzione interna al microchip dei valori assoluti di fluorescenza verde e rossa e quindi calcola per ogni spot presente sul microchip il rapporto T/R fra l’intensità di fluorescenza verde (DNA Test-neo) e rossa (DNA Reference- sano) (fig.6). Valori del rapporo T/R superiori a 1.25 e inferiori a 0.75 identificano rispettivamente le regioni amplificate e delete del DNA test (neo) rispetto al DNA reference (sano).

A B

Figura 6 - Analisi CGH array effettuata con il software del VysisGenoSensorSystem: A: immagine in DAPI. B: immagine dopo normalizzazione interna.

Real-Time PCR

La procedura di Real-Time PCR (Polymerase Chain Reaction) viene utilizzata per

la rivelazione di specifici prodotti di PCR tramite l’ impiego di sonde (probes)

fluorogeniche disegnate per ibridizzare sequenze targets e generare un segnale che

si accumula durante i cicli di PCR in modo proporzionale alla concentrazione

iniziale del target. Si ottiene in questo modo un segnale fluorescente per ogni

campione che è associato in modo specifico al target studiato. Esistono diversi tipi

di chimica di base per la Real Time.

Quella più comunemente utilizzata è quella Taq-Man basata sull’ attività

esonucleasica 5’ -3’ della Taq polimerasi in combinazione con un probe marcato

con molecole fluorescenti (Fig.7). I probes Taq-Man contengono un fluorocromo

chiamato reporter FAM, (6-carbossi fluorescina) legato covalentemente

all’ estremita 5’ dell’ oligonucleotide e un fluorocromo inibitorio chiamato

quencher TAMRA, (6-carbossi tetrametil rodamina) attaccato all’ estremità 3’ . Un

alternativa ai quencher TAMRA sono i quencher non fluorescenti (NFQ). Quando

il probe è intatto il quencher inibisce l’emissione fluorescente del reporter. Durante

la fase d’estensione della PCR, se il target è presente, il probe marcato si ibridizza

ad esso e la Taq polimerasi idrolizza il probe generando un segnale fluorescente

(reporter) che è direttamente proporzionale alla concentrazione del target presente

nel campione iniziale.

Figura 7. Principi della chimica TaqMan utilizzata per analisi di Real-Time PCR.

La PCR Real-Time è stata eseguita utilizzando la macchina ABI PRISM 7900

Sequence Detection System (Applied Biosystem). Lo strumento combina un

termal cycler contenente una piastra a 96 o 384 pozzetti, un laser per l’ eccitazione

della fluorescenza e la rivelazione del segnale; è dotato di un software che

acquisisce automaticamente il segnale e calcola la specifica fluorescenza rilasciata

durante la reazione 5’ -3’esonucleasica. L’emissione della fluorescenza (compresa

tra 520nm e 620nm) è monitorata da una CCD camera (Charge Coupled Device)

ogni 7 secondi durante l’ intero processo di PCR.

Le variazioni di emissione fluorescente del reporter non imputabili alla reazione di

amplificazione, vengono normalizzate utilizzando un fluorocromo di riferimento

sempre presente nella miscela di reazione (per esempio il ROX).

Il segnale attribuibile alla reazione 5’ -3’esonucleasica è espresso come valore �

Rn,

che riflette sia la quantità di probe fluorescente degradato che la funzione

esponenziale originata durante l’ amplificazione. Il segnale di fluorescenza aumenta

durante la PCR all’ aumentare del numero di copie dell’ amplicone fino a quando la

reazione raggiunge un plateau (Fig.8).

Il programma determina il ciclo soglia (CT) sperimentale, che rappresenta il ciclo

di PCR in cui viene rilevato per la prima volta l’ aumento del segnale fluorescente

del reporter sopra la linea di base calcolata convenzionalmente dopo 15 cicli. Per

un dato campione il valore del CT dipende dal numero delle molecole bersaglio

presenti inizialmente. Fra la quantità iniziale della sequenza bersaglio e il CT esiste

una relazione lineare inversa: maggiore è la quantità iniziale della sequenza

bersaglio minore è il valore del ciclo soglia.

I risultati di Real-Time PCR, espressi in valori di CT possono essere elaborati dal

programma per fornire una quantificazione relativa o una assoluta. La

quantificazione assoluta determina l’esatto numero di copie della sequenza

bersaglio confrontando in segnale con una curva di calibrazione. La

quantificazione relativa invece normalizza il segnale fluorescente del bersaglio al

segnale fluorescente di un riferimento nel campione d’ interesse e lo confronta con

l’emissione del segnale in un campione calibratore. Lo strumento fornisce il

risultato applicando il metodo comparativo del 2- ��� CT, un algoritmo che attraverso

una serie di semplici passaggi aritmetici fornisce una stima della quantità del

bersaglio normalizzata su un gene di riferimento ed un campione calibratore

(57,58).

Figura 8 - Il software abbinato allo strumento ABI Prism 7900 Sequence Detector costruisce un grafico di amplificazione dai valori di emissione fluorescente rilevati durante la fase di estensione dei cicli di PCR.

I l metodo del 2- ��� CT

L’equazione che descrive l’amplificazione esponenziale della PCR è

Xn = X0 (1 + Ex)n

dove:

• X0: numero di molecole della sequenza bersaglio presenti nel campione

iniziale;

• Xn: numero di molecole bersaglio al ciclo n della reazione;

• Ex: efficienza dell’ amplificazione;

• n: numero del ciclo.

Per n= ciclo di soglia, l’ equazione può essere espressa nel modo seguente:

XT = X0 (1 + Ex)CT,X = KX

dove :

• XT : numero di molecole della sequenza bersaglio al ciclo soglia ;

• CT,X: valore del ciclo di soglia per l’ amplificazione;

• KX: costante.

