Biotech Lars...4 Lars Biotech Report 2016 Presentazione Yearbook 2016 Il nuovo anno si apre con...

Yearbook 2015-2016

BiotechLars

Yearbook 2015-2016

Istituto di Istruzione secondaria di II grado “Gandhi” - MeranoLiceo Classico, Liceo delle Scienze Umane, Liceo LinguisticoLiceo Scientifico, Liceo delle Scienze Applicate, Istituto Tecnico per il settore economico

Yearbook

2016

Yearbook 2016

Lars Biotech Report 2016 3

Indice

4 Presentazione

6 Il nostro Laboratorio

8 Area di progetto: batterifluorescenti

10 White-bluescreening

12 GST:studiodiunaproteina

14 MutagenesidellaGFP

16 Presentazioneall’Eurac

18 Cinguline

20 Stageinuncentrodiricerca

22 Partecipaanchetu

23 LaletteradiunNobel

24 Team

26 Ringraziamenti

“Lars Biotech”

è un progetto che fa parte dell’offerta formativa del

IstitutodiIstruzionesecondariadiIIgrado“Gandhi”OberschulzentrummititalienischerUnterrichtssprache“Gandhi”

39012 Merano/Meran (BZ), via Karl Wolf / Karl Wolf – Straße, 38Italy tel.+39 0473-203071 / 203072 fax +39 0473-203089http://www.licei-merano.it/

Blog :https://larsbiotech.wordpress.com/

Lars Biotech Report 20164

Presentazione Yearbook 2016

Il nuovo anno si apre con grandi novità per quanto riguarda il nostro progetto “Biotecnologie”.Innanzitutto ci fa molto piacere apprendere che il corso di eccel-lenza sulle biotecnologie è stato approvato anche per il prossimo anno che così proseguirà nella sua terza edizione, consolidando-si. Ciò è molto importante perché il progetto stesso è un progetto di ricerca a lungo termine e quindi richiede una continuità tempo-rale che permetta la messa a punto di tecniche e protocolli nuovi e la raccolta di risultati. Il gruppo ha acquisito nuovi membri che lo rafforzano e fanno intravvedere un futuro pieno di prospettive. Il grande numero di richieste di adesione da parte di nuovi team members è una ottima indicazione della bontà del progetto e della sua sostenibilità nel lungo periodo. A tale proposito nell’an-no appena conclusosi vi è stato anche il riconoscimento di que-sto lavoro che ora diventa credito formativo e ciò ha portato a tutto il gruppo nuova energia e determinazione.Come avvenuto negli anni passati, anche quest’anno abbia-

mo presentato il nostro lavoro alle “Giornate delle scienze” dell’ EURAC. La presentazione ben curata e ottimamente realiz-zata dal nostro team ha suscitato molto interesse e da più parti abbiamo ricevuto elogi ed esortazioni a proseguire con il nostro laboratorio.

Anche sul fronte della ricerca l’anno appena conclusosi presen-ta un bilancio a nostro avviso molto positivo. Abbiamo messo a punto molti protocolli nuovi, ci siamo impegnati nella muta-genesi della GFP (leggete l’ articolo a pag. 14) ed abbiamo ac-quisito nuove tecniche che ci torneranno utili per i nostri studi successivi. In particolare abbiamo messo a punto dei sistemi di espressione in batteri che utilizzano le proteine GFP, BFP, GST e MBP che saranno veramente importanti nella espressione e ca-ratterizzazione delle cinguline, il nostro progetto più ambizioso. Potete trovare tutte le informazioni nell’articolo a pag. 18.A proposito di cinguline, un grazie molto sentito va al Dott.

Cari Team Members,

Yearbook 2016


Presentazione

Kröger, direttore del Centro di Ricerca B CUBE di Dresda, che ha gentilmente donato il cDNA delle cinguline. Senza questa dona-zione naturalmente non sarebbe stato possibile intraprendere il nostro progetto. Il cDNA ci permetterà di spingerci verso nuovi ed importanti traguardi nel nostro studio sulle cinguline.

Infine un inaspettato ma estremamente gradito sostegno al no-stro progetto viene da un grande premio Nobel per la chimica, il dr. Walker dell’ MRC, che ha personalmente scritto una e-mail di incoraggiamento ed apprezzamento al gruppo. Leggete a tal proposito l’articolo a pag. 23.Quello che ci aspetta il prossimo anno è di progredire con la clonazione ed espressione delle cinguline in batteri. Un appun-tamento questo di grande importanza perché la caratterizzazio-ne di queste proteine e le condizioni di espressione in batteri ci permetterà di capirne i possibili modi di impiego.

Come ultimo punto, ma non per questo meno importante, abbia-mo senz’altro intenzione di ripetere la bellissima esperienza di stage al centro di biotecnologie CIBIO di Trento e possibilmente di ampliarla con altri contatti. Questo scambio molto proficuo e promettente con l’Università di Trento, dove due nostri studenti sono stati accettati per un tirocinio, lo troverete descritto nell’ articolo a cura di Nina Desiato all’interno di questo fascicolo.

In conclusione, come avete ben capito, anche il prossimo anno sarà intenso, stimolante e pieno di novità.

MS, AM e SDBStoria del progetto “Lars Biotech”

Durante l’anno scolastico 2011-2012 nasce il progetto che abbiamo chiamato Lars Biotech (laboratorio di ricerca spe-rimentale nel settore delle Biotecnologie), dall’incontro del prof Schiavo, il prof. Di Bernardo, reduce da esperienza de-cennale negli Stati Uniti in qualità di ricercatore, e il dott. Andrea Miclet.L’idea di base era quella di proporre un’attività di laborato-rio nel campo delle biotecnologie che si differenziasse dalle normali esperienze operative e che andasse al di là del sem-plice esperimento, acquistato in kit, in cui spesso lo studen-te non si pone grandi interrogativi, ma segue l’attività come una ricetta di cucina, ma che assomigliasse il più possibile a un’attività di ricerca, con uno sviluppo temporale plurienna-le per il corso di studio di uno studente.

