Attività del Laboratorio Nazionale di Riferimento nell’ambito delle

micotossine

Francesca Debegnach

Reparto OGM e Xenobiotici di Origine Fungina

ISTITUTO SUPERIORE DI SANITÀ (ISS) COME LABORATORIO NAZIONALE DI RIFERIMENTO (LNR):

Decisione della Commissione 98/536/CEE stabilisce l’elenco dei Laboratori Nazionali di Riferimento per la ricerca dei residui

Direttiva 96/23/CE, recepita con DL.vo 336/99Che designa l’ISS come LNR per le micotossine (Allegato 1 - categoria B3d)

COMPITI DEL LABORATORIO NAZIONALE DI RIFERIMENTO:Regolamento CE N. 882/2004 – Art. 331. Gli Stati membri predispongono che per ciascun Laboratorio Comunitario di

Riferimento…siano designati uno o più Laboratori Nazionali di Riferimento.

2. Questi Laboratori Nazionali di Riferimento:a) collaborano con il Laboratorio Comunitario di Riferimento nel loro ambito di

competenza;b) coordinano, nella loro sfera di competenza, le attività dei laboratori ufficiali

responsabili dell’analisi dei campioni a norma dell’articolo 11;c) se del caso, organizzano test comparativi tra i laboratori nazionali ufficiali e

assicurano un adeguato follow-up dei test comparativi effettuati;d) assicurano la trasmissione all'autorità competente e ai laboratori nazionali ufficiali

delle informazioni fornite dai laboratori comunitari di riferimento;e) offrono assistenza scientifica e tecnica all'autorità competente per l'attuazione di piani

di controllo coordinati adottati a norma dell’articolo 53;f) hanno la responsabilità di effettuare altri compiti specifici previsti secondo la

procedura di cui all’articolo 62, paragrafo 3, fatti salvi ulteriori compiti nazionali previsti.

a) collaborano con il Laboratorio Comunitario di Riferimento nelloro ambito di competenza;

b) coordinano, nella loro sfera di competenza, le attività dei laboratori ufficiali responsabili dell’analisi dei campioni a norma dell’articolo 11;

c) se del caso, organizzano test comparativi tra i laboratori nazionali ufficiali e assicurano un adeguato follow-up dei test comparativi effettuati;

d) assicurano la trasmissione all'autorità competente e ai laboratori nazionali ufficiali delle informazioni fornite dai Laboratori Comunitari di Riferimento;

e) offrono assistenza scientifica e tecnica all'autorità competente per l'attuazione di piani di controllo coordinati adottati a norma dell’articolo 53;

f) hanno la responsabilità di effettuare altri compiti specifici previsti secondo la procedura di cui all’articolo 62, paragrafo 3, fatti salvi ulteriori compiti nazionali previsti.

a) collaborano con il Laboratorio Comunitario di Riferimento nel loro ambito di competenza;

b) coordinano, nella loro sfera di competenza, le attività dei laboratori ufficiali responsabili dell’analisi dei campioni a norma dell’articolo 11;

c) se del caso, organizzano test comparativi tra i laboratori nazionali ufficiali e assicurano un adeguato follow-up dei test comparativi effettuati;

d) assicurano la trasmissione all'autorità competente e ai laboratori nazionali ufficiali delle informazioni fornite dai Laboratori Comunitari di Riferimento;

e) offrono assistenza scientifica e tecnica all'autorità competente per l'attuazione di piani di controllo coordinati adottati a norma dell’articolo 53;

f) hanno la responsabilità di effettuare altri compiti specifici previsti secondo la procedura di cui all’articolo 62, paragrafo 3, fatti salvi ulteriori compiti nazionali previsti.

Il Laboratorio Nazionale di Riferimento

Fornisce ai laboratori ufficiali:

Consulenza tecnica e scientifica

Metodi di campionamento e di analisi

Organizza studi di validazione

Organizza corsi di formazione e aggiornamento

STUDIO DI VALIDAZIONE PER LA

DETERMINAZIONE DELLA AFLATOSSINA

B1 NEL MAIS

Lo studio è stato presentato al CEN ed è attualmente in discussione

Il lavoro è in pubblicazione su Journal of chromatography

LABORATORI PARTECIPANTI:

24 laboratori nazionali

6 laboratori europei

TOTALE: 30 PARTECIPANTI

MATERIALI (I)

Campione di analisi:

GRANELLA DI MAIS MACINATA

La scelta del mais in granella è legata alla necessità di considerare la matrice integrale allo scopo di poter impiegare il metodo sia per l’analisi di prodotti derivati (farina per polenta) sia per il mais destinato ad uso zootecnico.