Un’equazione simile vale anche per quanto riguarda il riferimento endogeno (il gene

utilizzato come controllo interno):

RT = R0 (1 + ER)CT,R = KR

dove:

• RT : numero di molecole del riferimento endogeno al ciclo soglia;

• R0 : numero iniziale di molecole del riferimento endogeno;

• ER : efficienza di amplificazione del riferimento endogeno;

• CT,R: valore del ciclo di soglia per l’ amplificazione;

• KR: costante.

Dividendo il valore di XT per il valore di RT e assumendo che l’efficienza di reazione

sia la medesima per entrambe le reazioni, si ottiene una nuova costante, K, che

rappresenta la quantità di prodotto di amplificazione della sequenza bersaglio al ciclo

soglia, normalizzata rispetto alla quantità del prodotto di amplificazione del gene di

riferimento.

Dalla semplificazione della divisione tra XT e RT si ottiene pertanto la seguente

equazione:

K = XN (1+ E)∆CT

dove:

• XN : rapporto tra le quantità iniziali del bersaglio e del riferimento (X0 /

R0);

• ∆CT: differenza in cicli soglia tra il bersaglio e il riferimento (CT,X - CT,R);

Si può ricavare il valore del prodotto XN :

XN = K (1 + E) -∆CT

Il passaggio finale prevede la divisione del valore XN riferito ad un qualsiasi

campione bersaglio (q) per il valore XN riferito al campione calibratore (cb):

XN,q K (1 + E) -∆CT,q

_______ = _______________

= (1 + E) -∆∆CT

XN,cb K (1 + E) -∆CT,cb

dove -∆∆CT = - (∆CT,q - ∆CT,cb).

Per ampliconi di dimensione minore a 150 bp e per i quali le concentrazioni di primer

e Mg2+ siano state ottimizzate adeguatamente, si assume che l’efficienza di

amplificazione sia vicina a 1. Quindi, la quantità di sequenza bersaglio, normalizzata

ad un riferimento interno e relativa ad un gene calibratore, è data da:

quantità di sequenza bersaglio = 2-∆∆CT

Affinché questo calcolo possa essere considerato valido, le efficienze di

amplificazione del bersaglio e del riferimento devono essere approssimativamente le

stesse (59).

Qantitative Microsatellite Analysis (QuMA)

Per validare i r isultati ottenuti nella regione 3p21.3- 3p23 con la tecnica di

CGH-Array il tessuto tumorale e quello sano è stato nuovamente

microdissezzionato ed è stato estratto il DNA. Su di esso è stato studiato il

numero di copie del DNA in tre loci di questa regione mediante l’analisi QuMA

(Fig.9).

Figura 9 - Chimica TaqMan e strategia QuMA. A: Chimica TaqMan. I l probe utilizzato ibridizza con la sequenza microsatellitare CA. B: Schematica illustrazione di un esperimento QuMA con DNA di tumore (linea ……) e DNA sano (linea---). La curva del locus reference per i due DNA è mostrata per semplicità con una linea intera. I l confronto fra la curva di ogni microsatellite con il suo appropriato reference è rappresentata come � CT, dove � CT=Ct (microsatellite )- Ct (reference) e come Ct si intende il ciclo soglia. I l relativo numero di copie (tumore/normale) è determinato dal ��� CT dove ��� CT=��� CT(tumore)- � CT(sano). I l numero di copie del tumore è uguale a 2 x 2- ��� CT. (da Nigro et al. Am.J.Path.2001).

La QuMA è una nuova tecnica che si basa sulla tecnologia TaqMan (Real Time

PCR) ed utilizza una singola sequenza r ipetuta come probe, nel nostro caso CA,

per tutti i loci da analizzare (51). Sono stati selezionati 3 microsatelliti (

D3S1612, D3S1578 e D3S1588) che mappano nella regione cromosomica di

interesse e l’analisi è stata effettuata utilizzando lo strumento ABI7900 (tab.4).

I l numero di copie per questi loci è stato determinato relativamente ad un pool

reference che comprende sei coppie di pr imers per differenti microsatelliti

(D5S643, D9S1794, D13S1238, D14S988, D19S926, D22S922) scelti in quelle

regioni che non sono usualmente alterate nel nostro tumore (15).

Forward primer Reverse primer

Locus D3S1578 GCCAACACACATTAATCACATA GGGGCCAAAATCTGCT D3S1588 TATCCCCAGAGATATTTCTTAGC ACTGCTCTATCCAGGACACA D3S1612 TCTTTTAGTCAGCAGTTATGTC CCCATTAAGAAATGTTACTCTAC Locus pool reference

D5S643 TGGGCGACAGAGCCATC TGTGGTGTGCCATTTATTGACT D9S1794 GAATTGCTTGAACCTGGG TCTGTGATCTTAGTTTGGGG D13S1238 CTCTCAGCAGGCATCCA GCCAACGTAATTGACACCA D14S988 TGGTGATTGGATATCACTGG ATGTTATGTAAGGTTTTGTTTTGTT D19S926 TCTGGTGAGAATTCCTAAGTAGTTC GGCCTTATGCGTGAGTAGTT D22S922 TATCTTGATGGTGGTGTTGG TTCCTCAGTTTTACCTGTGCT

Probe : 5’FAM-TGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTG-3’TAMRA

Tabella 4. Primers e probe utilizzati per l’analisi QuMA.

I l numero relativo di copie del DNA del locus da testare è stato definito

(utilizzando come calibratore la media di 4 DNA ottenuti da tessuti sani non

cor relati* ) come 2 x 2- ��� CT dove:

�CT sani* = Ct (locus) – Ct (pool reference)

�CT tumore = Ct (locus) – Ct (pool reference)

���CT =

�CT tumore -

�CT sani*

Per determinare se il valore del QuMA di un singolo campione è significamente

differente dalla media dei valor i ottenuti dai campioni di individui normali è

stato calcolato un intervallo di tolleranza (T.I .) = [2± ( SD tutti loci X 2.28 (limite di

tolleranza assumendo una distr ibuzione normale))] al di sopra del quale si considera un

aumento del numero di copie ed al di sotto del quale si considera una perdita

del numero di copie.