La classe pilota è stata una classe del liceo tecnologico (oggi scienze applicate) che ha mostrato interesse via via crescen-te e tutti gli alunni comunque hanno espresso una maggiore consapevolezza e una maturazione personale, con un mi-glioramento del profitto perlomeno nelle discipline scientifi-che. Alcuni degli studenti di questa classe hanno continuato lo studio delle biotecnologie anche a livello universitario.

Durante l’anno 2014-2015 è stato quindi proposto per la prima volta un percorso particolare, di circa trenta ore, a un gruppo di studenti volontari e interessati (del triennio di qualsiasi indirizzo) durante il pomeriggio. Durante quest’anno scolastico (2015-16) il progetto si è svi-luppato ulteriormente arrivando a circa 60 ore di attività.

Yearbook 2016


Il nostro laboratorio

The mission of the project - facilities and equipment of our lab.

Nel corso degli anni il nostro laboratorio è stato necessaria-mente attrezzato per lo svolgimento delle attività nel campo delle biotecnologie.L’obiettivo che ci siamo preposti mira a comprendere esat-tamente ciò che avremmo sviluppato nel corso della nostra ricerca e, per fare ciò, era necessario allontanarsi da quel-la che in molte scuole rappresenta la prassi di laboratorio nell’ambito delle biotecnologie: l’utilizzo dei kit. I kit in com-mercio hanno numerosi vantaggi: forniscono tutto il materia-le e le procedure per singoli esperimenti e permettono di re-alizzare alcune delle fasi di alcuni dei nostri progetti, con una probabilità di successo del 100%, eliminando così eventuali errori; tuttavia, per utilizzare un kit, basta seguire le istruzio-ni, senza alcun ragionamento.Quello che facciamo noi, invece, comprende tutta una fase di progettazione accurata, basata sulle nostre conoscenze e su ricerche passate, partendo da materiali “grezzi”, che ma-nipoliamo con i nostri strumenti, cercando di giungere a un risultato finale.Un lavoro di questo tipo permette la presa di coscienza da parte di tutte le fasi di ciò che si sta realizzando e di ciò che si sta utilizzando e le competenze acquisite sono notevoli.

Ma che strumenti utilizziamo? Cosa ci aiuta nelle nostre ri-cerche? Ovviamente l’avanzata attività che svolgiamo neces-sita di una altrettanto adeguata strumentazione, che adesso cerchiamo di illustrare: alla base dei progetti riguardanti il

DNA ci sono sicuramente il termociclatore, che è lo strumen-to che ci permette di amplificare un frammento di DNA, e le celle elettroforetiche, esse infatti, permettono di analizzare la presenza, le dimensioni e il numero di frammenti di DNA con un apposito gel (da noi prodotto per ogni utilizzo), l’elet-troforesi diventa infatti un eccellente meccanismo di control-lo. Per la quantificazione dei materiali utilizziamo anche lo spettrofotometro a raggi ultravioletti.

Analogamente, quando lavoriamo con le proteine, necessi-tiamo di una cella elettroforetica differente e di un gel diffe-rente. Con le proteine la situazione è un po’ più complessa: per cre-are il gel, infatti, lavoriamo con materiali che richiedono mag-giore attenzione, anche nella fase di smaltimento. Correlata alla cella per le proteine, abbiamo tutta l’apparec-chiatura per realizzare il western-blot, una delle procedure più complesse che richiede più tempo (anche quattro ore di laboratorio consecutive); per il western-blot lavoriamo con di-versi materiali, due tipi di anticorpo e è necessario preparare numerose soluzione tampone.Quest’anno abbiamo aggiunto alla nostra dotazione anche un sonicatore per l’estrazione delle proteine dai batteri per piccoli volumi.

Vi starete chiedendo dove conserviamo tutte le sostanze che usiamo: ebbene abbiamo due freezer di cui uno un po’ spe-ciale, e un frigorifero.In quest’ultimo conserviamo molte delle sostanze che non necessitano una temperatura eccessivamente bassa per la conservazione: nel nostro frigo troviamo brodi per la coltiva-zione di batteri, soluzioni “standard” per le nostre elettrofo-resi, e molto altro.Nel primo freezer, preserviamo la maggior parte delle sostan-


Yearbook 2016



Le modalità di lavoro del laboratorio comprendono:

1. Lab meetingIncontri informali, anche davanti a un caffe, una volta al mese o quando necessari, della durata di circa 20 minuti, in cui si discutono i problemi, le cause e le soluzioni. Brain-storming.

2.TutoringGli studenti più esperti svolgono attività di tutoraggio nei confronti dei nuovi studenti o di quelli che non conoscono l’argomento, anche con l’uso di materiali didattici.

3. Activity planningGli studenti organizzano il lavoro di laboratorio, per non avere tempi morti e per sfruttare al meglio l’attività.

ze di cui necessitano i nostri esperimenti: abbiamo numerosi primers (necessari per la duplicazione del DNA), plasmidi di ogni tipo per trasformare i nostri batteri, antibiotici per rende-re i batteri “resistenti”, enzimi e i risultati delle nostre attività.La parte “migliore”...quella viva se vogliamo... si trova nel fre-ezer speciale.Questo freezer arriva a -90°C, a questa temperatura le at-tività vitali delle nostre cellule si arrestano, permettendo al meglio la loro conservazione. Bisogna però stare attenti a non “bruciarsi” dal freddo quando si preleva il materiale da questo freezer, accuratamente tenuto chiuso a chiave.

