3° Congresso Nazionale Le micotossine nella filiera agro-alimentare e zootecnica

Come utilizzare i risultati ottenuti nei progetti di ricerca nazionali e valutazione

delle prospettive future delle prospettive future

Carlo BreraIstituto Superiore di Sanità

Dipartimento di Sanità Pubblica Veterinaria e Sicurezza AlimentareReparto OGM e Micotossine

ISS, Roma 28-30 settembre 2009

Controllo Ufficiale

Valutazione del rischio(monitoraggioUfficiale

AUTOCONTROLLO

(monitoraggioesposizione)

Innovazione tecnologica

MetodiMetodi didi analisianalisi• Disponibilità di metodi

• Disponibilità di quali metodi (ufficiali, riferimento, accreditati, validati e da chi?, di screening, rapidi, di

conferma)• Finalità del metodo (necessità di utilizzare metodi • Finalità del metodo (necessità di utilizzare metodi armonizzati per lo svolgimento di progetti che

prevedono studi di moitoraggio)• Campo di applicazione (per quali matrici e quali

micotossine?)

• Un progetto di ricerca deve essere finalizzato a colmare le lacune conoscitive esistenti. E’ sempre così?

• Affinchè la prima condizione sia rispettata è necessario che sia noto lo stato dell’arte. E’ sempre così?

• Sono ricorrenti sovrapposizioni nelle linee progettuali? • Il partnership dovrebbe essere scelto in modo rappresentativo e conseguente al ruolo che ciascun partner possiede in ambito nazionale

Alcune riflessioni

conseguente al ruolo che ciascun partner possiede in ambito nazionale

• competenza• missione• funzione

• multidisciplinarietà

• Che ruolo hanno i valutatori? Determinante

Dai progetti di ricerca passati a quelli in corso….

Sistemi integrati nanostrutturati

PROTEINA Chip Micro-MacroArrayMULTISCREENING

Dosaggio immunologicoa Polarizzazione in

Fluorescenza

Mediatori sintetici (MIP)"lock and key" model

NIR

Naso

Librerie peptidiche combinatoriali in fase solida

Genomica funzionale/Proteomica

Piastre elettrochimiche multicanaleImmunosensori

Elettrodi usa e getta (screen printedelectrodes) – in situ

nanostrutturatiPurificazione e separazione

delle micotossine

Naso elettronico

UPLC/MS/MSMultimicotossina

Come Come utilizzareutilizzare ii risultatirisultati ottenutiottenuti neinei PdRPdR

§ Raccolta dei metodi di analisi (da parte di chi?)

§ Armonizzazione dei metodi di analisi

§ Identificazione dei parametri di efficienza dei metodi

§ Differenziazione dei metodi di screening, rapidi e di conferma§ Differenziazione dei metodi di screening, rapidi e di conferma

§ Ufficializzazione dei metodi di analisi (Commissioni di analisi, Autorita’ competente, Ente di normalizzazione (CEN e/o UNI)

Prospettive future da inserire nei PdRProspettive future da inserire nei PdR

• Metodi multimicotossina• Metodi multimatrice

• Metodi di analisi per la determinazione dei metaboliti delle micotossine (valutazione del rischio)

• Metodi di analisi per la rivelazione delle micotossine • Metodi di analisi per la rivelazione delle micotossine emergenti

• Parametri di efficienza dei Metodi di screening e rapidi• Mettere a punto i kit diagnostici di screening e rapidi

per matrice

……..ed un progetto sul campionamento?

Progetto Micosafe�- Nuove metodologie per la lotta alle micotossine nel comparto agro-zootecnico (Progetto finanziato sui fondi della Legge regionale sull'innovazione n. 26/05, art. 17)

Il Reg.CE 856/2005 del 6/6/05, che entrerà in vigore a partire da ottobre 2007, ha ridotto i tenori max ammissibili per alcuni contaminanti, quali le Fusarium-tossine, presenti nei prodotti alimentari. Il FVG dovrà adeguarsi a tali limiti e per fare ciò sarebbe utile avere un'idea chiara sulla sit. attuale nel territorio reg. ed avere a disposizione un metodo analitico rapido e poco costoso applicabile sul prodotto già immediatamente il raccolto. Il Prg si propone di testare una serie di metodiche analitiche innovative per quantificare e monitorare la presenza di varie micotossine (in serie di metodiche analitiche innovative per quantificare e monitorare la presenza di varie micotossine (in particolare Fusarium-tossine) nei prodotti cerealicoli ed in quelli di origine animale (latte), di valutare la situazione regionale attraverso un ampio e costante campionamento dei prodotti agricoli nelle varie fasi della filiera ed infine di stabilire delle linee guida per la prevenzione e la lotta alla contaminazione da micotossine, sia relativamente alle pratiche colturali che alla gestione degli allevamenti

Ente Titolare Ricerca: Università di UdineResponsabile: Dr Bruno StefanonFinanziatore: Regione F.V.G.