La reazione di amplificazione è stata condotta in duplicato, in un volume finale di

25 � l. La mix di reazione conteneva: 1X PCR Buffer (Roche), 200 µM

deoxynucleotide triphospate A, T and C, 50 µM deoxynucleotide triphospate G

(Promega), 1X ROX Reference Dye (Invitrogen) 150 µM 7-Deaza-2’ -doxy-

guanosine-5’ -triphosphate (Roche, 1X GC-RICH Solution, 4 µM GT probe, 15

µM primers, 1.25 unit/µl TaqStart (Roche Applied Science) e 5ng di DNA. I cicli

termici sono stati i seguenti: 1 ciclo di 95° C per 10 min e 40 cicli di 95°C per 20

secondi, 55° per 20 secondi, 72° per 45 secondi.

Analisi d’ espressione

Casisitica

Lo studio dell’espressione della regione 3p21.3-p23 è stato effettuato sugli 8 casi già analizzati e su 5 nuovi casi selezionati dalla banca degli Istituti Ortopedici Rizzoli, secondo gli stessi parametri scelti per l’analisi genetica. Non è stato possibile utilizzare un numero di casi maggiore in quanto i campioni dovevano provenire da pazienti non trattati ed il materiale doveva essere di buona qualità. In tabella 5 sono riportate le caratteristiche clinico patologiche dei nuovi pazienti selezionati. Caso

n° Sesso Età Sede Grado Massa,

cm Outcome Follow-up

mesi Ploidia

9 F 29 inf IV < 5 DOD 39 diploide 10 M 61 sup III > 5 NED 37 diploide 11 M 29 sup III < 5 NED 132 diploide 12 M 23 inf III < 5 DOD 30 //

13 M 19 inf III < 5 DOD 42 diploide F=Femmina; M=maschio; NED= non evidenza di malattia; DOD = morto di malattia inf = arto inferiore; sup = arto superiore

Tabella 5. Caratteristiche cliniche e patologiche dei 5 pazienti selezionati.

Estrazione RNA

Per l’ estrazione dell’RNA totale da campioni di tessuto fresco congelato è stato

utilizzato il TRIzol Reagent (Invitrogen), una soluzione monofasica costituita da

fenolo e guanidina tiocianato.

I campioni congelati (150 mg circa) sono stati sminuzzati in ghiaccio con bisturi

sterile ed il triturato è stato immerso in un opportuno volume di TRIzol Reagent. Per

l’ omogenizzazione è stato utilizzato un omogenizzatore del tipo rotore-statore

(Polytron). Tutto il materiale insolubile è stato separato dalla soluzione mediante

centrifugazione ed il sovranatante è stato trasferito in una provetta pulita. Ad ogni

campione sono stati aggiunti 200 µl di cloroformio per ml di TRIzol. Dopo agitazione

meccanica, l’ emulsione è stata incubata brevemente a temperatura ambiente. I

campioni sono stati centrifugati a 12000 rpm per 15 min a 4°C e la fase inorganica

contenente l’RNA è stata trasferita in una provetta pulita.

L’RNA è stato fatto precipitare con 500 µl di etanolo per ml di TRIzol Reagent usato

per l’ omogeneizzazione. I campioni sono stati incubati a temperatura ambiente per 10

min e poi centrifugati a 12000 rpm per 15 min a 4°C. Dopo aver rimosso il

sovranatante, il sedimento di RNA è stato lavato con 800 µl di etanolo al 75% per ml

TRIzol, agitato meccanicamente per pochi secondi e centrifugato a 10000 rpm per 5

min a 4°C. Alla fine della procedura l’etanolo è stato rimosso ed il sedimento di RNA

è stato fatto asciugare all’ aria sotto cappa chimica. L’RNA è stato risospeso in un

opportuno volume di RNAsecure reagent (Ambion).

La concentrazione dell’RNA è stata determinata misurando l’assorbanza a 260 nm

allo spettrofotometro ed il rapporto A260/A280 era ≅ 1.6.

Per ver ificare l’assenza di eventuali contaminazioni da DNA genomico e

l’ integr ità dell’RNA, è stata eseguita un’elettroforesi su gel di agarosio all’ 1%

in TBE 1X.

Retrotrascr izione

Il cDNA è stato sintetizzato a partire da 400 ng di RNA estratto diluiti in 50 µl di

RNasi free water (Quiagen). Per la retrotrascrizione è stato utilizzato l’High Capacity

cDNA Archive kit (Applied Biosystem, PE).

I 100 µl di miscela di reazione contenevano: 400 ng di RNA, acqua “RNasi free” ,

tampone di retrotrascrizione 1X, miscela di deossinucleotidi trifosfato 1X, random

primer 1X, Multiscribe trascrittasi inversa 2.5 U/µl, inibitore delle RNasi 0.4 U/µl. La

reazione è avvenuta nel “Thermal Cycler 2004” (Perkin-Elmer) sotto le seguenti

condizioni:

- 25°C per 10 minuti

- 37°C per 120 minuti

- 4°C per �

Analisi dell’espressione mediante Real-Time PCR

L’espressione dei geni RASSF1 e MLH1 è stata normalizzata all’ espressione del gene

costitutivamente espresso GAPDH e per ogni campione di tessuto neoplastico è stato

scelto come calibratore il corrispondente campione istologico sano.