Ad aiutarci nel nostro lavoro, troviamo infine una grossa au-toclave, che ci permette di sterilizzare ogni cosa e non con-taminare le nostre colture batteriche, numerose bilance di precisione, una microcentrifuga a elevato numero di giri (max 14 000 rpm), un incubatore basculante che permette di in-cubare e contemporaneamente agitare le colture liquide dei nostri batteri a una temperatura impostata.Abbiamo inoltre una cappa chimica, che è una zona del labo-ratorio, che ci permette di proteggerci da eventuali vapori no-

civi emanati da alcune sostanze. Un simpatico “vortex”, agita le nostre micro soluzioni e le mescola al meglio, numerose micropipette ci permettono di prelevare piccolissime quan-tità di soluzioni per lavorare con precisione estrema! Inoltre, non dobbiamo dimenticare tutte le strutture e attrezzature di base di un qualsiasi laboratorio scientifico!

Matteo Marinoni

Yearbook 2016


Area di progetto: batteri fluorescenti

Areadiprogetto:batterifluorescenti

Projectarea:FluorescentBacterialcultures

Our aim was to observe the GFP (green fluorescent protein).We started our project sterilizing materials and then proceeded to fill some plates with a jelly-like substance, called Agar. After-wards, we poured Ampicillin (an antibiotic) in every plate and repeated the same process using Arabinose (a monosaccharide that induces the protein’s production) with the only difference that we left one of the plates empty, without Arabinose.After filling the last plate, we waited for them to cool. In the end, we turned competent cells (those that accept foreign DNA) with Plasmid (a little DNA’s molecule that contains the genes of inter-est) and separated them half in the Arabinose’s plates and half in the one lacking it.

Results:The cells cultivated with the Arabinose were fluorescents, wheth-er the ones cultivated without stayed the same.Fun fact: the GFP is extracted from jellyfishes.

(Nina, Sadaf, Federica, Alice, Laura)

Areadiprogetto:Batterifluorescenti

L’esperimento è iniziato con la sterilizzazione dei vari materiali, e dalla preparazione dei diversi terreni di coltura, ai quali sono stati aggiunti, nella giusta proporzione, l’ampicillina (antibiotico) e, a una coltura, dell’arabinosio (zucchero che induce la produ-zione della proteina specifica). Abbiamo inserito all’interno delle cellule competenti un plasmi-de, cioè un piccolo filamento di DNA di origine batterica, che conteneva il gene della GFP (proteina per la fluorescenza verde, estratta da una medusa). Le cellule competenti sono cellule in grado di accettare DNA estraneo.

Il risultato ha portato a evidenziare una differenza tra la coltu-ra indotta dall’arabinosio, che ha sviluppato la fluorescenza e

Per l’area di progetto della classe 2° liceo linguistico è stata proposta un’attività nell’ambito delle biotecnologie. Si trat-ta della trasformazione batterica con il gene della GFP e la coltura di batteri già trasformati con geni per proteine con fluorescenza diversa. Le osservazioni su l’induzione della pro-teina hanno permesso di studiare il “dogma centrale della ge-netica”: DNA>RNA>proteina>fenotipo. L’esperienza ha suscitato un grande interesse da parte degli studenti, che comunque frequentano un indirizzo non incentra-to sulle discipline scientifiche, e che hanno voluto scrivere un breve report nelle diverse lingue studiate.

Drawing with fluorescent cells

nella quale le colonie batteriche sono visibilmente più piccole; la piastra senza arabinosio presenta invece colonie più grandi ma prive di fluorescenza.

(Shanti, Francesca, Andrea, Mattia)

Yearbook 2016


Area di progetto: batteri fluorescenti

Zoneduprojetscience:Culturesbactériennesfluo-rescentes

En premier lieu nous avons stérilisé les matériaux nécessaires-pour l’éxécution du projet: boîtes de Pétri, flacons et papier aluminium. Après la stérilisation des matériaux nous avons pré-paré des terrains de culture avec des antibiotiques, ampicilline et chloramphénicol, qui servent à maintenir en vie seulement les bactéries avec le plasmide, plus de l’arabinose pour induire la production de la proteine.Nous avons sélectionné des bactéries avec du plasmide qui contiennent le gène de la GFP, Green Fluorescent Protein (Pro-teine pour la fluorescence vert).

En conclusion on voit clairement que sans l’inducteur (Arabi-nose) les bactéries sont plus grandes, mais pas fluorescents. En plus, nous avons vu la phosphorescence bleue et verte seule-ment grâce à la lumière ultraviolette. Au contraire nous n’avons pas vu la fluorescence rouge et jaune, car elle est visible avec une autre lumière.

Écrit par : Diarra, Chiara, Nicole, Abbas e Hajar

Projektbereich:FluoreszierendeBakterien

Um die E.coli (BL21) Bakterien, Zellen die zuständig sind frem-des DNA anzunehmen, mit pGLO® (Plasmid mit dem fluoreszen-ten Gen) zu produzieren, haben wir die Materialien sterilisiert und die Kulturfläche vorbereitet. In manchen Platten ist die Arabinose (ein Zucker, der den Zellen erlaubt, die Proteine der Fluoreszens zu produzieren) zugefügt worden. In den Platten, wo keine Arabinose vorhanden war, wurde das fluoreszierende Pro-tein nicht produziert. Außerdem waren diese größer, weil sie wachsen konnten, ohne der Anstrengung der Produktion von GFP (green fluorescent protein). Zum Schluss haben wir die Wirkung der Umwandlung bestimmt: Wir haben das Experiment mit vier verschiedenen Farben gekennzeichnet (gelb YFP, rot RFP, blau BFP und grün GFP), durch die Benutzung des UV-Lichts waren nur GFP und BFP sichtbar, RFP und YFP nicht.

WUSSTES DU, dass das Gen der Fluoreszens von den Medusen entnommen wird?!

(Danny, Martina, Sarah, Katarina)

Yearbook 2016


White-Blue screening

White-blue screening is a biological technique that allows the detection of recombinant DNA. Basically some bacteria colo-nies will be white and other will be blue. We used a vector (the plasmid pBS) and the gene of a protein (BFP). This plasmid has inside a DNA- code that permit the digestion of X-Gal (a mutant monosaccharide), the insert (BFP) will break this information, so the recombinant plasmid can’t produce the enzyme. When the bacteria, with this plasmid without the gene grow, the colo-ny becomes blue because of the enzyme’s digestion. If the bac-teria’s colonies has the recombinant plasmid, the colour will be white, because the bacteria will not produce the enzyme for the digestion of the X-Gal. We repeat the experiment many times because the result was always negative. At the end we bring the white bacteria and make stocks, so we did the sequencing.