Aflatossine – Fumonisine - Zearalenone

Triennale – LC/MS – Microarray - Proteomica -Genomica funzionale

Antonio Lauriola Ausl ModenaMorena Piumi

Luciana Prete Ausl Città di BolognaAusl Città di BolognaAusl Città di BolognaAusl Città di Bologna

Paola Silingardi Arpa Emilia-RomagnaCecilia Bergamini

Aspetti innovativi di metodi diagnostici sulle micotossine:

- Sintesi di mediatori sintetici (MIP)

- Individuazione di mediatori biologici (anticorpi, enzimi) dainserire in tecnologie innovative (biosensori)inserire in tecnologie innovative (biosensori)

- Metodi basati sul dosaggio immunologico a Polarizzazione in Fluorescenza

- Fluorescence Polarization Immunoassay (FPIA)

Il progetto ha ideato progettato e realizzato originariamente sistemi diagnostici del tipo Proteina Array quantitativi in grado di determinare la presenza e la concentrazione di micotossine in matrici

alimentari. Le micotossine verso le quali è stato sviluppato il sistema sono Aflatossina M1, Aflatossine B/G Totali (B1, B2, G1, G2), Ocratossina A, Fumonisina B1, Zearalenone, Tossine T2 ed HT2, Deossinivalenolo (DON/Vomitossina). Il sistema diagnostico è basato su un microchip array di tipo competitivo fissato su un supporto funzionalizzato (slide) di vetro su cui gli anticorpi specifici antitossina sono legati covalentemente mentre la rivelazione fluorimetrica è ottenuta grazie alla antitossina sono legati covalentemente mentre la rivelazione fluorimetrica è ottenuta grazie alla

funzionalizzazione con coloranti reattivi alle lunghezze d’onda laser tipo ATTO 647.Il sistema ha dimostrato di rispondere ottimamente in termini di linearità di risposta, sensibilità ed accuratezza sfruttando soprattutto la molteplicità di rivelazione posizionale propria dei sistemi array.

Il progetto Me.Di.T.A. nasce dall'esigenza delle industrie alimentari e degli operatori del settore di possedere tecnologie diagnostiche funzionali ed accessibili, di poter utilizzare trattamenti di sanificazione moderni efficienti e a basso impatto ambientale degli impianti e dei materiali a contatto con gli alimenti e di poter qualificare internamente e per scopi di marketing i prodotti alimentari per le loro caratteristiche intrinseche.

Obiettivo Realizzativo 2

OR2 - MMA - Metodi analitici su Micotossine con tecnica Chip Array e loro evoluzioni

A2.1Analisi preliminari per lo sviluppo di una metodica analitica

multiscreening, PROTEINA Chip Micro-MacroArray per l'identificazione delle micotossine in matrici alimentari.

I partner coinvolti in tali attivitàsono l'ISS, l'ENEA, NEOTRON, CO.DA.P, ORTOMAD e le società consulenti di NEOTRON

RIdelle micotossine in matrici alimentari.

A2.2Sviluppo di un sistema analitico multiscreening Proteina Micro-MacroArray in grado di identificare e di quantificare la presenza di

micotossine negli alimenti.

SP B2.1Validazione dei protocolli di produzione e dell'efficacia dei test

PROTEINA Chip Array nella diagnostica di routine.

Sviluppo di metodi rapidi per la determinazione di micotossine, allergeni e organismi geneticamente modificati nei prodotti alimentari

Referente Prof. Adriano MaroccoUniversità Cattolica del Sacro Cuore - Istituto di Agronomia generale e Coltivazioni erbacee

Filoni di ricerca in corso o da sviluppare

Applicazione delle tecnologia NIR per la determinazione di micotossineApplicazione delle tecnologia NIR per la determinazione di micotossineSi stanno mettendo a punto metodi rapidi e poco costosi per rilevare la presenza di micotossine nella granella e nella farina del mais. La calibrazione è fatta impiegando campioni opportunamente infettati da ceppi fungini tossigeni e caratterizzati mediante analisi micologiche e la deterimanzione delle tossine con HPLC. Fino ad ora la procedura è stata applicata al mais infettato con Fusarium verticillioides ed Aspergillus flavus.

