CROMATOGRAFIA

Con il termine cromatografia si intende una serie di tecniche diseparazione che consentono la differenziazione di componenti di unamiscela complessa. Tale processo di separazione si realizzaattraverso la diversa distribuzione dei componenti tra due fasi in intimocontatto:- una fase fissa o STAZIONARIA (che può essere un solido o un

liquido opportunamente supportato su materiale solido), e- una fase MOBILE (costituita da un liquido o un gas che fluisce in

modo continuo attraverso la fase stazionaria).

I processi di separazione cromatografica si basano sull’effettocombinato ed opposto di forze differenziali di interazione fra i diversianaliti con la fase stazionaria (forze di resistenza alla migrazione) econ la fase mobile (forze motrici, dinamiche, di trascinamento e dimigrazione nella direzione di scorrimento della fase mobile)Ne consegue che gli analiti migrano con una velocità relativa che èfunzione della capacità della fase mobile di competere con la forza diritenzione della fase stazionaria.

A seconda dello stato fisico e della natura delle due fasi, il principio sucui si basa la separazione è diverso è dà luogo a diversi tipi dicromatografia.

Fase stazionaria solida

Fase mobile: liquido

Cromatografia liquido-solido

Adsorbimento su colonna

Adsorbimento su strato sottile

Scambio ionico

Esclusione

HPLC

Fase mobile: gas

Cromatografia gas-solido

Gascromatografia gas-solido

Fase stazionaria liquida

Fase mobile: liquido

Cromatografia liquido-liquido

Ripartizione su colonna

Ripartizione su carta

Ripartizione su strato sottile

HPLC

Fase mobile: gas

Cromatografia gas-liquido

Gascromatografia gas-liquido

I principali meccanismi di separazione si basano su processi di: ADSORBIMENTO RIPARTIZIONE SCAMBIO IONICO ESCLUSIONE AFFINITA’

LA CROMATOGRAFIA DI ADSORBIMENTO

Sulla superficie del solido che funge da fase stazionaria si trovano deisiti attivi in grado di stabilire una serie di legami secondari (dipolo-dipolo, legami idrogeno, dipolo-dipolo indotto ecc.) con le diversemolecole della miscela.La separazione si basa sulla diversa struttura chimica.

Fase mobile liquida = cromatografia liquido-solido (LSC)Fase mobile gas = cromatografia gas-solido (GSC)

La fase stazionaria solida è costituita da materiale adsorbente, le cuicaratteristiche di granulometria, volume dei pori, superficie specificadei pori giocano un ruolo fondamentale nell’efficienza di separazione.

Caratteristiche importanti della fase stazionaria: Non deve adsorbire in maniera irreversibile il soluto né reagire con

esso o catalizzare reazioni di decomposizione. Deve essere insolubile nella fase mobile (eluente) Deve consentire una ragionevole velocità di eluizione. Il suo potere adsorbente deve essere riproducibile e controllabile.

I materiali adsorbenti vengono suddivisi in:a) adsorbenti forti: gel di silice, allumina, carbone attivob) adsorbenti medi: terre di diatomee, calcio carbonato, magnesiocarbonato, magnesio fosfatoc) adsorbenti deboli: cellulosa, saccarosio, amido, talco

Allumina (Al2O3) e gel di silice sono tra i materiali adsorbenti piùutilizzati.Il gel di silice si ottiene per polimerizzazione dell’acido silicico (coneliminazione di acqua), che porta alla formazione di granuli porosisulla cui superficie sono presenti i siti attivi Si-OH.

Per entrambi i materiali il potere adsorbente dipende molto dallaquantità di acqua libera che blocca i siti attivi presenti alla superficie.Poiché l’adsorbimento è un fenomeno superficiale è importante che lafase stazionaria abbia:

Un’elevata estensione superficiale che favorisca il rapidoinstaurarsi dell’equilibrio tra la fase stazionaria e quella mobile;

Particelle con granulometria uniforme al fine di rendere piùefficaci i fenomeni di adsorbimento.