Il white blue screening è una tecnica che permette il riconosci-mento di DNA ricombinante incluso in un batterio, la presenza di una particolare modificazione genetica viene rensa visibile gra-zie a una diversa colorazione delle colonie batteriche. Viene uti-lizzato un particolare vettore, il plasmide pBlue Script, che con-tiene il gene che codifica un enzima, la β-galattosidasi, capace di digerire un particolare composto, l’X-Gal, che se scisso produ-ce una sostanza di colore blu. Il plasmide viene modificato intro-ducendo un gene estraneo all’interno della sequenza che codifi-ca l’enzima, impedendo così la produzione della β-galattosidasi, di conseguenza le colonie risultano bianche.

Per l’inserimento del gene nel plasmide abbiamo effettuato una digestione del vettore con un enzima che produce terminazioni

White-Bluescreening

Yearbook 2016


White-Blue screening

blunt-end, estremità con un taglio netto, e contemporaneamen-te abbiamo prodotto il gene con terminazioni blunt-end usan-do una particolare polimerasi (Pfu) in un processo di PCR. Con questo tipo di terminazione, non si è in grado di prevedere a priori il verso di introduzione del gene nel plasmide. Inoltre nelle colonie batteriche bianche abbiamo la certezza di aver inserito il gene, che però potrebbe risultare alterato. L’unico modo preciso per determinare la presenza e la correttezza del gene è il “se-quenziamento”, procedura che abbiamo affidato a una azienda esterna.

I processi che abbiamo utilizzato per svolgere l’intero esperi-mento sono stati:

• la PCR del gene (GFP/BFP), • il taglio del plasmide (pBS), • l’inserimento del gene nel plasmide • e infine l’inserimento del plasmide modificato nei batteri,• con successiva coltivazione.

La PCR è servita per riprodurre più filamenti di DNA del gene che codifica la proteina. Dopodiché abbiamo tagliato il plasmi-de in modo tale da poter inserire il gene. In seguito abbiamo introdotto il plasmide modificato nei batteri e abbiamo aspetta-to che crescessero. Per la distinzione di colore tra quelli con il gene e quelli senza, abbiamo aggiunto ai terreni di coltura uno zucchero, il galattosio modificato, e un antibiotico, l’ampicillina, in modo tale che nessun altro batterio potesse contaminare le nostre colture.

Ogni esperimento è stato affiancato da opportuni controlli, che permettevano di verificare se il processo eseguito fosse anda-to a buon fine, ad esempio dopo aver svolto la PCR abbiamo controllato tramite l’elettroforesi se le quantità prodotte fossero

sufficienti o meno per lo step successivo.Il white blue screening è stato ripetuto diverse volte, fino ad un esito positivo; inizialmente ci sono stati degli errori durante la ligation, cioè il processo di unione del gene con il plasmide li-nearizzato, e durante la trasformazione, a causa di un errato intervallo di tempo utilizzato per lo shock termico, variazione di temperatura necessaria a creare delle fessure sulla membrana del batterio e per permettere l’entrata del gene in esso.

Altro fattore decisivo è stata l’esecuzione dell’esperimento uti-lizzando diversi rapporti molari insert/vettore, infatti solo una condizione su tre ha avuto esito positivo.Altro particolare che aveva causato il fallimento della procedu-ra era stata la “defosforilazione” del plasmide digerito, passag-gio che normalmente si esegue per evitare che il plasmide si richiuda, ma che nel nostro particolare caso ne determinava il fallimento

Federica Barbi, Salma Hamzaoui e Diego Rossi

Yearbook 2016


GST: studio di una proteina

We prepared a bacterial culture preciously processed using the GST gene and we inducted the production of our protein. Then we extracted the GST by sonication. The next step was the purification by affinity chromatography. And finally we analysed qualitatively and quantitatively the extracted protein.

In questi mesi abbiamo sviluppato una serie di tecniche biochi-miche per la produzione e l’analisi di una proteina, non perché abbiamo previsto un uso particolare per essa, bensì per speri-mentare varie tecniche e mettere a punto i protocolli che utiliz-zeremo in futuro in altre situazioni.La prima fase comprendeva la trasformazione di batteri con un particolare plasmide, ossia un breve tratto di DNA di forma cir-colare, (pGEX), il quale conteneva il gene che codifica la proteina che abbiamo esaminato, nello specifico la GST (Glutathione S-Transferase). Lo stadio successivo prendeva in esame l’induzione batterica: abbiamo impiegato uno zucchero apposito (IPTG) per stimolare

la cellula a produrre la nostra proteina.

Dopo aver ottenuto una soddisfacente quantità di batteri in una coltura liquida, abbiamo estratto la GST con l’ausilio di un soni-catore, uno strumento capace di frantumare i batteri utilizzando ultrasuoni e, attraverso la centrifugazione, abbiamo separato le sostanze solubili da quelle non solubili e dai frammenti delle cellule batteriche, che si depositano sul fondo, riuscendo così a ottenere una soluzione ricca della nostra proteina.Dopodiché, tramite un processo chiamato cromatografia per affinità, siamo riusciti a purificare la nostra proteina. Abbiamo adoperato una particolare resina (glutatione sefarosio) alla qua-le si lega solo la proteina in esame, questo ci ha permesso di trattenere solo la GST legata alla resina, sciacquando via tutto il resto. Di seguito l’uso del “glutatione ridotto” ci ha permesso di separare la proteina dalla resina.A questo punto abbiamo ottenuto una soluzione che contiene unicamente la nostra proteina.