Descrizione dell’Attività L’attività si fonda sull’allestimento di analisi in HPLC per il monitoraggio dellaconcentrazione di Ocratossina A nei campioni avendo cura di ripetere laprova su un numero minimo di mulini pari a 10. Prevedendo per ciascunmulino il prelievo di due campioni per ogni prodotto di molitura si prevede unnumero totale di campioni pari a 20 per matrice. In alternativa, si può afferiread un’unica azienda nella quale ripetere almeno 10 volte lo stessocampionamento.campionamento.Il metodo prevede l’estrazione con solvente organico, un clean up concolonnine di immunoaffinità IAC, analisi strumentale con cromatografia liquidaad alta prestazione HPLC e rivelazione fluorimetrica.Risultati attesiNuove informazioni sull’effetto dei processi di pulitura e molitura industrialenella distribuzione della tossina (concentrazione, diluizione) nei vari prodotti dimolitura

Nuove informazioni sulla ripartizione dell’ocratossina A negli scarti e sfarinatiottenuti in seguito ai processi di pulitura e macinazione industriale del granoduro.

PROGETTI DI “RICERCA CORRENTE 2008”

Obiettivi:Gli obiettivi che saranno perseguiti saranno relativi ai seguenti punti:

a)ottenere una campionatura di alimenti destinati alla zootecnia che sia rappresentativa dello stato di contaminazione da

Area tematica: SICUREZZA ALIMENTARE

Titolo del progetto:

Metodi innovativi per l’analisi multi-classe e multi-residuo di contaminanti ambientali e fitofarmaci in alimenti di origine animale e vegetale mediante spettrometria di massa con

rivelatore ibrido

Responsabile Scientifico: Dr. Luigi Serpe

a)ottenere una campionatura di alimenti destinati alla zootecnia che sia rappresentativa dello stato di contaminazione damicotossine. Tale informazione contribuirà a fornire nel modo più esaustivo possibile un quadro dello stato dicontaminazione da micotossine, da presentare alla Commissione Europea per poter individuare i limiti massimi tollerabilida fissare in un immediato futuro.b)disporre di un metodo di analisi multimicotossina per poter valutare la presenza contemporanea di più micotossine nello stesso campione. Questo strumento diagnostico potrà essere utilizzato in modo innovativo sia nelle attività di controllo ufficiale, sia nelle attività di autocontrollo. Inoltre, dalla informazione che si potrà ricavare sarà possibile fornire una base conoscitiva su cui sviluppare uno studio per valutare l’effetto tossico sinergico sugli animali derivante dalla compresenza di micotossine differenti. Le micotossine di interesse saranno: AFS-OTA-FBS-ZEA-T2 e HT2. Il metodo èper UPLC/MS/MS. c)ottenere una mappatura del rischio derivante dalla presenza delle micotossine negli alimenti zootecnici presi in considerazione per orientare la destinazione d’uso dei mangimi verso specie animali dotate di suscettibilità differenti.

- Progetto MICORID (MIPAAF)Tematica e filiere: Micotossine e filiere zootecnicheTitolo: Indagine sulla contaminazione da micotossine degli alimenti zootecniciCoordinatore del progetto: Prof. Gianfranco PIVA

11.4 Obiettivi generali e specifici (intermedi e finali)Nella Raccomandazione 2006/576/CE, relativa alla presenza di micotossine in prodotti destinati all’alimentazione degli animali, si afferma che:

1 - Gli stati membri, con la partecipazione attiva degli operatori del settore dei mangimi, dovranno potenziare ilcontrollo della presenza di deossinivalenolo, zearalenone, ocratossina A e fumonisine B1 e B2, tossine T-2 e HT-2 nei cereali e neiprodotti a base di cereali destinati all’alimentazione degli animali e nei mangimi composti.2 - Gli stati membri dovranno garantire l’analisi simultanea dei campioni per accertare la presenza dideossinivalenolo, zearalenone, ocratossina A, fumonisine B1 e B2 e tossine T-2 e HT-2, per poter valutare il grado di occorrenzaconcomitante.3 - Gli stati membri dovranno prestare particolare attenzione alla presenza di tali micotossine nei sottoprodotti o nei prodottisecondari del settore alimentare destinati all’alimentazione degli animali.

