Determinazione simultanea di aflatossine, ocratossina A e tossine di Fusarium in cereali

mediante purificazione su colonnine ad mediante purificazione su colonnine ad immunoaffinità multi anticorpo e LC-MS/MS

V.M.T. Lattanzio, M. Solfrizzo, S. Della Gatta, S. Powers, A. Visconti

Consiglio Nazionale delle Ricerche (CNR)Istituto di Scienze delle Produzioni Alimentari (ISPA), BARI

Mycotoxin Total Cereal products

Cocoa, coffee,

tea

Dietetic food and

food supplements

Feed for food-

producing animals

Fruit and vegetables

Herbs and

spices

Nuts, nut

products and

seeds

Other food

product/mixed

Pet food Wine

Aflatoxins 902 46 11 103 26 710 3 3

Deoxynivalenol 4 4

RASFF RASFF Report Report AnnualeAnnuale 20082008NumeroNumero didi NotificheNotifiche

Deoxynivalenol 4 4

Fumonisins 2 1 1

Ochratoxin A 20 3 6 2 5 3 1

Zearalenone 2 2

Patulin 3 1 2

EC regulations EC regulations 1881/2006 and 1126/2007::

Limiti massimi ammissibili di micotossineLimiti massimi ammissibili di micotossinein cerealiin cereali

DeossinivalenoloDeossinivalenolo 1750 µg/kg mais – frumento duro - avena1250 µg/kg altri cereali

AflatossineAflatossine 2 µg/kg AFB1, 4 µg/kg somma di B1, B2, G1, G2

SvulippoSvulippo e validazione e validazione di nuove metodiche analitiche di nuove metodiche analitiche

FumonisineFumonisine 4000 µg/kg mais

ZearalenoneZearalenone 350 µg/kg mais100 µg/kg altri cereali

OchratossinaOchratossina AA 5 µg/kg

TossineTossine TT--2 e HT2 e HT--2 2 In discussione

Analisi di singole classi di micotossineAnalisi di singole classi di micotossine

Differente natura chimica delle micotossine:- Polarita’- Assorbimento UV o in fluorescenza- Forma ionica (dipendente dal pH)

OCRATOSSINA A

NH

O

O

OH

Cl

O

CH3

C

OOH

ZEARALENONE

OH

O

O CH3

AFLATOSSINE

O O

O

O O

OH

DEOSSINIVALENOLO

O

OOH

CH3

CH2

CH3

OH

O

OH

TOSSINA T-2

O

O

H

OH

H

CH3H

Differenti concentrazioni target (da µg/kg a mg/kg)

Presenza in matrici diverse

Differenti strategie analitiche e di preparazione del campione

OH

O

H

OCOCH3CH3CH2

H3COCO

(H3C)2HCH2COCO

H

FUMONISINE

CH3CH3

CH3

OH

CH3NH2

OH

OH

OOH

OO OH

O

OOH

OO OH

O

LCLC--MS/MS => Analisi MultimicotossinaMS/MS => Analisi Multimicotossina

ðCo-extrazione di tutti gli analitið Purificazione delle differenti micotossine in un solo passaggioðRivelazione mediante una tecnica universale, con un ampio range di linearità

Punti chiave nello sviluppo di un metodo multi-micotossina:

ð Co-extrazione: acetonitrile/acqua/acido acetico 79:20:1ð Purificazione: analisi di estratti diluiti 1+1ðRivelazione: LC-ESI-MS/MS, API 4000 Qtrap

X

Determinazione simultanea di 39 micotossine Determinazione simultanea di 39 micotossine in estratti non purificati di frumento e maisin estratti non purificati di frumento e mais

ð Effetto Matrice (Aflatossine)ð Recuperi non accettabili (<60%) per alcune tossine (FumonisineFumonisine)

Sulyok M, Berthiller F, Krska R, Schuhmacher R. Development and validation of a liquid chromatography/tandem mass spectrometric method for the determination of 39 mycotoxins in wheat and maize. Rapid Commun Mass Spectrom.20(2006):2649-59

Sulyok M, Krska R, Schuhmacher R. A liquid chromatography/tandem mass spectrometric multi-mycotoxin method for the quantification of 87 analytes and its application to semi-quantitative screening of moldy food samples.Anal Bioanal Chem. 389(2007):1505-23.