GST:studiodiunaproteina

Yearbook 2016


GST: studio di una proteina

Per esserne sicuri, abbiamo studiato la molecola estratta attraverso due passag-gi: uno per stabilirne la concentrazione e identificarla una prima volta grazie alla massa molecolare e uno per confermare che effettivamente si trattava di GST.Il primo passaggio si chiama elettrofore-si (SDS Page, che significa elettroforesi su gel di poliacrilammide, mentre SDS è un tensioattivo che denatura la proteina) e avviene distribuendo la proteina su di un gel in poliacrilammide e fornendo ad esso una differenza di potenziale elettri-co alle due estremità. La proteina, che viene preventivamente caricata elettri-camente, si sposta da un polo all’altro, migrando a velocità diversa in base alle sue dimensioni e, confrontando con uno standard la posizione in cui si è colloca-ta, se ne possono determinare la massa molecolare e la concentrazione.

Questo tipo di analisi ci ha permesso anche di stabilire l’efficienza del proces-so di purificazione, rivelandoci che sarà necessario ottimizzarne il protocollo du-rante il prossimo anno visto che è stata ottenuta una scarsa quantità di prodotto finale.

Infine abbiamo utilizzato una particolare tecnica chiamata Western Blot che ci ha permesso di stabilire che si trattava sen-za dubbio di GST. La procedura prevede l’uso di anticorpi specifici, che si legano esclusivamente alla proteina esaminata e che possono poi essere evidenziati da particolari coloranti.

Miriana MiragoliRajaa Raoufi Laura Taranto

Yearbook 2016


Mutagenesi della GFP

The GFP gene, protein with fluorescence properties, is often used as marker in the analysis of proteins and their interactions, because is not an invasive protein.For these reasons, it has been extensively studied and changed to emit florescence of different colors. In this project was adopted a particular technique for mutagenesis, Overlap-PCR, a sequence of the polymerase chain reactions with primers which induce mutations. It was decided to develop the mutagenesis of GFP in BFP (protein with blue fluorescence). The experience has had a positive result and the technique and protocols developed worked perfectly. The experience currently lacks expression of the protein at the phenotypic level.

Il gene della GFP, proteina con proprietà di fluorescenza, è spes-so utilizzato come marker nell’analisi delle proteine e delle loro interazioni, non essendo, infatti, una proteina invasiva. Per que-sti motivi è stata largamente studiata e mutata per emettere fluorescenza di colori diversi. In questo progetto è stata adottata una particolare tecnica per la mutagenesi, Overlap-PCR1, una

sequenza di reazioni a catena della polimerasi, con primer2 che inducono le mutazioni Da un’analisi bibliografica abbiamo individuato la possibilità di mutare la GFP in BFP, proteina con fluorescenza di colore blu, inducendo due mutazioni puntiformi. Durante il 2015 la mutage-nesi era riuscita, ma era stato prodotto esclusivamente il gene mutato. Dopo una fase di analisi dei problemi e una attenta program-mazione quest’anno abbiamo ripreso il progetto raggiungendo la fase seguente. Abbiamo ridisegnato i primer iniziale e finale, allungandoli, per permettere agli enzimi di restrizione di legarsi più facilmente, e abbiamo ripercorso tutte le tappe della muta-genesi, ottimizzando il protocollo definito l’anno precedente. Poi-ché uno dei punti critici era stata la “ligation”, cioè l’inserimen-to del gene in un plasmide3, abbiamo preferito aggiungere uno step intermedio: abbiamo incluso il gene mutato nel pBlueScript, plasmide di clonaggio utilizzato per il white-blue screening, che ha due vantaggi:

1. ci permette di riconoscere immediatamente i batteri che con-tengono il gene, infatti le cellule si distinguono da quelle in cui non è presente per una diversa colorazione, 2. sarà possibile successivamente ottenere una grande quanti-tà del nostro gene.

MutagenesidellaGFP

Yearbook 2016


Mutagenesi della GFP

L’esito del processo è stato positivo. Abbiamo ottenuto circa venti colonie batteriche che mostravano la presenza del nostro gene, siamo riusciti a prelevarne otto, ben isolate, che abbiamo coltivato e stoccato. Dalle prime quattro abbiamo estratto il plasmide e dopo un’analisi di restrizione le abbiamo spedite per un sequenziamento. Tutte le quattro colonie hanno mostrato la presenza del gene in copia singola. Ora siamo pronti per la fase successiva che svolgeremo il prossimo anno. Dopo aver coltivato i batteri trasformati, ne estrarremo i plasmidi contenenti il gene della BFP, taglieremo il gene alle estremità, in punti definiti nella fase di progettazione dei primer, con gli stessi enzimi taglieremo un plasmide di espressione, legheremo insieme gene e plasmide ricreando un anello e finalmente inseriremo il plasmide in batteri. A questo punto sarà possibile indurre la produzione della proteina fluorescente, estrarla dai batteri e purificarla.

MS

Qualche termine specifico:1. La PCR (polymerase chain reaction, reazione a catena della polimerasi) è una tecnica di biologia molecolare utilizzata per amplificare in breve tempo tratti spe-cifici di DNA.2. Il Primer è un breve tratto di DNA necessario come innesco nei processi di repli-cazione di un gene o in generale di segmenti di DNA. 3. I plasmidi sono piccoli anelli di DNA presenti nei batteri, che vengono spesso utilizzati per trasferire nuove informazioni genetiche all’interno delle cellule.