Per l’ amplificazione delle sequenze bersaglio sono stati utilizzati dei prodotti

specifici per l’ analisi quantitativa chiamati TaqMan Gene Expression Assays

(Applied Biosystem, PE). Il prodotto consiste in una miscela per la PCR contenente i

primer ed una sonda del tipo TaqMan, specifici per la sequenza di interesse (gene

bersaglio o gene riferimento endogeno) e presenti alla concentrazione ottimale per

ottenere la massima efficienza di reazione. Le sonde TaqMan presenti in tutti i

prodotti TaqMan Gene Expression Assays sono marcate al 5' con un fluorocromo

reporter del tipo 6-FAM e al 3' con un quencher non fluorescente (NFQ).

Quest’ultimo è legato covalentemente ad una molecola chiamata MGB (minor groove

binder), che ha la funzione di aumentare la temperatura di fusione consentendo

l’ impiego di sonde molto brevi (59).

I TaqMan Gene Expression Assays (www.appliedbiosystem.com) utilizzati sono stati

i seguenti:

- GAPDH Assay ID: Hs00179866-m1

- RASSF1

Assay ID: Hs00200394-m1 - MLH1 Assay ID: Hs99999905-m1

Per ciascuno dei tre geni la reazione di amplificazione è stata condotta in duplicato. I

25µl di reazione contenevano: 1.25µl Target Assay Mix 20X o Endogenous Control

Assay Mix 20X, 25 ng di cDNA diluiti in 11.25� l di RNase free water (Qiagen),

12.5µl di Taq Man Universal Master Mix 2X (AmpliTaq Gold DNA polimerasi,

AmpErase UNG, deossinucleotidi trifosfato, fluorocromo di riferimento passivo,

tampone di PCR ottimizzato). La reazione è avvenuta sotto le seguenti condizioni:

- 2 min a 50°C (attivazione dell’ enzima UNG);

- 10 min a 95 °C (attivazione della polimerasi);

- 15 sec a 95°C (denaturazione);

- 1 min a 60° C (allineamento ed estensione).

Sono stati impostati 45 cicli di reazione.

La PCR Real Time è stata eseguita utilizzando la macchina ABI PRISM® 7900

Sequence Detection System (Applied Biosystem).

Immunoistochimica Per valutare l’ espressione proteica dei geni MLH1 e RASSF1, dai campioni fissati

in formalina ed inclusi in paraffina sono state tagliate con il microtomo sezioni di

5� m. Le sezioni sono state successivamente sparaffinate in xilolo e reidratate

mediante successivi passaggi in etanolo 100%, 95% e 70% ed infine in acqua

distillata. Sono state poi sottoposte ad un trattamento con una soluzione di H2O2

per 5 minuti a temperatura ambiente allo scopo di bloccare le perossidasi

endogene. Per limitare le eventuali aspecificità di reazione, è stato applicato per 15

minuti, il siero intero, non immune, della stessa specie dell’ anticorpo secondario.

Le sezioni sono state poi incubate per tutta la notte a 4°C con i seguenti anticorpi

primari: policlonale anti RASSF1 (n-15) diluito 1:100 (Santa Cruz); monoclonale

anti MLH1 (clone 14) diluito 1:10 (Calbiochem).

Dopo i lavaggi con il tampone Phosphate Buffer Saline (PBS) le sezioni sono state

incubate con l’antisiero secondario diretto contro le IgG dell’ antisiero primario per

30 minuti a temperatura ambiente e con i complessi streptoavidina-biotina

perossidasi. Lo sviluppo è stato effettuato con una soluzione di 3-amino-9-etil-

carbazolo al 100% in N.N.Dimetilformamide seguito dal contrasto nucleare con

ematossilina e dal montaggio in soluzione acquosa. In accordo con la percentuale

di cellule positive i campioni sono stati valutati come negativo (nessuna cellula

positiva), focalmente positivo (� 50% cellule positive) o positivo (� 50% cellule

positive). Come controllo positivo sono state utilizzate sezioni di tessuto di cisti

aneurismatica, come controllo negativo è stato omesso l’anticorpo primario.

RISULTATI

Analisi genetica

CGH-Microar ray L’analisi CGH-Microar ray effettuata con il chip Genosensor TM Array 300 v.1.0 (Vysis) contenenete le più impor tanti regioni cromosomiche implicate nel campo dell’oncologia, ha videnziato negli 8 casi analizzati, numerose alterazioni in quasi tutti i cromosomi (Tab.6 A e B) mostrando un’ estrema var ibilità del profilo genico in ogni caso analizzato.

Acquisizione

Descr izione GenBank Numer Accession

PTGS2(COX2) 1q31.1 prostaglandin-endoperoxide synthase 2 AL033533

ITGA4 2q31-q32 Integrin, alpha 4 AC020595

DDX15 4p15.3 DEAH (Asp-Glu-Ala-His) box polypeptide 15 AC027517

C84C11/T3 5p tel sub telomeric NA

PIM1 6p21.2 pim-1 oncogene AL353579

G31341 7p tel sub telomeric AC093614

RFC2,CYLN2 7q11.23 replication factor C (activator 1) 2 AC005015

CDK6 7q21-q22 Cyclin-dependent kinase 6 AC004128

SERPINE1 7q21.3-q22 Serine proteinase inhibitor AC004876

PDGRL 8p22-p21.3 platelet-derived growth factor receptor-like AF165145

MYC 8q24.12-q24.13 v-myc myelocytomatosis viral oncogene homolog NA

WI-6509 11q tel sub. telomeric AP003025

PACE4C 15q tel sub telomeric AQ263469

FRA16D 16q23.2 fragile site, aphidicolin type, common, fra(16)(q23.2) NA

LZ16 16q24.2 ankyrin repeat domain 11 AC023256 WI-14673 17p tel sub telomeric AC015853