ð Co-extrazione: acetonitrile/acqua 80:20metanolo/acqua 70:30 (fichi, uva passa)

ð Purificazione: analisi di estratti diluitið Rivelazione: LC-ESI-MS/MS (+)

X

Spanjer M, Rensen PM, Sholten JM. Food Addit. Contam. 25 (2008) 472-489

Determinazione simultanea di 33 micotossine in estratti non purificati di arachidi, pistacchi, frumento, mais, cornflakes, uva passa e fichi

ð Rivelazione: LC-ESI-MS/MS (+)X

ðRecuperi non accettabili per alcune micotossine:FB1 20% (RSDr 72%), FB2 46% (RSDr 8%) (slurry di mais)

ðEffetto Matrice Aflatossine fino a 53% soppressione ionicaTossine T2 e HT2 fino a 65% soppressione ionica (slurry di frumento)

ðBassa sensibilità per DON (ioni positivi)

UPLCUPLC--MS/MSMS/MSDeterminazioneDeterminazione simultaneasimultanea didi 17 17 micotossinemicotossine in in alimentialimenti e e mangimimangimi

ð Tempi di analisi ridottiðElevata sensibilità

(LOD <0.2 µg/kg)

ð Elevata risoluzione

Ren Y. et al. J. Chromatogr. A 1143 (2006) 48-64

ð Estrazione con acetonitrile/acqua 84:16

ESI (-) (1) NIV; (2) DON; (3) FX; (4) OTA; (5) 3-ADON; (6) 15-ADON; (10) ZON; (11) ZAN (IS)

ESI (+) (7) ATG2; (8) ATM1; (9) ATG1 (12) ATB2; (13) ATB1; (14) CTN; (15) HT-2; (16) T-2; (17) ZAN (IS); (18) SMC; (19) VCG.

ð2 corse cromatograficheESI(+) – ESI(-)Tempo totale < 10 min

acetonitrile/acqua 84:16ðSPE clean upFumonisine escluse!

ðCo-estrazione di tutti gli analitiAlte percentuali di metanolo o acetonitrile (> 75%)

Afs, OTA, ZEA, DON, T-2/HT-2Alte percentuali di acqua (50%) o basso pH

FumonisineðPreparazione del campione

PuntiPunti CriticiCritici nellonello svilupposviluppo didi un un metodometodo multimulti--micotossinamicotossina

Analisi di estratti diluitiPurificazione dell’estratto: SPE - IAC

(OASIS HLB: Sørensen et al. 2005, J. Chromatogr. B, 820:183

Lattanzio et al.2008, Food Addit. Contam. 25:320)

ðSeparazione cromatograficaðIonizzazione e riduzione dell’effetto matrice

Determinazione simultanea di aflatossine, ocratossina A,fumonisine, tricoteceni e zearalenone in cereali mediante LC-MS/MS

e purificazione su colonnine ad immunoaffinità

Lattanzio VMT, Solfrizzo M, Powers S, Visconti A Rapid Commun Mass Spectrom, 21 (2007) 3253-3261

2) Purificazione su colonnine ad immunoaffinità multi-anticorpo

1) Doppia Estrazione

Basata sull’uso di nuove colonnine ad immunoaffinità(VicamVicam,, MYCOMYCO66inin11TMTM) contenenti anticorpi peraflatossine, ocratossina A, fumonisine, deossinivalenolo,zearalenone, tossine T-2 e HT-2.

3) Rivelazione mediante LC-ESI-MS/MS

Campione (10 g)

Tampone fosfato (pH 7.4)50 mL, 60 min shaking

Aggiunta di Metanolo al pellet(metanolo/acqua ~ 70:30)

CentrifugazionePrelievo dell’estratto

Estratto Adeossinivalenolo,fumonisine,tossine (T-2) e HT-2

Preparazione del campione Preparazione del campione

Myco6in1TM

Clean up su colonnine a immunoaffinità

(metanolo/acqua ~ 70:30) 60 min shaking

CentrifugazionePrelievo dell’estratto

e diluizione Estratto Baflatossine, ocratossina, zearalenone

LC-ESI-MS/MS

Estratto A Estratto B

DESI

Q1 Q2 Q3

17.8 18.0 18.2 18.4 18.6 18.8 19.0 19.2 19.4 19.6 19.8Time, min

17.8 18.0 18.2 18.4 18.6 18.8 19.0 19.2 19.4 19.6 19.8Time, min

Ottimizzazione delle Condizioni MSOttimizzazione delle Condizioni MS

Selezione degli ioni precursori

[DON + CH3COO]- m/z 355.0 -

+

[DON + CH3COO]- m/z 355.0[AFG2 + H]+ m/z 331.1[AFG1 + H]+ m/z 329.1[AFB2 + H]+ m/z 315.0[AFB1 + H]+ m/z 313.2[HT2 + NH4]+ m/z 442.0[T2 + NH4]+ m/z 484.0[FB1 + H]+ m/z 722.0[FB2 + H]+ m/z 706.2[OTA + H]+ m/z 404.0[ZEA –H]- m/z 317.0