Progettazione RFP

L’idea iniziale per l’anno scolastico 2015/2016 era la progettazione della mutagenesi di due nuove proteine fluorescenti: la YFP (proteina fluorescente gialla) e la RFP (proteina fluore-scente rossa). Ci siamo quindi divisi in due gruppi, ognuno responsabile di una differen-te progettazione. La mutagenesi per ottenere YFP non è sembrata troppo difficoltosa, ma il risultato sarebbe stato sicuramente meno visibile rispetto alla RFP, che stimolava in noi un interesse maggiore. La YFP infatti emet-te comunque, nonostante il nome, un colore verde chiaro. Il mio gruppo si occupava della progettazione della RFP e fin da subito si sono riscontrati numerosi problemi. La principale difficoltà interessava il numero di mutazioni: si parla infatti di 6/7 mutazioni importanti che

sono situate oltretutto molto vicine tra loro. Inoltre dall’analisi bibliografica risulta una capacità di maturazione della proteina allo stato di fluorescenza molto ridotta, si parla infatti del 1-3 %. Le difficoltà riscontrate nella progettazione della mutagenesi hanno fatto accantonare questa parte del progetto a favore del completamento dei processi di espressione legati alla mutagenesi della GFP in BFP, tuttavia, nei prossimi anni, non si esclude una nuova ricerca e una nuova progettazione della RFP.

Daniele Trivellato

Yearbook 2016


Presentazione all’Eurac

For two years we have presented the results of our laboratory of biotechnology in the “Days of Science” organized at the Eurac research of Bolzano. Guests who came to hear us came from schools of different levels, from elementary to high school, with great participation even of middle school students..

Per due anni abbiamo presentato i risultati del laboratorio di biotecnologie alle “Giornate delle Scienze” organizzate presso l’Eurac research di Bolzano. Gli ospiti che sono venuti a sentirci provenivano dalle scuole di diverso livello, dalle elementari alle superiori, con grande partecipazione anche delle scuole medie. Relazionare a tanti ragazzi di così differente età è sempre diffi-coltoso perché, ovviamente, le conoscenze in campo scientifico sono molto diverse. Di conseguenza per ogni relazione abbiamo dovuto adottare tipologie di approccio e di linguaggio diverse, in modo tale da farci capire da tutti. Spesso, inoltre, ci venivano poste domande anche da docenti o comunque da persone con maggiori competenze nelle discipline scientifiche che erano presenti alla manifestazione.Per la presentazione ci siamo serviti di video e materiale grafico,

Presentazioneall’Eurac

per spiegare in particolare le procedure di laboratorio.

I ragazzi che sono venuti a sentirci, soprattutto quelli delle scuole elementari e medie, sono rimasti particolarmente

Yearbook 2016


Presentazione all’Eurac

affascinati dagli strumenti che utilizziamo. Abbiamo ad esempio insegnato loro come si utilizzano le micropipette, in modo pratico, oppure abbiamo osservato e commentato insieme a loro dei gel in agarosio con il transilluminatore.In generale abbiamo presentato particolari percorsi, da quelli più semplici, come amplificare il DNA con la PCR, fino a quelli più comples-si, come il processo di mutagenesi di una proteina, abbiamo illustrato le principali tecniche che utilizziamo in laboratorio, i successi che abbiamo ottenuto, ma anche i problemi che abbiamo incontrato e infine abbiamo cercato di spiegare il diverso approccio che utilizziamo nelle attività di laboratorio.

Massimiliano Mengarino, Alberto Mascotto e Daniele Trivellato

Yearbook 2016


Cinguline

Our most ambitious project is a research in a field that concerns the proteins involved in the construction of the silica theca of diatoms, the cingulines. A deeply felt thanks goes to Dr. Kröger, director of the Research Center B CUBE (Dresden), who kindly donated the cDNA of cingulines. Of course without this dona-tion it would not have been possible to undertake our project.

Nella fase di pianificazione del laboratorio “Lars Biotech” è stato proposto anche l’obiettivo di avventurarci in una attività di ricerca. Un progetto molto ambizioso per una scuola media superiore, ma che generava molti stimoli e entusiasmo da parte di tutti i partecipanti.Un progetto di questo tipo ha inevitabilmente uno sviluppo plu-riennale, così diventa molto importante che ci sia un aggiorna-mento da parte degli studenti più esperti nei confronti di quelli nuovi.

L’argomento che è stato definito riguarda le proteine coinvolte nella costruzione della teca delle diatomee, alghe microscopi-che dotate di rivestimento siliceo. Il progetto ha avuto inizio con un’analisi bibliografica per capire quali geni fossero necessari alle diatomee per costruire il frustolo (la teca silicea appunto) e il possibile utilizzo di questi geni per produrre strutture silicee eventualmente in un batterio.Questo campo di studio è estremamente attuale perché interse-ca l’ambito delle nanotecnologie,

Cinguline

Yearbook 2016


Cinguline

Dall’esame di molte pubblicazioni scientifiche sono state individuate particolari proteine (cingu-line), che sembrano significative per la costruzio-ne delle teche silicee delle diatomee. L’obiettivo, per l’anno 2015, coincideva con l’individuazione e il reperimento del cDNA per il gene specifico.Pertanto è stato contattato un importante centro di ricerca, il BCubedi Dresda (DE); il dott. Kröger, direttore del settore delle biotecnologie applicate alle nanotecnologie, è stato estremamente dispo-nibile e quest’anno ci ha donato i cDNA di due cinguline.Esistono diverse pubblicazioni sul lavoro svolto dal B Cube incentrate soprattutto sulla costruzio-ne di particolari pattern e strutture geometriche che riguardano il frustolo delle diatomee.

La ricerca pubblicata dal dott. Kröger nel 2016 interessa anche l’espressione di due cinguline (CynY2 e CynW2) in E.Coli, e sono proprio questi i geni inseriti in un plasmide di espressione che ci sono stati inviati. Per noi è sicuramente una fortuna perché sono stati progettati per l’espres-sione in batteri, spesso infatti il codice genetico utilizzato da altri organismi non è perfettamente funzionale nei batteri e per l’espressione in cellu-le procariote il gene deve essere ottimizzato inge-gneristicamente.

I cDNA ci sono stati spediti disidratati su carta, appena arrivati abbiamo provveduto a reidratarli e inserirli in batteri (ceppo BL21 pLysS) che ab-biamo coltivato. Abbiamo di seguito preparato gli stock con glicerolo e congelato il tutto a -80°C,

dal residuo della coltura abbiamo estratto i plasmidi, che abbiamo analizzato utilizzando una elettroforesi su gel.