LLGL1 17p12-17p11.2 lethal giant larvae homolog 1 (Drosophila) AC020567

FLI,TOP3A 17p12-17p11.2 flightless I homolog (Drosophila) NA

PPARBP(PBP) 17q12 PPAR binding protein AC009283

SHGC-103396 17q tel sub telomeric AQ357495

FRA18A(D18S978) 18q12.3 fragile site, aphidicolin type, common, fra(18)(q12.2) AP001639

CTDP1,SHGC-145820 18q tel sub telomeric AP001641

MKKS, SHGC-79896 20p12.1-p11.23 McKusick-Kaufman syndrome NA

PCNT2(KEN) 21q tel sub telomeric AQ618375

BCR 22q11.23 breakpoint cluster region NA

DXS580 Xp11.2 microsatellite Z83745

A Tabella 6A. Acqusizione di regioni cromosomiche riscontrate in 3 o più casi. NA= non disponobile

Perdita

Descrizione GenBank Numer

Accession

PRKCZ 1p36.33 protein kinase C, zeta AC068198

NRAS 1p13.2 neuroblastoma RAS viral (v-ras) oncogene homolog NA

TBR1 2q23-q37 T-box, brain 1 AC009487

RAF1 3p25 v-raf-1 murine leukemia viral oncogene homolog 1 NA

MLH1 3p21.3-p23 mutL homolog 1, colon cancer, nonpolyposis type 2 (E. coli)

AC006583

D4S2930 4q tel sub telomeric NA

6QTEL54 6q tel sub telomeric NA

ABCB1(MDR1) 7q21.1 ATP-binding cassette, sub-family B (MDR/TAP), member 1

NA

stSG48460 7q tel sub telomeric AQ897338

MOS 8q11 v-mos moloney murine sarcoma viral oncogene

AQ009368

E2F5 8p22-q21.3 E2F transcription factor 5, p130-binding AC011773

HRAS 11p15.5 v-Ha-ras Harvey rat sarcoma viral oncogene homolog NA

D11S461 11q12.2 microsatellite NA

SHGC-5557 12p tel sub telomeric AC005844

GLI 12q13.2-q13.3 glioma-associated oncogene homolog (zinc finger protein)

NA

IGH(SHGC-36156) 14q tel sub telomeric AZ579057

ZNF217(ZABC1) 20q13.2 zinc finger protein 217 NA

20QTEL14 20q tel sub telomeric NA

B Tabella 6B. Perdite di regioni cromosomiche riscontrate in 3 o più casi. NA= non disponobile Per la valutazione dei dati é stata considerata un’ acquisizione del numero di copie del gene con valor i della ratio T/R maggiore di 1.25 ed una perdita con valor i infer ior i a 0.75. Le maggior i acquisizioni sono state r itrovate nella regione 17p12-p11 (FLI , TOP3), mentre le perdite hanno coinvolto le regioni 2q23-q27 (TBR1), 3p25 (RAF1), 3p21.3-p23 (MLH1;RASSF1), 11p15.5 (HRAS) e 12ptel (SHGC-5557). Per quanto r iguarda il cromosoma 3p sono state r iscontrate numerose alterazioni in tutti gli 8 casi con una prevalenza di delezioni. Quattro casi presentavano la perdita della regione 3p21.3-p23 mentre l’acquisizione di questa regione era presente solo in due casi (Tab.7). E’ stata trovata un’ interessante associazione tra lo stato aneuploide ed alterazioni di alcune regioni cromosomiche specifiche. Infatti tutti i quattro casi

aneuploidi presentavano un’acquisizione del numero di copie delle regioni 17q21-q22 (TOP2A), 22q11-23 (BCR), ed una perdita di 1p36.33 (PRKCZ), 5q21-q22 (APC) e 14q13 (PNN). N° 3PTEL25

3ptel 3PTEL01

3ptel VHL

3p25-p26 RAF1 3p25

THRB 3p24.3

MLH1 3p21.3p23

RASSF1 3p21.3

FHIT 3p14.2

p44S10 3p14.1

D3S1274 3p12-3p13

1 2 3 4 5 6 7 8

Tabella 7. Alterazioni r iscontrate nel braccio corto del cromosoma 3. Rosso= perdita; Verde= guadagno QuMA L’ intervallo di tolleranza (T.I .) utilizzato per l’analisi QuMA è stato calcolato come 0.4-4.4 utilizzando la media e la deviazione standard dei valor i di ∆∆∆∆CT fra i 3 loci microsatellitar i nella regione 3p21.3-p23 ed un pool di 4 DNA non cor relati. In base al metodo comparativo (52) il valore di 2 x 2- ��� CT

(cor r ispondente al numero di copie del DNA) ottenuto è stato considerato normale se cade all’ interno del T.I . Con valor i maggior i di 4.4 è stato considerato un aumento del numero di copie e con valor i al di sotto di 0.4. una perdita del numero di copie (Tab.8).

3p21.3-3p23 3p21.3 D3S1612 D3S1578 D3S1588

Caso 1 0,28 5,46 3,14 Caso 2 0,04 0,54 1,04 Caso 3 0,82 2,30 NA Caso 4 0,76 NA 0,26 Caso 5 5,32 NA 2,34 Caso 6 0,12 0,8 2,58 Caso 7 2,94 0,36 0,76 Caso 8 0,02 NA 0,66

Tabella 8. Intervallo di tolleranza = perdita < 0,4-4,4 > guadagno NA = non disponibile Sette degli otto casi di sarcoma sinoviale monofasico hanno mostrato alterazioni genetiche nella regione 3p21-p23 con perdite in 6 casi su 8 e aumenti in 2 casi su 8. Questi r isultati hanno confermato i r isultati ottenuti dall’analisi di CGH-microar ray in 7 degli 8 casi per i geni MLH1 e RASSF1. Analisi d’espressione Analisi dell’espressione genica di MLH1 e RASSF1 L ’analisi dell’espressione genica mediante Real Time PCR dei 13 campioni di sarcoma sinoviale monofasico ha evidenziato una maggiore espressione dei geni in circa l’80% dei campioni di tessuto tumorale r ispetto al cor r ispondente tessuto sano (Fig.10).