La granulometria è espressa in termini di intervalli di mesh, unità cherappresenta il numero di fori per pollice lineare di un setaccio.Una granulometria compresa tra 70 e 230 mesh indica che i granulipossono attraversare completamente un setaccio da 70 mesh (70 foriper pollice lineare) e sono completamente trattenuti da un setaccio da230 mesh. Più stretto è l’intervallo di mesh, più efficace è laseparazione.

La cromatografia di adsorbimento viene prevalentemente utilizzata perla separazione di sostanze organiche, le quali vengono trattenute inmodo differenziato dalla fase stazionaria, sulla base della forza dellegame che instaurano con i siti attivi.

Utilizzando una fase stazionaria polare (allumina, gel di silice) lesostanze fortemente polari (molecole aventi gruppi –OH, -COOH, -NH2 ecc.) sono quelle maggiormente trattenute in quanto sono ingrado di stabilire una forte interazione con la fase stazionaria,mediante, prevalentemente, legami a idrogeno.Sostanze apolari, invece, interagiscono poco o nulla con la fasestazionaria polare e pertanto vengono rapidamente eluite.

Allumina

o

Gel di Silice

ORDINE DI ELUIZIONE:

acidi e basi

alcoli e mercaptani

aldeidi e chetoni

esteri e alogenuri

idrocarburi aromatici

alcheni e alchini

alcani

La forza con cui una sostanza è adsorbita dipende quindi dalla natura dei suoi gruppi funzionali. Poiché il materiale di cui è costituito l’adsorbente è relativamente polare, quanto più è polare il gruppo funzionale, tanto maggiore è la forza con cui la sostanza viene adsorbita. L’affinità delle varie classi di composti organici nei confronti di fasi stazionarie adsorbenti varia secondo il seguente ordine approssimativo: idrocarburi saturi < alchini, alcheni, idrocarburi aromatici < eteri < esteri, chetoni, aldeidi < ammine, tioli, alcoli < fenoli, acidi carbossilici. Sostanze poco polari sono poco trattenute e migrano più rapidamente sotto l’azione della fase mobile e quindi sono eluite per prime. La forza dell’adsorbimento dipende anche dalle caratteristiche stereochimiche e dalla geometria della molecola, per cui composti strutturalmente simili (stereoisomeri) possono presentare comportamenti cromatografici differenti.

Fase Mobile: Numerosi sono i solventi che possono essere utilizzaticome fase mobile. In genere il potere eluente di un solvente varia infunzione della polarità, del tipo di adsorbente usato, della natura dellesostanze da separare e della temperatura.

Non è possibile effettuare una rigorosa classificazione dei solventi infunzione del potere eluente, tuttavia si può definire un ordine generaledetto serie eluotropica.

Nella serie eluotropica di Trappe i solventi sono elencati secondo unpotere eluente crescente:

etere di petrolio < cicloesano < tetracloruro di carbonio < toluene< cloruro di metilene < cloroformio < etere etilico < acetato di etile< acetone < propanolo < etanolo < metanolo < acqua < acidoacetico

E’ possibile utilizzare tali solventi in miscele di varia composizione, cosìda realizzare fasi mobili con potere eluente variabile

Classiche miscele utilizzate:

etere di petrolio/acetato di etile (in proporzioni variabili) per sostanzeapolari

cicloesano/acetato di etile (in proporzioni variabili) per sostanzeapolari

diclorometano/metanolo (in proporzioni variabili) per sostanze polari

esempio:etere di petrolio/acetato di etile 8:2

Le caratteristiche che un eluente deve possedere per essere utilizzatoin una separazione cromatografica sono:

Non deve reagire né con l’adsorbente, né con i prodotti daseparare;

Non deve solubilizzare l’adsorbente; Deve far migrare i componenti della miscela da separare; Deve avere un basso punto di ebollizione per permettere un

facile recupero dei soluti; Non deve essere tossico, né molto costoso.