MATERIALI (II)

3 livelli di contaminazione5 livelli:

2 livelli di spike

Bianco≅ 2 µg/kg (ppb)≅ 15 µg/kg (ppb)

2 µg/kg (ppb)5 µg/kg (ppb)

ELABORAZIONE STATISTICA DEI RISULTATI (I)

E ed I (SPK)5.00 µg/kg

D ed F*17.60 µg/kg

C e G*0.00 µg/kg

B ed H*2.20 µg/kg

A ed L (SPK)2.00 µg/kg

Campione

2621272125Numero risultati accettati

18062Numero laboratori con outliers

3030303030Numero laboratori partecipanti

20052005200520052005Anno

* Campioni naturalmente contaminati

ELABORAZIONE STATISTICA DEI RISULTATI (II)

4.2115.53-1.861.64Valore medio(µg/kg)

E ed I (SPK)5.00 µg/kg

D ed F*17.60 µg/kg

C e G*0.00 µg/kg

B ed H*2.20 µg/kg

A ed L (SPK)2.00 µg/kg

Campione

2.034.95-0.860.87Limite di ripetibilità – r (r=2.8x Sr) (µg/kg)

17.2011.39

(≤ 15)

-16.58

(≤ 20)

18.97Dev. St. Rel. Ripetibilità RSDr (%)

0.721.77-0.310.31Dev. St. ripetibilità - Sr (µg/kg)

* Campioni naturalmente contaminati

ELABORAZIONE STATISTICA DEI RISULTATI (III)E ed I (SPK)5.00 µg/kg

D ed F*17.60 µg/kg

C e G*0.00 µg/kg

B ed H*2.20 µg/kg

A ed L (SPK)

2.00 µg/kg

Campione

84± 23---82± 23Recupero (%)

0.840.68-0.750.68Valore di HORRAT

3.508.77-1.571.28Limite di riproducibilità R (R=2.8x RSDR) (µg/kg)

29.7220.16

(≤ 20)

-30.24

(≤ 30)

27.78Dev. St. Rel. di Riproducibilità RSDR (µg/kg)

1.253.13-0.560.46Dev. St. di riproducibilità SR(µg/kg)

* Campioni naturalmente contaminati

INDICE DI HORRAT

L’indice di Horrat rappresenta una guida per determinare l’accettabilità della precisione di un metodo.

L’indice di Horrat è il rapporto tra la deviazione standard di riproducibilità (RSDR) ed il valore previsto della deviazione standard di riproducibilità (predicted reproducibility standard deviation-PRSDR).

La previsione viene fatta sulla base del livello medio di contaminazione del materiale preso in esame.

La riproducibilità del metodo è garantita se il valore di Horrat è tra0.5 e 1.5

STUDIO DI VALIDAZIONE PER LA

DETERMINAZIONE DELLA OCRATOSSINA

A IN CAMPIONI DI CACAO IN POLVERE

Lo studio è stato presentato al CEN ed è attualmente in discussione (verrà presentato come prEN

xxx in autunno al technical Committee)

Il lavoro è stato pubblicato:

Brera C., S. Grossi, Miraglia M. (2005). Interlaboratory study for ochratoxin A determination in cocoa

powder samples. Journal of Chromatography & Related Technologies. Vol. 28(1), 35-62.

Brera C., S. Grossi, Miraglia M. (2003). High performance liquid chromatographic method for the

determination of ochratoxin a in cocoa powder. Journal of Liquid Chromatography & Related

Technologies. Vol. 26(4), 585-598.