-

-

Polarity switching Buona Separazione Cromatografica

Fase Mobile:Metanolo/Acqua

0.5% acido acetico

1mM ammonio acetatoEluizione in Gradiente

FBs - OTA

T2-HT2-DON

x 3.0

(-) (+)(+) (-) (+)

DON

T-2

FB1

FB

ZEA100

Inte

nsity

, %

Cromatogramma (TIC) di un estratto di mais artificialmente contaminato con: 500 µg/kgDON; 2 µg/kg AFG2, AFB2; 6 µg/kg AFG1; 10 µg/kg AFB1; 500 µg/kg FB1; 250 µg/kg FB2;100 µg/kg HT-2, T-2, ZEA; 20 µg/kg OTA.

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55Time, min

AFG2

AFG1

AFB2

AFB1HT-2

T-2FB2

OTA

0

Inte

nsity

,

20% B

40% B

63% B

Colonna: Gemini RP18 (150 × 2.0 mm, 5 µm) PhenomenexFlusso: 200 µl/minColumn oven: 40 ºCSolv A: H2O, 0.5% acido acetico, 1mM AcNH4Solv B: CH3OH, 0.5% acido acetico, 1mM AcNH4Volume iniettato: 20µl (100 mg matrice)

Livelli difortificazione

(µg/Kg)

Recupero, % (RSDr, n=3) Criteri CEN di accettabilità(EU regulation N. 401/2006)

MAIS FRUMENTO ORZO

DONDON 100 – 2000 64 (4) 95 (0.6) 60 (9) 100-500 µg/Kg Recupero 60-110%, RSDr ≤ 20> 500µg/Kg Recupero 70-120%, RSDr ≤ 20

AFGAFG22 0.4 – 8 103 (3) 95 (5) 90 (13)< 1 µg/Kg Recupero 50-112%,1-10 µg/Kg Recupero 70-110%AFGAFG11 1.2 – 24 88 (2) 90 (3) 87 (6)

Validazione del metodo: RECUPERI e RIPETIBILITA’Validazione del metodo: RECUPERI e RIPETIBILITA’

1-10 µg/Kg Recupero 70-110%> 10 µg/Kg Recupero 80-110%RSDr = 0.66 RSDR

AFBAFB22 0.4 – 8 97 (3) 101 (0.7) 83 (6)

AFBAFB11 2 – 4 92 (5) 88 (4) 84 (6)

FBFB11 100 – 2000 83 (8) - - ≤ 500µg/Kg Recupero 60-120%, RSDr ≤ 30> 500µg/Kg Recupero70-110%, RSDr ≤ 20

FBFB22 50 – 1000 74 (6) - -

HTHT--2+T2+T--2 (*)2 (*) 40 – 800 76 (4) 79 (2) 86 (11) 100-200 µg/Kg Recupero 60-130%, RSDr ≤ 40> 200 µg/Kg Recupero 60-130%, RSDr ≤ 30

ZEAZEA 20 – 400 94 (4) 79 (1) 88 (9) ≤ 50 µg/Kg Recupero 60-120%, RSDr ≤ 40> 50 µg/Kg Recupero 70-120%, RSDr ≤ 25

OTAOTA 4 – 80 94 (7) 99 (0.6) 91 (9) 1-10 µg/Kg Recupero 70-110%, RSDr ≤ 20

(*) Durante l’estrazione in PBS si verifica l’drolisi della tossina T-2 in HT-2, le due tossine sono quindi quantificate come somma.

Limite di Rivelabilità(µg/Kg)

Limiti massimi ammissibiliEC regulations 1126/2007, 1881/2006

MAIS FRUMENTO ORZO

DONDON 5.8 5.1 2.4 1750 µg/kg mais – frumento duro - orzo1250 µg/kg altri cereali

AFGAFG22 0.5 0.6 0.1

2 µg/kg AFB1, AFGAFG11 0.4 0.2 0.1

Validazione del metodo: LIMITI di RIVELABILITA’ (S/N=3)Validazione del metodo: LIMITI di RIVELABILITA’ (S/N=3)

2 µg/kg AFB1, 4 µg/kg somma di B1, B2, G1, G2

AFGAFG11 0.4 0.2 0.1

AFBAFB22 0.1 0.4 0.1

AFBAFB11 0.3 0.2 0.2

FBFB11 0.5 - -4000 µg/kg somma di FB1 + FB2 in mais

FBFB22 1.4 - -

HTHT--2+T2+T--22 1.4 1.1 0.6 In discussione

ZEAZEA 0.7 1.2 0.8 350 µg/kg mais100 µg/kg altri cereali

OTAOTA 0.2 0.2 0.2 5 µg/kg

Cromatogramma (TIC) di un campione di MAIS naturalmente contaminato da5 µg/kg DON, 72 µg/kg FB1, 16 µg/kg FB2, 0.5 µg/kg ZEA e 0.3 µg/Kg OTA.