Il prossimo anno inizieremmo quindi con la nostra attività di ricerca vera e propria, utilizzando i protocolli dei processi sviluppati e messi a punto con le sperimentazioni degli anni scorsi. Abbiamo già molte idee, ma il percorso sarà definito e ridefinito in base agli esiti delle diverse fasi, si dovranno adottare le soluzioni migliori come conseguenza dei risultati ottenuti e forse la conclusione, se ci sarà, sarà diversa da quella che si potrebbe prevedere. Faremmo ricerca.

MS

Photo by Frank Fox (www.mikro-foto.de)

Photo by Public Library of Science journal.

Yearbook 2016


Stage in un centro di ricerca

Some of our students have done an internship at CIBIO, The Centre for Integrative Biology at the University of Trento, where they were able to observe directly methods of a highly specialized research laboratory. They were able to put into practice the acquired knowledge, alongside a researcher in the laboratory.

Alcuni nostri studenti hanno frequentato uno stage al CIBIO, cen-tro di biotecnologie integrate presso l’università di Trento, dove hanno potuto osservare direttamente le metodologie di un labora-torio di ricerca di alta specializzazione.Nel 2015 Daniele Trivellato ha frequentato un tirocinio di due settimane presso la sede provvisoria di Mattarello, affiancando il dott. Luigi Pasini nel gruppo di ricerca “Translational Genomics”, partecipando come parte attiva per alcune procedure di laborato-rio, come ad esempio per western blot.

L’esperienzadiquest’anno.

I ragazzi della nostra scuola alla fine del quarto anno hanno la possibilità di svolgere un’esperienza di alternanza scuola-lavoro, ovvero qualche settimana che ha l’obiettivo di orientare l’alunno verso un possibile futuro ambito lavorativo.Da due anni a questa parte il Cibio (Centre for Integrative Biology, dell’università di Trento) ha dato disponibilità ad uno dei ragazzi

Stageinuncentrodiricercadel nostro laboratorio di svolgere questa esperienza in un am-biente di ricerca scientifica.Quest’anno mi è stata data questa opportunità, e sono stata assegnata al laboratorio di “Molecular Neuropathology” diretto dal professor YuriBozzi, sotto la supervisione del dottor Giovanni Provenzano. Nel periodo del mio tirocinio stavano studiando l’autismo attraverso diverse metodologie specifiche.

Yearbook 2016


Stage in un centro di ricerca

Durante le mie due settimane di permanenza ho potuto capire come si lavora in un laboratorio specializzato ed ho potuto impa-rare nuove nozioni e tecniche che fino a quel momento mi erano sconosciute.Nel laboratorio si organizzano inoltre settimanalmente degli incontri, quali “Lab meeting” e “Journal club”. I “Lab meeting” consistono in riunioni in cui i vari membri del laboratorio espon-gono i risultati che hanno ottenuto o propongono nuovi progetti. Durante i “Journal club”, invece, qualcuno a rotazione deve stu-diare un articolo scientifico di recente pubblicazione ed esporlo, per poi trovare al suo interno imprecisioni o dati in realtà poco significativi per evitare di commettere gli stessi errori e organiz-zarsi al meglio per una futura pubblicazione.Nella mia esperienza specifica, l’obiettivo formativo del tiroci-nio è stato quello di ottimizzare un protocollo di immunofluore-scenza per valutare l’espressione della proteina GFAP in cervelli murini. La GFAP è specifica per un particolare tipo di cellule ce-rebrali: gli astrociti (foto a pagina 20). Durante l’esperienza ho però potuto prendere parte anche • a colorazioni di Nissl, per determinare la disposizione di

alcune strutture neuroanatomiche; • a colorazione mediante l’uso di DAPI, che emette una

fluorescenza azzurra (foto sopra); • al taglio di sezioni di cervelli murini tramite vibratomo; • a “real-time PCR”, metodologia che consente di valutare

l’espressione di alcuni geni in determinate aree cerebrali.Ho trovato il tirocinio veramente interessante e penso sia stata una bellissima esperienza, in quanto mi ha permesso di farmi un idea più precisa sugli studi che ho intenzione di intraprende-

re. Mi è risultata utile l’esperienza già maturata nel laboratorio scolastico, che mi ha consentito di partecipare con maggiore consapevolezza e profitto a questa esperienza in un laboratorio estremamente specialistico come quello del CIBIO.

Nina Desiato

Anche noi siamo rimasti molto contenti di Nina. ... E quando è arrivata al Cibio, abbiamo capito subito che aveva già un’ottima preparazione. Per noi è stata un’esperienza molto positiva, e mi auguro che Nina decida di iscriversi a biotecnologie l’anno prossimo, sarà un piacere averla di nuovo in laboratorio.

Yuri Bozzi

Yearbook 2016


Partecipa anche tu

Data l’esperienza acquisita in questi anni e la strumentazione dedicata di cui disponiamo, il nostro laboratorio offre supporto per attività nel settore delle biotecnologie ad altre scuole.

Durante l’anno scolastico 2012-2013 abbiamo ospitato una classe del liceo scientifico di Vipiteno per un’intera giornata.

Durante l’anno scolastico 2013-2014 abbiamo ospitato una classe 4° del liceo scientifico “Dante Alighieri“ di Bressanone per una mattinata.

Durante l’anno scolastico 2015-2016 abbiamo ospitato una 5° classe del liceo scientifico “A. Einstein” in madre lingua tedesca di Merano, con attività di un pomeriggio e con l’osservazione dei risultati il giorno seguente.

Le attività che sono state proposte sono:• PCR (reazione a catena della polimerasi)• Estrazione di DNA da colture batteriche• Digestione enzimatica• Elettroforesi e analisi dei gel• Trasformazione batterica • Espressione delle proteine

Le attività sono state declinate in base al tempo a disposizione.