LABORATORI PARTECIPANTI:

14 laboratori nazionali

4 laboratori europei

TOTALE: 18 PARTECIPANTI

Scientific Institute of Public Health - BelgiumDr. J. Y. Michelet

Central Science Laboratory - UKDr. S. Mc Donald

BGVV – Mycotoxins and Contaminants - GermanyDr. H. Klaffke

Centro National de Alimentation – Istituto de Salud Carlos III (Isciiù) - SpainDr. P. A. Burdaspal

Laboratori EuropeiNeotron S.p.A.Dr. G. Zoboli

ARPA Emilia Romagna – Area Analitica Alimenti e TossicologiaDr. S. Zanotti

ARPAV – Servizio Laboratori DAP, VeneziaDr. F. Zanon

ARPAT – Dipartimento LivornoDr. G. Spinelli – Dr. M. Mazzetti

IZS Abruzzo e Molise – Bromatologia e ResiduiDr. G. Scortichini

Progetto Natura, S.r.l., PratoDr. P. Pucci

ISAN – Università “Sacro Cuore” PiacenzaProf. A. Pietri

ARPAV – Laboratorio Chimica degli AlimentiDr. B. Gnech

Chemical Control S.r.l.Dr. L. Gandino

ARPA Campania – Dipartimento NapoliDr. G. Esposito

ARPA Piemonte – Polo AlimentiDr. P. Branca

ARPA Emilia Romagna – Sezione di BolognaDr. C. Bergamini

ARPA Lazio – Sede di RomaDr. B. Bencivenga

Parmalat – Ricerca e Sviluppo,Dr. E. Bassi

Laboratori Nazionali

MATERIALI

2.00 µg/kg

0.60 µg/kg3 livelli:

0.10 µg/kg (bianco)

0,290,160,410,130,07Dev. St. di riproducibilità SR (µg/kg)

3130293040Dev. St. Rel. Riproducibilità RSDR (%)

0,810,45

1,150,360,20Limite di ripetibilità – R (R=2.8x Sr) (µg/kg)

0.690.610.670.580.68Valore di HORRAT

0,530,310,620,220,14Limite di ripetibilità – r (r=2.8x Sr) (µg/kg)

3029312924Numero laboratori partecipanti

3027312924Numero laboratori dopo eliminazione degli outliers

80± 2480 ± 25---Recupero (%)

20(≤ 20)

20(≤ 20)

15(≤ 20)

19(≤ 20)

29(≤ 40)

Dev. St. Rel. Ripetibilità RSDr (%)

0,190,110,220,080,05Dev. St. ripetibilità - Sr (µg/kg)

0,940,531,420,420,17Valore medio (µg/kg)

Spike(1 µg/kg)

Spike(0.5 µg/kg)

Livelloalto

Livellomedio

LivellobassoCampioni

a) collaborano con il Laboratorio Comunitario di Riferimento nel loro ambito di competenza;

b) coordinano, nella loro sfera di competenza, le attività dei laboratori ufficiali responsabili dell’analisi dei campioni a norma dell’articolo 11;

c) se del caso, organizzano test comparativi tra i laboratori nazionali ufficiali e assicurano un adeguato follow-up dei test comparativi effettuati;

d) assicurano la trasmissione all'autorità competente e ai laboratori nazionali ufficiali delle informazioni fornite dai Laboratori Comunitari di Riferimento;

e) offrono assistenza scientifica e tecnica all'autorità competente per l'attuazione di piani di controllo coordinati adottati a norma dell’articolo 53;

f) hanno la responsabilità di effettuare altri compiti specifici previsti secondo la procedura di cui all’articolo 62, paragrafo 3, fatti salvi ulteriori compiti nazionali previsti.

OCRATOSSINA A IN CAMPIONI DI

POLVERE DI CACAO

PROFICIENCY TESTING

Il lavoro è in pubblicazione:

Brera C., S. Grossi, F. Debegnach, B. De Santis, V. Minardi, M. Miraglia. Proficiency

testing as a tool for implementing internal quality control: the case of ochratoxin A

in cocoa powder. Accreditation and quality assurance.