FB172 µg/kg

FB216 µg/kg

100

%

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55Time, min

x 5.0DON

5 µg/kg

ZEA0.5 µg/kg

OTA0.3 µg/kg

0

Inte

nsit

y, %

Cromatogramma (TIC) di un campione di FRUMENTO naturalmentecontaminato da 2.4 µg/kg DON, 55.2 µg/kg HT-2+T-2, 7.4 µg/kg ZEA e 1.6µg/kg OTA.

100 HT-2*55.2 µg/kg ZEA

7.4 µg/kg

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55Time, min

0

% DON2.4 µg/kg

OTA1.6 µg/kg

* Somma di T-2 + HT-2

Effetto matriceEffetto matrice

Fase mobile HPLC

Estratto di mais purificato su colonnine a immunoaffinità

Rette di calibrazione ottenute solubilizzando le tossine standard in

DONDON

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

1800000

2000000

25 50 75 100 125 150

injected ng

Valutazione della significatività della differenza di pendenzatra retta di calibrazione in fase mobile e in matrice

t-Test (p = 0.05, n = 6, t value = 2.4)

MAIS FRUMENTO ORZO

DONDON -0.3 0.3 -0.1

Soppressione ionica

No effetto matrice

AFBAFB11

0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0

injected ng

10000

20000

30000

40000

50000

60000

AFGAFG11 -6.2 2.2 2.0

AFBAFB11 -15.0 0.2 -0.4

FBFB11 0.3 - -

FBFB22 -1.6 - -

HTHT--22 -0.5 0.6 0.6

TT--22 -0.8 0.6 1.0

ZEAZEA -1.0 0.0 -6.8

OTAOTA -2.6 0.8 -0.6

MAIS Campione 1µg/kg

MAIS Campione 2µg/kg

Metodo utilizzato per l’analisidelle singole tossine

Multi tossina

Singolatossina

Multi tossina

Singolatossina

DONDON 121 122 30 22 MacDonald et al., 2005, J AOAC(IAC-HPLC/UV)

FBFB11 488 510 114 99 Sydenham et al, 1996, J. AOAC (SAX-HPLC/FD)

FBFB 144 138 42 29

CONFRONTO con METODICHE VALIDATECONFRONTO con METODICHE VALIDATE

FBFB22 144 138 42 29

HTHT--22 17 8 9 6.3Visconti et al, 2005, J. Chromatogr. A (IAC-HPLC/FD)

TT--22 - 6 - 5.9

ZEAZEA 95 80 132 142MacDonald et al., 2005, J AOAC(IAC-HPLC/FD)

AFsAFs nd nd nd ndTrucksess et al., 1991, JAOAC(IAC-HPLC/FD)

OTAOTA nd na nd na

ü E’ stato sviluppato un metodo sensibile, accurato e preciso per la determinazionesimultanea di aflatossine (B1, B2, G1, G2), fumonisine (B1, B2), ocratossina A, tricoteceni(DON, HT-2, T-2) e zeralenone in cereali, mediante LC-ESI-MS/MS.

ü La co-estrazione quantitativa di tutte le 11 micotossine è stata ottenuta mediante dueestrazioni sequenziali con PBS e metanolo/acqua (70:30).

ü Per la purificazione degli estratti sono state testate nuove colonnine a immunoaffinitàmulti-anticorpo:

CONCLUSIONICONCLUSIONI

- La purificazione su colonnine a immunoaffinità riduce l’effetto matrice o lo elimina del tutto.- La calibrazione in matrice o l’utilizzo di standard marcati con isotopo 13C12 rimangono necessari per unadeterminazione quantitatica accurata.- La purificazione e pre-concentrazione del campione consentono di ottenere sensibilità elevata anchecon strumentazione di medio costo.

üAccuratezza e ripetibilità conformi ai criteri stabiliti dal CEN (Regolamento EC No 401/2006)

üBuon accordo tra i risultati ottenuti con il metodo proposto e quelli ottenuti con metodivalidati per l’analisi di singole tossine.