Le nostre proposte vanno da esperienze di poche ore fino a giornate intere, o, come quest’anno, di alcune ore, ma distribuite in più giorni, attività possibili praticamente solo per scuole della nostra città.

Partecipaanchetu

Studenti del liceo scientifico “A. Einstein”

L’esperienza delle scuole che abbiamo ospitato

Yearbook 2016


La lettera di un Nobel

Traduzione:

Plaudo i vostri sforzi per introdurre gli studenti alla scienza sperimentale, inducendoli a sviluppare una serie di esperimenti molto ben pensati.La scienza è basata su osservazioni della natura e insegnare agli studenti come progettare e condurre esperimenti è un ottimo modo per stimolare il loro interesse e accrescere la loro curiosità nelle scienze naturali.Sono totalmente a favore della vostra iniziativa e vi auguro il massimo successo.

Il Dottor Sir John E. Walker è riconosciuto a livello mondiale per i suoi studi sull’ enzima ATP sintasi. Egli ha risolto in particolare la struttura di questo enzima, chiarificandone il meccanismo di azione.Per questi suoi studi pionieristici nel 1997 ha conseguito insieme a Paul Boyer il premioNobelper la chimica.

L’ATP sintasi ha un ruolo fondamentale nelle nostre cellule dato che sintetizza la maggior parte dell’ATP che dà energia ai processi cellulari.L’ATP sintasi è un enzima formato da due domini, uno transmembrana e uno esterno alla membrana. Il dominio transmembrana è detto F0 ed è un canale protonico, il dominio F1 è citoplasmatico ed è il dominio catalitico. Ioni H+ passano, secondo un gradiente di concentrazione, attraverso il dominio transmembrana e mettono in rotazione l’enzima. Quello che fa dell’ATP sintasi una “splendida macchina molecolare” è l’associazione del dominio F0 col dominio F1. E’ questa associazione che permette la catalisi di ATP a partire da ADP e Pi grazie al flusso dei protoni.

È stata una fantastica ed inaspettata sorpresa ricevere una lettera di sostegno da parte del Dr Walker indirizzata proprio al nostro gruppo. Un tale incoraggiamento, da una così autorevole personalità del mondo scientifico non può che renderci orgogliosi e spingerci verso traguardi sempre più ambiziosi e importanti.

“Walker, Sir John”. Photo. Encyclopædia Britannica Online. ThankyouDr.Walker

ATP sintasi, David S. Goodsell, (http://pdb101.rcsb.org)

30 September 2015

Dear Maurizio and the Lars Biotech Team,

I applaud your efforts to introduce your students to experimental science by getting them to do a series of very well-thought out experiments.

Science is about making observations of the nature, and teaching the students how to design and perform experiments is an excellent way of stimulating their interest, developing their curiosity in the natural sciences.

I am totally in favour of your initiative and wish you every success.

John Walker

LaletteradiunNobel

Yearbook 2016


Team

Team

Daniele Trivellatoclasse 5LSSenior Team member

Massimiliano Mengarinoclasse 5LSSenior Team member

NinaDesiatoclasse 4LSATutor Team member

LauraTarantoclasse 3LSFellow Team member

RajaaRaouficlasse 3LSFellow Team member

Miriana Miragoliclasse 3LSFellow Team member

Alberto Mascotto classe 5LSSenior Team member

Matteo Marinoniclasse 4LSATutor Team member


Yearbook 2016Team

Salvatore Di Bernardo Andrea Miclet MaurizioSchiavo

FedericaBarbiclasse 3LSAFellow Team member

SalmaHamzaouiclasse 3LSAFellow Team member

Diego Rossiclasse 3LSAFellow Team member

FedericaCarotta classe 3LSTeam member per la prima parte dell’anno.

Hanno inoltre partecipato e contribuito ai laboratori di Biotecnologia gli studenti delle classi 3° e 4° Liceo delle scienze applicate e la classe 2°Liceo linguistico A durante l’area di progetto.

Yearbook 2016


Ringraziamenti

Vogliamo ringraziare tutte le persone e le aziende che ci hanno dimostrato la loro grande disponibilità e hanno collaboarato per la riuscita del nostro laboratorio:

Area pedagogica dell’intendenza scolastica, Provincia di Bolzano,per i finanziamenti al nostro progetto

Centro di Biomedicina dell’Eurac di Bolzano: il dott. Alessandro De Grandi, responsabile del laboratorio, per averci permesso di utilizzare alcuni strumenti del loro laboratorio e specialmen-te la dott.ssa ClaudiaVolpatoper la grandissima pazienza e disponibili-tà, per gli aiuti pratici e per i preziosi consigli.

CIBIO - Centre for Integrative Biology, Università di TrentoPer la possibilità che viene offerta ai nostri studenti di frequentare stage presso il loro centro,In particolare BettyBalduin per la sua gentilezza e disponibilità e pron-tezza nel rispondere alle nostre richieste e la prof.ssa Simona Casarosa, referente per gli stage.Daniele e tutti noi vogliamo inoltre ringraziare il dott. LuigiPasini e il dott. Daniele Peroni.Nina e tutti noi ringraziamo il prof. YuriBozzie il dott. Giovanni Provenzano.

BCUBE – Center for Molecular BioengineeringIl Prof. Nils Kröger per la grande gentilezza e generosità e il Dott. Alexander Kotzsch per averci materialmente spedito il cDNA e le indicazioni di utilizzo.

Infine ringraziamo il premioNobelper la chimica, il dr. John Ernest Walker dell’ MRC, per l’incoraggiamento.

RingraziamentiAcknowledgements

lars

Biotech

Biotech Lars...4 Lars Biotech Report 2016 Presentazione Yearbook 2016 Il nuovo anno si apre con...

Documents

Transcript of Biotech Lars...4 Lars Biotech Report 2016 Presentazione Yearbook 2016 Il nuovo anno si apre con...