ANALISI QUANTITATIVA

L’analisi quantitativa UV-VIS si basa sulla legge di Lambert-Beer che esprime una relazione

di proporzionalità tra la conc. di un analita e l’assorbanza a una determinata . Perchè tale

legge sia applicata in analisi quantitativa devono essere rispettate due condizioni:

- L’analita deve assorbire in modo rilevabile nell’intervallo spettrale 200-900 nm. Questo si

verifica con una analisi spettrale dell’analita. Si identifica quindi la lunghezza d’onda

(solitamente max) per l’analisi quantitativa

- La relazione assorbanza/conc. deve essere lineare. Questo si verifica allestendo una

curva di calibrazione

Esistono diversi fattori che possono provocare deviazioni dalla linearità tra cui fattori

fisici/chimici, fattori strumentali e operativi

0 1 2 3 4 5 6 70.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

Concentrazione (M)

Ass

orb

anza

-Variazioni di pH, temperature e solvente possono avere effetto sulla linearità

-In soluzioni torbide la luce incidente viene in parte persa per effetto della diffusione

con un aumento (apparente) della assorbanza. Si risolve il problema utilizzando

opportuni sistemi in grado di raccogliere la luce dispersa (sfera integratice)

- A concentrazioni elevate, le molecole possono formare dimeri e polimeri, anche

aggregati con il solvente. Di conseguenza si possono osservare deviazioni positive o

negative dalla legge di lambert Beer

concentrazione

Ass

orba

nza

Formazione di dimeri

Formazione di polimeri

Fattori fisici e chimici

-L’indice di rifrazione della soluzione varia al variare della concentrazione (quando è

elevata) e di conseguenza varia anche la poiché la rifrazione fa variare la lunghezza

d’onda della radiazione incidente. Per ridurre tale inconveniente, di solito si lavoro con

soluzioni diluite 10-2 – 10-7 M.

concentrazioneA

ssor

banz

a

Radiazione monocromatica

Banda stretta

Banda larga

Fattori strumentali

-L’ampiezza della banda passante, oltre ad essere decisiva sulla precisione e accuratezza

dell’analisi, influisce inoltre sulla linearità della legge di lambert Beer. -La luce diffusa dovuta a cause strumentali altera l’ assorbanza soprattutto per soluzioni

concentrate (la curva assume pendenza negativa)

A = logP0 + S

P + SA = log

P0 + S

S

Per soluzioni molto concentrate, P diminuisce e al limite si annulla

CALIBRAZIONE

La calibrazione determina la relazione tra la risposta analitica e la concentrazione

dell’analita. Di solito tale operazione si effettua mediante standard.

Calibrazione con std. esterno

Lo std. esterno viene preparato separatamente dal campione (al contrario lo std. Interno

è aggiunto al campione stesso). Si prepara una serie di std. esterni contenenti l’analita a

concentrazioni note (almeno 3 conc., metodo della diluizione progressiva). Si misura

quindi l’assorbanza rispetto alla concentrazione dell’analita e e si determina la curva di

calibrazione fittando i dati con un’appropriata equazione matematica, quale la relazione

lineare usata nel metodo dei minimi quadrati

Il metodo dei minimi quadrati

L’assorbanza (ordinata) è la variabile dipendente mentre concentrazione (ascissa) è la

variabile indipendente. In condizioni ideali tutti i punti sono allineati con l’origine degli assi

(ratta passante per lo 0, y= mx). In condizioni reali, a causa degli errori indeterminati

associati al processo di misurazione, non tutti i dati si trovano sulla stessa linea

0 1 2 3 4 5 6 70.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

Concentrazione (M)

Ass

orb

anza

0 1 2 3 4 5 6 70.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

Concentrazione

Ass

orb

anza

y=mx

x

y

m= y/x

y=mx+b

In tali condizioni bisogna derivare la “migliore” retta che interpoli i punti. L’analisi dei

minimi quadrati lineare fornisce l’equazione della migliore retta passante tra un insieme

di dati x,y, assumendo che ogni deviazione dei punti dalla linea retta deriva da un errore

commesso nel corso della misurazione. Quindi si assume che ai valori x, ovvero alla

preparazione delle concentrazioni, non è associato alcun errore

La linea costruita con il metodo dei minimi quadrati

è quella che minimizza la somma dei quadrati dei

residui (deviazione verticale di ciascun punto dalla

retta) corrispondenti a tutti i punti

Uso di Excel nel calcolo dei minimi quadrati

1. Inserire i dati x e y su due colonne

2. Selezionare una serie di celle con

larghezza pari a due celle e lunghezza

cinque

3. Selezionare la funzione statistica

REGR.LIN

4. Compilare gli argomenti funzione

come indicato

5. Per visualizzare i risultati digitare la

seguente combinazione

Ctr+Shift+Invio

intercettapendenzad.s. pendenza d.s. intercetta

Coeff. di deter. (R2) d.s. della regressione

F gradi libertà

Somma quadrati residuiSomma quadrati regr.