campioni

-0,5

4,5

9,5

14,5

19,5

24,5

29,5

34,5

39,5

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

MLH1

2-

�� C

T

Figura 10-Livelli d’espressione di mRNA RASSF1 e MLH1 relativi al corrispettivo tessuto

sano utilizzato come calibratore. Ogni gene è stato considerato più espresso nei casi in cui il valore di emissione

luminosa calcolato con il metodo del 2-∆∆CT risulta superiore al valore 1+SD e meno

espresso in tutti quei casi in cui il valore si mostra inferiore al valore 1-SD. Il livello

di espressione normale uguale a 1, corrisponde al valore di emissione luminosa per

ogni reazione di amplificazione della sequenza bersaglio e di riferimento nei

campioni di tessuto sano.

Il gene RASSF1 si è mostrato più espresso in 11 casi su 13 con un’elevata variabilità

di valori compresi fra 1.3 e 38.5( Tab.9).

In particolare solo 3 casi su 8 esibiscono un valore di 2-∆∆CT superiore a 10 mentre

negli altri casi si evidenzia un lieve aumento del livello di espressione.

I l gene MLH1 si è mostrato più espresso in

10 casi su 13 con una var iabilità di valor i

compresi tra 1.5 e 14 ( Tab.9).

Valor i di 2-∆∆∆∆∆∆∆∆CT super ior i ad 8 sono evidenti

in 2 casi su 13, nei restanti casi l’aumento

dell’espressione è meno marcato. I l gene r isulta inoltre espresso a livelli normali in 2 casi su 13 e leggermente sotto espresso in un solo caso.

Tabella 9. Risultati dell’analisi Real Time PCR di genetica di RASSF1 e MLH1.

Analisi dell’espressione proteica di MLH1 e RASSF1 I risultati dell’analisi immunoistochimica delle proteine corrispondenti ai due geni studiati sono

sintetizzati nella tabella 10.

L’analisi ha mostrato una positività alla proteina RASSF1 in 12 su 13 casi (fig.11).

L’ immunoreattività si presentava moderata e con una distribuzione eterogenea. Una più alta

intensità d’espressione è stata evidenziata nei 2 casi che presentavano un aumento del livello di

espressione di mRNA. L’espressione di MLH1 è risultata negativa in tutti i casi analizzati tranne

uno (fig.12).

CASO RASSF1 MLH1 1 pos neg

RASSF1 MLH1 Caso 2- ∆∆∆∆∆∆∆∆CT Caso 2- ∆∆∆∆∆∆∆∆CT

1 0,75±0.32 1 0,55±0.28 2 2,45±0.43 2 1,87±0.43 3 1,53±0.05 3 1,12±0.47 4 6,04±0.14 4 1,88±0.08 5 2,45±0.43 5 1,81±0.36 6 20,46±0.15 6 9,88±0.28 7 38,58±0.09 7 14,12±0.17 8 0,53±0.08 8 1,1±0.12 9 5,37±0.22 9 3,64±0.23 10 10,97±0.1 10 6,13±0.1 11 1,3±0.21 11 2,6±0.31 12 7,52±0.24 12 1,59±0.2 13 4,92±0.23 13 3,24±0.22

2 pos neg 3 pos neg 4 neg neg 5 foc pos neg 6 foc pos neg 7 pos neg 8 pos neg 9 pos pos 10 pos neg 11 foc pos neg 12 pos neg 13 pos neg

Tabella 10. Risultati dell’analisi immunoistochimica delle 2 proteine codificate dai geni

analizzati. pos= positivo; neg= negativo; foc. pos.= focalmente positivo.

Figura 11- Moderata reazione di immunopositività alla proteina RASSF1. (IHC 20X)

Figura 12- Reazione d’ immunonegatività alla proteina MLH1. (IHC 20X)

DISCUSSIONE

I sarcomi delle parti molli sono un gruppo eterogeneo di tumori di origine

mesenchimale. Rappresentano 1% dei tumori totali dell’ adulto, hanno un’ampia

varietà cellulare, sono poco differenziati e di difficile classificazione (1).

La diagnosi differenziale del sarcoma sinoviale monofasico da altri sarcomi a cellule

allungate, ad es. il leiomiosarcoma, richiede l'individuazione di markers biologici

specifici come la traslocazione t(X;18)(p11.2;q11.2). Tuttavia la rarità e l'ampio

spettro di caratteristiche istologiche e citogenetiche, comprese le frequenti e

complesse aberrazioni secondarie, devono essere definite con nuovi criteri sia

prognostici che diagnostici (60).

L'intento di questo studio è stato quello di caratterizzare meglio a livello molecolare il

sarcoma sinoviale monofasico e di portare un contributo all'identificazione di nuovi

markers aventi significato diagnostico e/o da poter essere utilizzati come possibili

bersagli per eventuali trattamenti terapeutici.

Sono stati analizzati una serie omogenea di sarcomi sinoviali monofasici ad alto

grado provenienti da pazienti non sottoposti a nessun trattamento terapeutico pre-

operatorio con un quadro istologico e clinico completo. La rarità di questo tumore, la

necessità di avere campioni provenienti da pazienti non trattati e materiale di buona

qualità ha notevolmente limitato la casistica.

