ทฤษฎ และ หลกการเคร องมอ UV‐Vis spectrophotometer

เคร อ งมอสาหรบการตรวจหาปรมาณของสาร อาศยหลกการ

ไ ใ ท วา สารแตละชนดจะสามารถดดกลนแสงไดในชวงความยาวคลนท

แตกตางกน และปรมาณการดดกลนแสงข นอยก บความเขมขนของ

สารนน

l l

The visible spectrum

f dUltra violet Infra Red

2

ทฤษฎ และ หลกการเคร องมอ UV‐Vis spectrophotometer

กฎของเบยร (Beer’s low) มใจความวา “ เม อแสงทม ความยาวคลนเดยวผานตวกลางเดยว สดสวนของความเขมของ

แสงทถกตวกลางนนดดกลนไวจะแปรโดยตรงกบปรมาณของตวกลางท

ดดกลนแสงนน”

กฎของเบยร (Lambert’s low) มใจความวา ( h i li h )  “ เม อมแสงเดยว(monochromatic light) ซงคอแสงทม ความยาว

คลนเดยวผานตวกลางเนอเดยว สดสวนของเนอเขมของแสงทถกตวกลาง

นนดดกลนไวไมขนอยกบความเขมของแสงทกระทบตวกลางนน และความนนดดกลนไวไมขนอยกบความเขมของแสงทกระทบตวกลางนน และความ

เขมของแสงจะถกแตละช นของตวกลางดดกลนไวในสดสวนทเทากน ”

3

4

หลกการหาปรมาณของสารดวย UV‐Vis spectrophotometer

การวดปรมาณของแสงท ถกดดกลนทาไดโดยการใหลาแสงผานเขาไปใน

สารตวอยาง(Po) แลววดปรมาณของแสงท ผานทะล(P) โดยเปรยบเทยบกบสารตวอยาง(Po) แลววดปรมาณของแสงทผานทะล(P) โดยเปรยบเทยบกบ

แสงท ให (Po)

5

ขอกาหนดของเบยรแลมเบรด

• แสงท ใชตองเปนแสงเอกรงค• ชอง slit ตองแคบจงจะใหการวดท มประสทธ ภาพ

• ตองไมมแสงหลงมาจากแหลงอ น

• กระบวนการดดกลนแสงตองไมขนแกกน นนคอ สารละลายตองเจอจาง

• สารละลายทน าไปวดตองเปนเนอเดยวกน• สารละลายตองไมข น ไมเปนตะกอน ไมเปนคอลลอยด

6

การเบยงเบนจากกฎของเบยร ม 2 สาเหตค อ

1. การเบยงเบนทางเคม (chemical deviation)2. การเบยงเบนจากเครองม อ(instrumental deviation)

การเบยงเบนทางเคม (chemical deviation) เกดจากสารทต องการวเคราะหเกดการสลายตว

การรวมตว หรอทาปฏกรยากบตวทาละลาย แลวกลายเปนสารตวอนทให absorption spectrumตางจากสารทต องการวเคราะห ทาใหผลเบยงเบนออกจากกฎของเบยร โดยผลจะเบยงเบนไปดานเชงลบ

การเบยงเบนจากเครองมอ (instrumental deviation) เกดจาก1. ความไมแมนยาของเครองมอวด ในทางปฏบตพบวาการวดคาการด ดกลนของสารใหม ค าอย

ในชวง A  =  0 1 1 0  จะมความคลาดเคลอนนอยมาก1 2% ดงนน ในการปฏบตงานจรงจะมการในชวง A  =  0.1‐1.0  จะมความคลาดเคลอนนอยมาก1-2% ดงนน ในการปฏบตงานจรงจะมการ

ปรบความเขมขนของสารละลายใหอยในชวง A = 0.1‐1.0  ถาคา A มากกวาหรอนอยกวานแสงทผานมายงเครองตรวจวดจะนอยหรอมากเกนไป ดงนน ความคลาดเคลอนจงมคาสง

ป2. แสงทม หลายความยาวคลน จากกฎของเบยร อนมานวา ความยาวคลนทผานสารละลายเปนความ

ยาวคลนเดยว แตในทางปฏบตอาจมความยาวคลนอนปะปนมาดวย

3. คลนแสงรบกวน คอการรบกวนของความยาวคลนทเราไมไดเล อกผานเขาไปตกกระทบบนตว

7

ตรวจจบสญญาณ

สวนประกอบของเครอง Spectrophotometer1. แหลงกาเนดแสง ใหแสงชวงความยาวคลนทเหมาะสม เชน 190-1100 นาโนเมตร

  h   ใ 2. Monochromator เปนสวนทใชจดการเกยวกบแสง 3. ชองใสตวอยาง และหลอดบรรจตวอยาง (Cuvette) ใชใสตวอยางทต องการวด4. Detector สวนตรวจสอบแสงทเหลอจากการดดกลนตวอยาง5. ประมวลผลและแสดงผล