In una separazione cromatografica la scelta del solvente è effettuatasu basi empiriche con vari tentativi; le prove preliminari sonoeffettuate mediante TLC.

Le fasi essenziali di un processo cromatografica sono tre:

Caricamento del campione o della miscela da analizzare in unazona ristretta della fase stazionaria;

Eluizione della miscela dalla fase stazionaria per effettuare laseparazione attraverso una opportuna scelta della fase mobile odi altri parametri;

Rivelazione dei composti separati.

Dal punto di vista pratico-costruttivo, la cromatografia può essereeffettuata su:-COLONNA-CARTA-STRATO SOTTILE

CROMATOGRAFIA SU COLONNA (CC):

La fase stazionaria è contenuta all’interno di un tubo di vetro o dimetallo (colonna). La fase mobile liquida può essere eluita per cadutalibera (per gravità) o sotto pressione. Se la fase mobile è gassosa,viene eluita sotto pressione.

CROMATOGRAFIA SU CARTA (PC):

La fase stazionaria è costituita dall’acqua legata alla cellulosa chefunge da supporto solido (si tratta quindi di una cromatografia liquido-liquido). La fase mobile liquida può eluire in senso verticale salendoper capillarità dal basso verso l’alto (PC ascendente) o scendendo pergravità dall’alto verso il basso (PC discendente) oppure può eluire sulpiano in senso circolare (PC radiale).

CROMATOGRAFIA SU STRATO SOTTILE (TLC):

La fase stazionaria viene stratificata su lastra di vetro, metallo oplastica. La fase mobile liquida può eluire in senso verticale percapillarità verso l’alto (TLC ascendente) o sul piano in senso circolare(TLC radiale).

La fase stazionaria è costituita da un sottile strato di adsorbente, cheviene spesso mescolato con un legante come gesso o amido e consostanze fluorescenti che fungono da rivelatori. L’adsorbente vienefatto aderire su una lastra di vetro, alluminio o poliestere.Il campione viene caricato su un punto e viene eluito dalla fase mobileche sale lungo la lastra cromatografica per capillarità.La TLC permette di analizzare piccole quantità di prodotto (1-3 mg in0.5 ml di solvente) e rappresenta uno dei metodi analitici più semplici ediffusi in chimica organica.

La TLC è utilizzata per: seguire l’andamento di una reazione (scomparsa dei

reagenti e/o comparsa dei prodotti); per la ricerca dell’eluente da utilizzare in una separazione

cromatografica su colonna; per seguire l’andamento di una separazione

cromatografica su colonna; per il controllo della purezza di un composto; per il riconoscimento di prodotti incogniti.

ESECUZIONE DI UNA TLC -Deposizione del campione (semina) mediante un capillare di vetro. a circa 5-6 mm dal fondo (utilizzare solo la MATITA e non la PENNA!) Attenzione a non allargare troppo la zona di caricamento. -La lastra viene quindi posta in una camera di sviluppo (contenitore in cui è presente la fase mobile), facendo attenzione che la zona di caricamento sia sempre al di sopra del livello dell’eluente.

Durante l’eluizione i vari componenti della miscela migrano con velocità diverse, aseconda della diversa affinità nei confronti della fase stazionaria e dell’eluente, e siseparano lungo il percorso del solvente.

Quando il fronte del solvente è arrivato a pochi mm dalla sommità della lastra, siestrae la lastra dalla camera, si segna la posizione del fronte del solvente, si asciuga esi evidenziano i vari componenti separati durante il processo cromatografico.

Il fattore Rf è dato dal rapporto tra la distanza percorsa dalla sostanza(A) e quella percorsa dal solvente (S).