La tecnica di microdissezione che permette la selezione di una popolazione di cellule

morfologicamente ben definite da una sezione di tessuto, risulta essere un ottimo

strumento nello studio di tessuti eterogenei (61,62). Il tessuto microdissezionato

come fonte di DNA genomico è stato utilizzato con successo per l'individuazione di

eterozigosi in tumori primari e per l'individuazione di alterazioni geniche tumore

specifiche (63,64). Nel nostro studio, pur trattando di pazienti con sarcoma sinoviale

di tipo monofasico, alcuni campioni presentavano cellule di diversa morfologia e

quindi la microdissezione, effettuata sotto la supervisione di un patologo, si è rivelata

estremamente utile. Grazie a questa tecnica è stato anche possibile il recupero dalla

stessa sezione di tessuto, sia delle cellule tumorali che di quelle muscolari sane

adiacenti e quindi la successiva estrazione di DNA delle due popolazioni cellulari su

cui effettuare le analisi.

La tecnica di Comparartive Genomic Hybridization (CGH) ha contribuito

significativamente nello studio della citogenetica dei tumori soprattutto di quelli

solidi dove le convenzionali tecniche citogenetiche sono meno efficienti (65). Questa

tecnica permette di definire le alterazioni del numero di copie di un DNA genomico

in un campione rispetto a un riferimento normale in un singolo esperimento e quindi

ha portato ad un notevole aumento delle conoscenze sulla biologia e sulla

progressione dei tumori sulla base delle perdite o delle amplificazioni di regioni

cromosomiche contenenti oncogeni o oncosopressori. Oggi la CGH è un metodo

d’analisi ben ottimizzato ed utilizzato anche se presenta ancora delle limitazioni

tecniche. Poiché il DNA nei cromosomi si presenta altamente condensato, la

risoluzione per la determinazione del cambiamento del numero di copie è solo di 5-

10 Mb per le perdite e di 2 Mb per le amplificazioni (66) e poiché l’analisi

dell’ immagine ottenuta è solo in parte automatizzata, l’ esperienza del citogenetista

risulta molto importante nell’ identificazione delle alterazioni. Per superare queste

limitazioni recentemente sono state sviluppate “piattaforme” microarray con potenti

sistemi di analisi d’ immagine e di elaborazione dei dati.

Per il nostro studio abbiamo utilizzato il sistema GenoSensor della ditta Vysis con

microarray contenti non l’ intero genoma umano (già disponibili in commercio) ma

cloni DNA selezionati rappresentanti regioni importanti in citogenetica ed oncologia.

L’analisi ha evidenziato in tutti i pazienti studiati, confermando i dati in letteratura,

un elevato numero di alterazioni in quasi tutti i cromosomi e un’ ampia variabilità in

ogni singolo caso, sottolineando la complessità genetica di questo tumore e

soprattutto la difficoltà di individuare geni utilizzabili sia per la diagnosi sia come

possibili bersagli per eventuali trattamenti terapeutici.

L’analisi ha r ivelato anche che i quattro casi con alterato contenuto di DNA presentavano specifiche alterazioni come l’amplificazione dei geni TOP2, e BCR e la perdita di geni come PRKCZ, APC e PNN coinvolti nei meccanismi di aggressività tumorale. Infatti amplificazione e overespressione del gene TOP2 sono state trovate nel tumore gastr ico e mammar io ( 67,68) e la perdita del gene APC è stata trovata coinvolta nella progressione del tumore al colon (69). Questo potrebbe evidenziare un impor tante coinvolgimento delle regioni contenenti questi geni anche nel compor tamento aggressivo del sarcoma sinoviale monofasico. Pur troppo causa la casistica limitata, non è stato possibile effettuare una cor relazione statistica. In accordo con altri autori (19) abbiamo trovato in tutti i casi analizzati perdite del

cromosoma 3p. Questo è uno dei più frequenti cromosomi alterati nei carcinomi (22)

e l’ elevata incidenza di perdita di eterozigosi nella regione 3p21.3-p23 in molti

tumori umani sporadici ha suggerito la presenza in questo locus di uno o più

oncosopressori (50).

Nella nostra casistica i r isultati ottenuti con la tecnica di CGH-microar ray sono stati confermati attraverso l’analisi QuMA (51) in 7 casi su 8. Questa tecnica di recente sviluppo ha confermato quindi, una volta ottimizzata, una grande potenzialità di utilizzo per la validazione di analisi microar ray dove la necessità di avere un buon controllo dei dati in tempi brevi e con costi relativamente bassi r isulta spesso problematica. I nostr i dati hanno mostrato numerose alterazioni del numero di copie nella regione 3p21.3-p23 con una prevalenza di perdite che tuttavia sembrano non alterarne completamente il meccanismo di trascr izione. L ’analisi d’espressione ha r ilevato infatti la presenza, pur a livelli moderati, di mRNA cor r ispondente ai geni RASSF1 e MLH1. E’ ipotizzabile che l’alterazione del numero di copie non