Nella medesima Raccomandazione sono proposti dei valori di riferimento per le micotossine considerate nei prodotti destinatiall’alimentazione animale.L’obiettivo generale del progetto é quello di delineare un quadro completo della contaminazione da micotossine degli alimenti per animali.In particolare:a) evidenziare la contaminazione da micotossine di mangimi completi, materie prime e sottoprodotti, sia di produzione nazionale chedi importazione;b) per la coltura del mais, avere una migliore conoscenza dei parametri agronomici e dei trattamenti da effettuare in campo chepossono ridurre la contaminazione da micotossine;c) sulla base delle informazioni raccolte (condizioni meteorologiche e agronomiche), costruire dei modelli previsionali dellacontaminazione da micotossine del mais.

Obiettivo del Programma di RicercaL'obiettivo del programma di ricerca è triplice: a) sviluppare metodi analitici rapidi, sensibili e affidabili, mediante approcci integrati basati sulle competenze specifiche sviluppate nel tempo dalle varie UO, e fondati principalmente sull'uso di materiali nanostrutturati; b)

sviluppare metodi analitici di riferimento, più complessi, ad elevata produttività e affidabilità, per l'analisi multianalita delle sostanze indicate, sfruttando anche in questo caso i vantaggi offerti dalla possibilità di impiegare sistemi e materiali nanostrutturati; c) effettuare un'estesa indagine su vari prodotti alimentari, in particolare alimenti per l'infanzia, cereali, latte, frutta

secca in guscio.

PRIN 2007 - Strumentazione analitica integrata per analisi rapide e decentrate (POCT: Point-Of-Care Testing) per il controllo della salute in situazioni critiche. Coordinatore scientifico: Prof. Aldo RodaUniversità degli Studi di TORINO - CHIMICA ANALITICA - Responsabile dell'Unità di ricerca Prof. Gianfranco Giraudi

secca in guscio.Risultati attesi: Saranno sviluppati metodi immunochimici non competitivi a flusso ultrasensibili. Sarà esaminata anche la possibilità di

effettuare saggi mediante la tecnica ACE (affinity capillary electrophoresis) con rivelazione mediante fluorescenza laser indotta (LIF), anche con l'uso di peptidi supportati su nanosfere polimeriche o su dendrimeri.

Si svilupperanno metodi multianalita basandosi sul formato micropiastre "multititer" e sistemi microarray, e su fasi solide nanostrutturate per la determinazione mediante un sistema dinamico di separazione in flusso.

Saranno utilizzate nuove tecnologie basate sulla misura elettrochimica diretta e sulla realizzazione di immunosensori elettrochimici monouso (modificati usando nanotubi di carbonio, nanoparticelle metalliche e nanotubuli polimerici).

Metodi di confermaSaranno anche sviluppati metodi di conferma basati su LC-MS/MS per il dosaggio delle micotossine in matrici vegetali, latte e formaggio. Per questo scopo, saranno sviluppate tecniche separative ad elevatissima efficienza, come la micro e nano-LC, accoppiate con la "nano electrospray", preparando colonne monolitiche. Saranno anche sviluppati metodi LC-MS-MS per l'analisi di molecole di tipo steroideo estratte con metodi di affinità da matrici

alimentari.

Metodo di analisi Micotossina Progetto RESPONSABILEa. Librerie peptidichecombinatoriali in fase solida

b. ELISA

Aflatossine, OTA, Zearalenone, Aflatossina M1

PRIN 2003/5/2006/2007/2008

Prof. G. GIRAUDI -UNITO

Ocratossina, Aflatossine, Aflatossina M1

c. Sistemi artificiali per il riconoscimento selettivo mediante stampo molecolare

OTA

stampo molecolare

d. LFIA competitivo e non competitivo(> sensibilità)

OTA, AFTot, Fumonisinequali/quantitativo

Programma di ricercaMetodi analitici integrati basati su sistemi nanostrutturati a tutela della qualità e sicurezza degli alimenti