Il valore di Rf è compreso tra 0 (il composto non è migrato, ed è statocompletamente trattenuto dall’adsorbente) e 1 (il composto non ètrattenuto e migra con il fronte dell’eluente) e si calcola fino allaseconda cifra decimale.In teoria Rf è costante per ogni sistema cromatografico ed è unacaratteristica di ogni sostanza esaminata. Potrebbe quindi essereusato per l’identificazione di una sostanza incognita.

Rf dipende da diversi fattori sperimentali (dimensioni delle particelle di fase stazionaria, grado di saturazione della camera, composizione dell’eluente) e può variare leggermente da un’analisi ad un’altra. Perciò può essere opportuno, per identificare un composto, confrontarlo con un campione di riferimento, caricando su un’unica lastra il campione di riferimento, il composto da identificare e una miscela dei due. Il perfetto allineamento delle tre macchie e l’assenza di separazione nella miscela conferma l’identità dei due composti. composti diversi possono avere casualmente lo stesso Rf in un determinato sistema cromatografico. E’ perciò consigliabile effettuare analisi con più eluenti prima di confermare l’identità tra due prodotti.

Rivelazione

Se i componenti non sono direttamente visibili bisogna utilizzareopportuni metodi di rivelazione. I più comuni sono:

Luce UV: si utilizzano lastre in cui l’adsorbente è impregnato consostanze fluorescenti. Per esposizione alla luce UV (254 o 366nm)la lastra mostra intensa fluorescenza, mentre i composti cheassorbono nella regione dell’UV appaiono come macchie scure.

Acido solforico concentrato: spruzzato sulle lastre, che vengonopoi bruciate ossida le sostanze organiche in corrispondenza dellequali appaiono macchie scure.

Iodio: utile per rivelare sostanze che possiedono almeno unlegame insaturo e che formano complessi a trasferimento dicarica con lo iodio.

Permanganato: soluzione di permanganato di potassio in soda,in grado di rivelare la maggior parte delle sostanze organiche. Lalastrina appare viola e le macchie bianche o gialle.

Pancaldi: reattivo a base di sali di molibdeno in grado di rivelarezuccheri ed altre sostanze organiche. Le macchie appaiono blusu fondo bianco.

Ninidrina: utile per la rivelazione di amminoacidi. Le macchieappaiono marroni-rossastre.

PRIMA ESERCITAZIONE: la TLC

Analisi TLC di sostanze di interesse farmaceutico utilizzando

come sistema di rivelazione la luce UV:

-ricerca dell’eluente adatto ad ottenere un Rf compreso tra 0,2 e

0,5

-determinazione del valore esatto di Rf

- relazione sul quaderno (riportando i disegni delle TLC più

significative)

O

COOH

CH3

KETOPROFENE

COOH

O

O

CH3

ACIDO ACETIL SALICILICO

NH

OH

O

CH3

PARACETAMOLO

N

N N

N

O

O

H3C

CH3

CH3

CAFFEINA

Cromatografia su colonna Si utilizzano in genere colonne di vetro. Rapporto ottimale altezza/diametro: circa 8:1 Rapporto grezzo/adsorbente consigliabile è di 1/20-50; per separazioni difficili si possono usare rapporti fino a 1/100 o 1/200. L’impaccamento della colonna: importante non creare zone di disomogeneità (crepe) che possono costituire vie preferenziali attraverso le quali la fase mobile si muove più rapidamente senza entrare in contatto con la fase stazionaria, diminuendo così l’efficacia della separazione. I metodi di riempimento sono due: Impaccamento a umido: si sospende la fase stazionaria nell’eluente e si versa il tutto nella colonna, lasciando sedimentare lentamente; Impaccamento a secco: si introduce la fase stazionaria secca e poi si fa percolare l’eluente fino ad ottenere una miscela omogenea. Il primo metodo è generalmente utilizzato per impaccare la silice, il secondo per l’allumina o nella cromatografia flash.