coinvolga le sequenze codificanti e/o non sia fondamentale per il meccanismo di trascr izione. La quantificazione dei livelli di espressione è stata effettuata mediante tecnica di Real Time PCR. La scelta del gene di r ifer imento e del calibratore sono di capitale impor tanza per garantire l’affidabilità dei dati. La quantificazione relativa dell’ RNA messaggero realizzata impiegando un gene di r ifer imento, garantisce di compensare le possibili fluttuazioni di efficienza della reazione di retrotrascr izione, mentre l’utilizzo del calibratore permette di valutare l’espressione in termine di var iazione percentuale r ispetto a un livello che viene scelto come basale. La scelta del gene di r ifer imento dipende dalle esigenze sper imentali: comunemente vengono adottati dei geni espressi costitutivamente, anche se molti autor i hanno sottolineato che la loro espressione può var iare da tessuto a tessuto e può modificarsi durante il progredire del ciclo cellulare (70,71,72). In questo studio per l’analisi dell’espressione dei geni RASSF1 ed MLH1, è stato scelto, dopo averne testati diversi, come r ifer imento endogeno il gene GAPDH, poiché la sua espressione si è dimostrata costante nei campioni di tessuto analizzati e l’espressione dei due geni RASSF1 e MLH1 in ogni campione di tessuto tumorale è stata confrontata con la loro espressione nel tessuto sano cor r ispondente. Gli studi condotti su diversi tipi di tumor i sporadici hanno evidenziato che il gene RASSF1 r isulta diffusamente inattivato per metilazione (47,48,49) mostrando una sensibile diminuzione del livello di espressione. Nel nostro studio invece questo gene si presenta più espresso r ispetto al tessuto sano in 11 campioni tumorali su 13 con un’ampia var iabilità di valor i di 2-∆∆∆∆∆∆∆∆CT. In par ticolare, i campioni 6 e 7 esibiscono valor i super ior i a 20, mentre la maggior par te r imane entro il limite di 10. In letteratura le pubblicazioni che r iguardano in modo specifico la trascr izione del gene umano MLH1 non sono numerose. La maggior par te degli studi pubblicati analizzano le proteine e ne r ivelano la diminuzione del livello di espressione in alcuni tipi di tumore (73,74,75). Inoltre molti Autor i hanno evidenziato che il gene MLH1 r isulta inattivato per metilazione con elevata frequenza (41,43). Nel nostro studio i valor i di 2-∆∆∆∆∆∆∆∆CT relativi al livello di espressione del gene MLH1 sono compresi fra 0,5 e 14, in un intervallo più breve r ispetto al precedente. Su 13 campioni, 10 hanno maggiore espressione del gene, 2 mostrano un livello di espressione normale mentre un solo caso esibisce una quantità di messaggero infer iore r ispetto al cor r ispondente tessuto sano. Dal confronto dei dati emerge una cor r ispondenza fra l’aumento o la r iduzione dell’espressione dei due geni all’ interno dello stesso campione di mRNA. Si può notare infatti che i casi caratter izzati dal più alto incremento dell’attività trascr izionale per entrambi i geni sono il campione 6 ed il campione 7. L ’andamento “ a coppie” comunque continua ad essere r ispettato anche fra i restanti campioni. I l dato potrebbe essere spiegato dal fatto che i due geni si

trovano vicini nella mappa cromosomica, in un segmento di 120 Kb localizzato nella regione 3p21.3. I r isultati di espressione ottenuti in questo studio sembrano essere in controtendenza r ispetto a recenti studi pubblicati in relazione ai tumor i anche se in letteratura non sono stati r ipor tati precedenti dati sulla regione 3p21.3-p24 per quanto r iguarda il sarcoma sinoviale e il compor tamento di geni come RASSF1 e MLH1 è ancora in via di studio. E’ stato r ipor tato infatti che un aumento di espressione del gene RASSF1 potrebbe essere associato con un’attivazione costitutiva di RAS r isultando in un’apoptosi RAS-dipendente (25,76). Inoltre la presenza di molte var ianti di splicing determina controverse e non ben definite interpretazioni del suo meccanismo di azione. In contrasto con i più alti livelli di espressione di mRNA l’analisi proteica ha evidenziato in quasi tutti casi una moderata espressione della proteina RASSF1 mentre l’espressione della proteina MLH1 è r isultata , eccetto un caso, negativa. Questo dato potrebbe sugger ire una deregolazione a livello del meccanismo post-trascr izionale, ad es. alterazioni nei meccanismi di stabilizzazione del trascr itto o presenza di miRNA. I nostr i r isultati hanno confermato la complessità genetica del sarcoma sinoviale monofasico e hanno r ivelato la presenza di specifiche alterazioni cromosomiche in regioni contenenti geni implicati nel controllo della progressione della malattia. L ’ottimizzazione e l’utilizzo di tecniche innovative come la Quantitative M icrosattelite Analysis ha permesso di ottenere in breve tempo e con costi relativamente bassi un buon controllo dei r isultati. Lo studio della regione 3p21.3-p23 ha evidenziato come le alterazioni del numero di copie r iscontrate non sembrano coinvolgere l’attivazione trascr izionale dei geni cor r ispondenti suggerendo una “ down regulation” a livello del meccanismo post trascr izionale. La rar ità di questo tumore e la r istrettezza dei cr iter i di selezione dei pazienti, ha notevolmente limitato la casistica non permettendo alcuna cor relazione statisticamente significativa tra le alterazioni r iscontrate e l’andamento clinico della malattia estremamente var iabile da paziente a paziente. In conclusione i nostr i dati sottolineano l’estrema complessità di questa patologia e come sia necessar io, grazie anche all’utilizzo di tecniche sempre più raffinate, caratter izzare ancor meglio il sarcoma sinoviale affinché sia possibile individuare specifici target da utilizzare per la diagnosi o sui quali poter agire per eventuali terapie.

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Desidero r ingraziare: I l relatore Prof. Mario Mercuri, Professore Associato Dipartimento Scienze Anatomiche Umane e Fisiopatologiche dell’Apparato Locomotore “ Sezione Clinica Ortopedica” ed il Dott. Piero Picci, Direttore del Laboratorio di Ricerca Oncologica e Direttore scientifico dell’ I stituto Ortopedico Rizzoli, per avermi dato la possibilità di svolgere questo lavoro. La Dott.ssa Maria Serena Benassi, Responsabile della Sezione di Biologia Molecolare del Laboratorio di Ricerca Oncologica, i miei colleghi Paola, Gabriella, Francesca, Antonella, Claudia, Massimo e Cristina per la gentile disponibilità e per la preziosa collaborazione. La Sig.ra Cristina Ghinelli per il supporto grafico e la sua grande disponibilità. La mia famiglia e Zaccheo per il sostegno accordatomi in questi anni di studio.