Università degli Studi di ROMA "La Sapienza" - CHIMICA - ROMAAntonio DI CORCIA

Lo scopo di questo progetto è preparare un metodo LC-MS/MS rapido e robusto in grado di determinare l'AFM1 presente nel latte in concentrazioni inferiori al limite di legge attuale di 50 ppt. Per questo scopo, saranno sviluppate tecniche separative ad elevatissima efficienza, anche multidimensionali e miniaturizzate. Queste ultime si caratterizzano essenzialmente per il consumo minimo di reagenti e di campione che si traduce sia in un limitato impatto ambientale sia in costi ridotti. La possibilità di analizzare piccolissime quantità di campione rende queste tecniche particolarmente idonee ad applicazioni in settori d'attività, dove spesso la disponibilità di campione è molto limitata. In questi specifici campi d'applicazione la micro e nano-LC stanno diventando metodologie analitiche d'elezione in continuo sviluppo tecnologico. In LC le colonne classiche (4.6 mm di diametro interno e 10-25 cm di lunghezza) e quelle "microbore" (2-0.5 mm) sono ora affiancate da colonne capillari con diametro interno da 0.3 fino a 0.075 mm. Tali sistemi separativi, in particolare quelli per nano-LC, comportano una serie di svantaggi che dipendono dalla necessità di ridurre al

Attualmente non esiste unmetodo di conferma perl'AFM1 nel latte basato su LC-MS/MS. La molecoladell'AFM1, pur essendostrutturalmente molto similealle altre aflatossine, fornisceun'efficienza di ionizzazionepiù bassa. Nelle miglioricondizioni l'AFM1 risponde, aparità di concentrazione, 3volte meno della B1 e 5 voltemeno della G1.

particolare quelli per nano-LC, comportano una serie di svantaggi che dipendono dalla necessità di ridurre al minimo i volumi morti interni ed esterni e dalle elevate pressioni di lavoro della colonna. Si procederà pertanto alla produzione di colonne monolitiche per applicazioni in micro e nano-LC, allo scopo di superare in gran parte i problemi e gli svantaggi sopra elencati. Le colonne monolitiche possono essere prodotte sia da materiale a base silicea, principalmente con tecnologia "sol-gel"; sia con polimeri rigidi organici a base di acrilamide, metacrilato o stirene. La porosità che le caratterizza consente velocità di flusso più elevate di quelle utilizzabili con le colonne per nano-LC, permettendo quindi di ridurre notevolmente i tempi d'analisi ed ottenere condizioni più favorevoli per l'accoppiamento con sistemi MS. Tale tipo di colonne offre inoltre numerosi vantaggi tra cui la relativa semplicità della preparazione, spesso caratterizzata da un unico processo "in situ", e la possibilità di variare la porosità, la selettività, l'area superficiale ed il grado di funzionalizzazione del supporto.

Anno 2006:Messa a punto di un metodo innovativo per la determinazione delle aflatossine B1, B2, G1, G2nei prodotti alimentari mediante HPLC con derivatizzazione fotochimica.

IZS PB 005/06 RC - Responsabile Dott.ssa M. MuscarellaAnno 2007:

Ottimizzazione e validazione di un metodo analitico mediante HPLC e rivelazione fluorimetrica con derivatizzazione post-colonna per la determinazione di

fumonisine FB1 e FB2 nei cereali: confronto con il metodo immunoenzimatico e fumonisine FB1 e FB2 nei cereali: confronto con il metodo immunoenzimatico e monitoraggio su campioni reali. IZS PB 004/07 RC –

Responsabile Dott.ssa M. MuscarellaAnno 2008:

Ottimizzazione di un metodo analitico di conferma mediante HPLC e rivelazione fluorimetrica con derivatizzazione post-colonna per la determinazione di Deossinivalenolo (DON) e Nivalenolo (NIV) nei cereali. IZS PB 003/08 RC –

Responsabile Dott.ssa M. Muscarella

Progetto AFLARIDCoordinatore: Prof. Gianfranco Piva

UO Università di Tor Vergata – Prof. Giuseppe Palleschi

La metodica è basata sull’uso di un sistema elettrochimico multicanale, costituito dauna piastra ELISA di tipo competitivo indiretto monouso da 96 pozzetti sul cui fondo

sono localizzati elettrodi screenprinted.sono localizzati elettrodi screenprinted.L’attività della fosfatasi alcalina, utilizzato come enzima marcatore, è stata misurata

elettrochimicamente mediante amperometria ad impulsi intermittenti.Una prima fase di studio del saggio (eseguita in tampone) ha consentito

l’ottimizzazione delle concentrazioni dei bioreagenti e dei tempi di incubazione; il LOD del saggio è risultato essere pari a 0.2 ng/mL, con una sensibilità di 1.0 ng/mL e

un tempo totale di analisi di circa 30 min.