Adsorbimento del campione: I metodo: il campione disciolto nella minima quantità di un opportuno solvente, viene depositato con una pipetta sulla sommità della fase stazionaria. La scelta del solvente per il caricamento dipende unicamente dalle caratteristiche di solubilità del campione. Generalmente è preferibile usare l’eluente stesso. Tuttavia spesso è necessario usare un solvente ad elevata polarità. In questo caso la quantità di solvente da usare deve essere la minima possibile per non influenzare negativamente la separazione cromatografica. II metodo: il polverino. Si scioglie o si sospende il campione in un solvente polare, si aggiunge una quantità di adsorbente pari a circa 2 volte il peso del campione, si evapora il solvente sotto vuoto e si trasferisce il polverino perfettamente asciutto in colonna.

Una volta caricato il campione, si copre con uno strato di sabbia ( o di cotone) si carica l’eluente e lo si lascia percolare in modo continuo raccogliendo il liquido che fuoriesce in frazioni di volume opportuno.

Durante la separazione bisogna evitare due cose:

Lasciar seccare l’adsorbente per evitare che entri in contatto con l’umiditàatmosferica;

Non arrestare il flusso del solvente in colonna per evitare fenomeni didiffusione.

Per favorire la migrazione dei componenti più polari è consigliabile effettuarel’eluizione con un gradiente di polarità: si inizia con il solvente meno polare inmodo da far migrare i componenti meno polari e separali da quelli più polari e siprosegue aumentando la polarità. Ogni variazione è effettuata al terminedell’eluizione di un singolo componente.

Il metodo più utilizzato per seguire una separazione cromatografica su colonnaconsiste nel raccogliere l’eluato in frazioni di uguale volume e analizzare lefrazioni in TLC.

Cromatografia flash

La cromatografia flash è una tecnica cromatografica preparativa sucolonna in cui si utilizza un adsorbente con granuli di dimensioni moltoinferiori rispetto a quelli utilizzati nella cromatografia a pressioneatmosferica.

In tal modo è possibile migliorare l’efficienza della separazionecromatografica in quanto, a parità di peso, aumenta l’estensione dellasuperficie attiva dell’adsorbente.

Un problema tecnico è costituito dalla diminuzione della velocità dipercolazione. Per permettere al solvente di fluire a velocità adeguatasi applica in testa alla colonna una pressione ad opera di un gas inerte(azoto) o aria compressa.

In questo modo la separazione risulta altamente efficiente, rapida evantaggiosa in quanto si usa una quantità di solvente inferiore.

La procedura operativa è la seguente: Si sceglie come fase mobile una miscela che offra una buona

separazione delle sostanze su TLC Si riempie con la silice una colonna di opportuno diametro (vedi

tabella) a secco per circa 10-12 cm Si fa fluire l’eluente in pressione per eliminare l’aria; Si carica il campione e si fluisce ad una velocità di circa 2-3

cm/min; Si raccolgono le frazioni di volume appropriato e si controllano in

TLC;

Quantità di campione (mg)

Diametro colonna

Volume di eluente

Rf > 0.2 Rf > 0.1

Volume della

frazione 10 100 100 50 5 20 200 400 200 10 30 400 900 400 20 40 600 1500 500 30 50 1000 2500 1000 50

Rimozione del solvente

Questa operazione viene condotta utilizzando l’evaporatore rotante, uno strumento che consente la rimozione veloce di grandi quantità di solventi volatili. Può lavorare sia a pressione atmosferica che a pressione ridotta con l’ausilio di pompe ad acqua o meccaniche.L’aspetto principale che distingue questo apparato da quelli normalmente usati per la distillazione è che il pallone ruota durante il processo di evaporazione; ciò riduce il rischio di schiumeggiamento e aumenta la velocità di evaporazione del solvente in quanto la rotazione lo disperde sulle pareti del pallone aumentandone il rapporto area/superficie.