8

แหลงกาเนดแสง แหลงกาเนดแสงทดควรใหแสงทม ความเขมสม าเสมอและแสงนงตลอดชวงความยาว

คลนทใชงานภายนอก คลนทใชงานภายนอก

หลอดทงสเตน นามาใชในชวง Vissible โดยหลอดชนดนใหพลงงาน ต งแต 300-1100 นาโนเมตร

หลอดดวทเร ยม และหลอดซนอน เปนหลอดททางานไดดทสดในชวงความยาวคลน

ต ากวา 300 นาโนเมตร

Tungsten and deuturium lamp9

Monochromatorโมโนโครเมเตอรเปนชนสวนสาคญในการกาหนดคณภาพของ สเปคโตรโฟโต

มเตอร ทาหนาทแยกลารงสทม ความยาวคลนตอเนองออกเปนลารงสความยาวมเตอร ทาหนาทแยกลารงสทมความยาวคลนตอเนองออกเปนลารงสความยาว

คลนเดยว ในชวงแสงทแลเหนไดอาจใชปรซมแกว สวนในชวง UV จาเปนตองเปนปรซมททาดวยควอตซ เปนปรซมททาดวยควอตซ

10

ใ ป ชองใสตวอยาง และอปกรณบรรจตวอยาง ปกตการออกแบบชองใสตวอยางจะมฝาครอบ หรอเลอนปดอยางมดชด เพอไมใหแสงจาก

ภายนอกตกไปยง detector    สวนทใสตวอยางนจะปดกนอยางดเพอปองกน

monochromator    และ detector  cell  สาหรบอปกรณบรรจตวอยาง

C   Q   i l  l   Cuvette  ทาจากวสดชนดตางๆ คอ Quartz,  optical  glass  และพลาสตก การเลอกวสดนนจะขนอยกบความยาวคลนทใชวด และลกษณะของตวอยาง

Quartz  ใช 350 nm  uv Quartz  ใชความยาวคลนตากวา 350 nm. uv Glass ใชไดในชวงความยาวคลนมากกวา 300 nm.  ใ ไ ใ Vi ibl   พลาสตก ใชไดในชวง Vissible เทานน

11

DetectorDetector ใ ไ ไ ทาหนาทแปลงพลงงานแสงใหเปนสญญาณไฟฟา ไดแกชนด

Silicon photodiode และPhotomultiplier tube detector

12

การวเคราะหเช งปรมาณ การวเคราะหหาปรมาณโดยวธกราฟมาตรฐาน (standard curve) ป โ (St d d  การวเคราหหาปรมาณโดยวธการเตมสารมาตรฐาน (Standard addition)

ข นตอนการตางๆ ในการใชเครอง

1. เล อกตวทาละลายทไม ดดกลนแสงในชวงเดยวกบสารตวอยาง และมคาความ

ยาวคลนต าสด(Cut‐off points) ทจะใชไดอยต ากวาสารตวอยาง2. สแกนดสเปกตรม แลวเล อกใชท ความยาวคลนสงสด

3. เตรยมสารละลายใส ไมมความขน ตะกอน หรอแยกชน

13

การวเคราะหหาปรมาณโดยวธ กราฟมาตรฐานการวเคราะหหาปรมาณโดยวธกราฟมาตรฐานจ ากทฤษฎท ก ล า วม าข า งตน เ ร าทร าบแลวค า ก า ร ด ด กลน แ ส งขอ งส าร ม

ความสมพนธ กบคาความเขมขนของสารหรอปรมาณของเนอสารนนตามกฎของเบยรและฎ

แลมเบรต ดงนนถาเรานาความสมพนธนมากราฟและไดความสมพนธเชงเสนตรง เราจะเรยก

กราฟนวา กราฟความเขมขนมาตรฐาน (calibration curve)

กราฟความเขมขนมาตรฐาน นม ประโยชนมากในเชงปรมาณวเคราะห เพราะ

สามารถใชเทยบเพอหาความเขมขนของสารทไม ทราบคาได โดยทสารทไม ทราบคาความ

เขมขนนน จะตองอยในชวงความเขมขนมาตรฐานททราบคาแลว และเสนกราฟความเขมขน

มาตรฐานจะตองเปนเสนตรงเสมอ

วธการสรา งกราฟความ เขม ขนม าต รฐ าน คอ การนาสารล ะล ายมาต รฐ าน

(standard solution) ททราบคาความเขมขนทแนนอนอยางนอย 3-4 ความเขมขน มาวดคาการดดกลนแสง จากนนกนาความสมพนธ ทไดไปสรางกราฟ สวนความเขมขนทไม

ทราบคากนาไปวดคาการดดกลนเชนกน แลวนาคาการดดกลนไปเทยบกบกราฟความเขมขน

มาตรฐานหรอคานวณจากสมการเชงเสนของกราฟความเขมขนมาตรฐานเพอยอนกลบมามาตรฐานหรอคานวณจากสมการเชงเสนของกราฟความเขมขนมาตรฐานเพอยอนกลบมา

เปนความเขมขน เรากจะทราบคาความเขมขนของสารนน แสดงดงรป14

ตวอยางกราฟมาตรฐาน

กราฟทไดควรเปนเสนตรง และม R ไมนอยกวา 0.995

คานวณคาความเขมขนตวอยางไดจากการแทนในสมการเสนตรง y=mx+c

15

วธ เตมสารมาตรฐาน (standard addition)ฐ ( )