-4,00

-3,00

-2,00

-1,00

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

7 2 9 10 34 11 38 15 24 26 35 37 3 27 25 22 17 30

Codice Laboratorio

z-sc

ores

0.71 µg/kg

0.28 µg/kg

Z-scores per ochratoxin A (0.40 µg/kg) in campioni di cacao

-6,00

-4,00

-2,00

0,00

2,00

4,00

6,00

8,00

10 2 7 34 11 24 38 9 35 37 3 26 25 15 27 30 17 22

Codice Laboratorio

z-sc

ores

0.11 µg/kg

0.29 µg/kg

Z-scores per ochratoxin A (0.19 µg/kg) in campioni di cacao

-4,00

-3,00

-2,00

-1,00

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

9 7 2 10 38 3 27 34 22 37 26 11 15 24 17 35 25 30

Codice Laboratorio

z-sc

ores

2.43 µg/kg

0.94 µg/kg

Z-scores per ochratoxin A (1.45 µg/kg) in campioni di cacao

6718121.45

6118110.40

5618100.19

Percentuale di soddisfazione

Numero totale diz- scores

Numero diz-scores

soddisfacenti| z | ≤ 2

Concentrazione di OTA (µg/kg)

6718121.45

6118110.40

5618100.19

Percentuale di soddisfazione

Numero totale diz- scores

Numero diz-scores

soddisfacenti| z | ≤ 2

Concentrazione di OTA (µg/kg)

a) collaborano con il Laboratorio Comunitario di Riferimento nel loro ambito di competenza;

b) coordinano, nella loro sfera di competenza, le attività dei laboratori ufficiali responsabili dell’analisi dei campioni a norma dell’articolo 11;

c) se del caso, organizzano test comparativi tra i laboratori nazionali ufficiali e assicurano un adeguato follow-up dei test comparativi effettuati;

d) assicurano la trasmissione all'autorità competente e ai laboratori nazionali ufficiali delle informazioni fornite dai Laboratori Comunitari di Riferimento;

e) offrono assistenza scientifica e tecnica all'autorità competente per l'attuazione di piani di controllo coordinati adottati a norma dell’articolo 53;

f) hanno la responsabilità di effettuare altri compiti specifici previsti secondo la procedura di cui all’articolo 62, paragrafo 3, fatti salvi ulteriori compiti nazionali previsti.

PROGRAMMI COORDINATI

Raccomandati dalla Comunità Europea

Organizzati dal Ministero della Salute

ISS offre assistenza tecnica e scientifica:

• Metodi di campionamento• Metodi di analisi

Ministero della Salute stende un rapporto da inviare alla Commissione

Programma coordinato di ispezione nel settore dell’alimentazione animale per l’anno 2004 (2005), in conformitàdella direttiva 95/53/CE del Consiglio

Raccomandazione della Commissione del 17 febbraio 2004

2004/163/CE

Raccomandazione della Commissione del 2 marzo 2005

2005/187/CE

Raccomanda agli Stati membri:

di realizzare un programma coordinato di ispezione volto a controllare la concentrazione di micotossine* nei mangimi

indicando i metodi di analisi

Il metodo di campionamento dovrebbe comprendere sia un campionamento casuale, che un campionamento mirato

I campioni devono essere i mangimi sospettati di contenere concentrazioni più elevate di micotossine**

* aflatossina B1, ocratossina A, zearalenone, deossinivalenolo e fumonisine

** cereali, semi e frutti oleosi, mangimi immagazzinati per lungo periodo o trasportati via mare per lunghe distanze

Raccomandazione della Commissione del 10 marzo 2005

2005/175/CE

Programma coordinato di controllo ufficiale dei prodotti alimentari per l’anno 2005, in conformità della direttiva 89/397/CEE

Gli Stati membri dovrebbero procedere ad ispezioni e controlli e, laddove necessario, prelevare campioni e sottoporli ad analisi di laboratorio, allo scopo di:a)…d) Valutare la sicurezza di taluni alimenti destinati ai lattanti e ai bambini, per quanto concerne i tenori di nitrato e patulina.

Le autorità competenti…dovrebbero prelevare campioni rappresentativi

di alimenti contenenti carote, patate, ortaggi a foglia e prodotti derivati

dalle mele, soprattutto a livello di vendita al dettaglio senza trascurare

la produzione e l’importazione.

Per il controllo ufficiale…si raccomandano i metodi di campionamento

e analisi stabiliti dalla seguente legislazione comunitaria:

Direttiva 2002/63/CE

Direttiva 2003/78/CE

METODI DI ANALISI FUTURI

Multimicotossine (analisi quantitativa)

Biosensori (analisi quali/quantitativa)

PCR (caratterizzazione fungina)

Micro/Macro Array (caratterizzazione fungina)