ป ใ เตมสารละลายมาตรฐานปรมาณแตกตางกนลงในสารละลายตวอยางทม

ปรมาตรเทากน ปรบปรมาตรใหเทากน

ไป Ab นาไปวดคา Abs เขยนกราฟระหวาง Abs กบความเขมขน

16

ใ ใ เพอใหการใชเครองวดการดดกลนแสงมความ

ผดพลาดนอยท สดควรปฏบตดงน ผดพลาดนอยทสดควรปฏบตดงน

17

ใ

เพ อใหการใชเครองวดการดดกลนแสงมความผดพลาดนอยทสดควรปฏบตดงน

1. เลอกใชวธวเคราะหทเหมาะสม

2. เตรยมตวอยางใหเหมาะสม ไมข น หรอ มสอ นๆ เจอปนมาก (กรอง หรอ แยกสาร)

3 อนเครองใหพอเพยงกอนใชงาน ตามทค ม อแตละยหอระบ3. อนเครองใหพอเพยงกอนใชงาน ตามทคมอแตละยหอระบ

4. ใชควเวตตทสะอาดและมคาความแตกตางของ %T  ต า5. กรณตรวจวดอยางทม สเจอปนมาก ควรลางควเวตตดวยตวทาละลายเพอลดการปนเปอน 5. กรณตรวจวดอยางทมสเจอปนมาก ควรลางควเวตตดวยตวทาละลายเพอลดการปนเปอน

6. ควรวดสารละลายทม ความเขมขนนอยกอนสารละลายทม ความ เขมขนมากตามลาดบ

7. กรณตวอยางทผานการแชเยน ตองต งวางไวจนกวาตวอยางจะมอณหภมเทากบกบสภาวะ7

หอง เนองจากตวอยางทเยนขณะตรวจวดจะเกดฝาท ควเวตต สงผลกระทบตอแสงทผาน

8. กรณตวอยางเกดเปนฟองไดงายตองระมดระวงอยางมากในการถายตวอยางลงสควเวตต

9. ปฎบตตามคาแนะนาในค ม อการใชงาน (Operating manual) อยางเครงครด

10. ไมควรต งบรเวณทลมจากเครองปรบอากาศหรอพดลมตกกระทบโดยตรง

18

เพ อใหการใชเครองวดการดดกลนแสงมความผดพลาดนอยทสดควรปฏบตดงน

9. ตรวจดความเสอมสภาพของหลอดไฟกาเนดแสงเปนระยะๆ พรอมกบดตาแหนงท

ถกตองดวย

10. หลงการใชงาน ปดครอบตวเคร อง ดวยผาคลมเพ อปองกนฝ น

ใ ฝ ไ ใ 11.ตงเครองมอในทม ฝ นนอย ความชนตา อณหภมไม สง และควรตงหางจากผนง เพอให

ความรอนระบายออกไดด

12 ร วงไมใหสาร คมหก ขาส ว คร อง12. ระวงไมใหสารเคมหกเขาสตวเครอง

13. ใชเครองควบคมโวลต (Voltage stabilizer)  ถาโวลตของกระแสไฟฟาทจ ายไฟฟาทจ ายใหกบเครองมค าเปลยนแปลงเกน10% หรอบรเวณทม อปกรณไฟฟา 3 เฟสไฟฟาทจายใหกบเครองมคาเปลยนแปลงเกน10% หรอบรเวณทมอปกรณไฟฟา 3 เฟส

14. มการบารงรกษาเคร องมอเปนระยะๆ และสมาเสมอ จากบรษทผผลต

19

20

สงท ตองพจารณากอนการวดตวอยางจรง1. ความถกตองของวธเตรยมตวอยาง

2. วธ การเตรยมสารมาตรฐาน

3. ชวงความเปนเสนตรง (linerlity of detection) ของสารท ต องการตรวจวด ทความยาวคลนทเราเล อกใช เชน การตรวจวดสาร

เอ เม อนามาเตรยมสารมาตรฐานแลวนามาพรอตกราฟ ไดดงแสดง

ดงรป

21

ชวงความเปนเสนตรง (linearlity of detection) 

มคาความแมนยามคาความแมนยา

ของการตรวจวดสง

ป ชวงความเปนเสนตรง

หมายเหต ความเขมขนของแตละชนดไมสามารถระบไดวาเขมขนเทาไรด ตองลองทาด

22

ไม ระบหนวยความเขมขน

ตองเลอกความยาวคลนสงสดในการตรวจวดหรอไมตองเลอกความยาวคลนสงสดในการตรวจวดหรอไม

23

ตองเลอกความยาวคลนสงสดในการตรวจวดหรอไม

จากรป

24

ใ ไ ตองเลอกความยาวคลนสงสดในการตรวจวดหรอไม

25

26

27

ผลการการคอนจเกตผลการการคอนจเกต

28

29

Contact Telephon : 749960‐61(in psu), 061 ‐9655546 (mobile)Li   iLine: nui3456

Face book: nui kantakapun

30

31