Pendenza = m Intercetta = b

y = mx + b

Coefficiente di determinazione (R2): è un indice della variazione totale tra il valore y

misurato e quello derivante dalla relazione lineare determinata. Il valore va da 0 a 1. Più il

valore di R2 si avvicina all’unità meglio il modello lineare esprime le variazioni di y

Rappresentazione grafica

Il metodo dell’aggiunta standard

Tale metodo si applica qualora l’analita sia in una matrice più o meno complessa possibile

interferenza dei componenti della matrice con la determinazione dell’analita. Per eliminare tali

interferenze bisognerebbe preparare una serie di std. che riproducono esattamente il

campione (spesso non è possibile). In tali casi si utilizza il metodo dell’aggiunta standard che

controbilancia gli effetti della matrice. Il metodo prevede l’aggiunta di diverse aliquote di una

soluzione std. ad uguali aliquote di campione.

Vx=volume soluzione incognita Cx

Vt

Vs=volume soluzione std. Cs

Diverse aliquote uguali Vx della soluzione incognita di concentrazione Cx sono trasferiti in

matracci volumetrici aventi volume Vt. A ciascuno di essi è aggiunto un volume variabile Vs di

una soluzione std. a concentrazione nota Cs. Si determina sperimentalmente la assorbanza.

L’assorbanza della soluzione è descritta da:

As = b Vs Cs

Vt

b Vx Cx

Vt

+ = k VsCs + kVxCx

Dove k è una costante uguale a b/Vt . Un grafico di As in funzione di Vs, produce una

linea retta di equazione:

As= mVs + b

ove m= kCs e b= kVxCx

Dall’analisi dei minimi quadrati si determina m e b.

m

b=

kCs

kVxCx

Cx = bCs

mVx

Esempio metodo delle aggiunte std.

Aliquote di 10 ml di un campione di Fe3+ di una soluzione incognita vengono aggiunte in

matracci volumetrici da 50 ml. Esattamente 0.00, 5.00, 10.00, 15.00 e 20.00 ml di una

soluzione std. contenente 11.1 ppm di Fe3+ vengono aggiunti a ciascuna aliquota, seguiti da

un eccesso di ione tiocianato, per dare il complesso Fe(SCN)2+ . Dopo diluizione a volume le

assorbanze misurate risultano rispettivamente: 0.240, 0.437, 0.621, 0.809 e 1.009. Calcolare

la concentrazione di ioni Fe3+ della soluzione incognita.

Cx = bCs

mVx

m = 0.0382

b = 0.2412

7.01 ppm Fe3+

Analisi di miscele

L’assorbanza di una soluzione ad una particolare lunghezza d’onda è uguale alla somma

delle assorbanze di tutte le specie presenti nella soluzione

Assorbanza di una miscela A = x b [X] + Y b [Y] + Z b [Z] + …..

Si consideri un miscela costituita da due composti X e Y, si distinguono due casi:

Spettri sovrapposti Spettri solo in parte sovrapposti

Procedimento per l’analisi di una miscela i cui componenti presentano spettri sovrapposti

Si consideri l’analisi dei complessi di Ti(IV) e V(V) con H2O2

1. Determinare l’assorbanza di ciascun std. a diverse lunghezze d’onda

2. Calcolare l’assorbività molare a ciascuna lunghezza d’onda mediante la legge di Beer

[Ti] std= 0.00132 M [V] std= 0.00189 M

3. Misurare l’assorbanza della miscela che è data dalla somma delle assorbanze delle

componenti

Am = x b [X] + Y b [Y] (non si conoscono tuttavia [X] e [Y]

3. Stimare la concentrazione di X e Y (il valore stimato non deve necessariamente essere

vicino al valore vero) e calcolare usando la funzione Excel, il valore ai A calc mediante

l’equazione

Acalc = x b [X] + Y b [Y]

Valori stimati

5. Calcolare con funzione Excel la somma dei quadrati [H9 =SOMMA(H4:H8)]

4. Calcolare con funzione Excel il quadrato della differenza tra l’assorbanza calcolata e

quella misurata [Acalc-Am]^2

5. Effetuare l’analisi dei minimi quadrati per minimizzare la somma dei quadrati [Acalc-

Am]^2 variando le concentrazioni di [X]stima e [Y]stima. I valori “ migliori” di [X]stima e

[Y]stima sono quelli che rendono minima la somma dei quadrati (cella H9). Excel

contiene una macro per lo svolgimento della minimizzazione (RISOLUTORE)

Se non presente scegliere componenti aggiuntivi dal menu strumenti e selezionare aggiunta risolutore

6. Impostare i parametri di minimizzazione e quindi risolvere l’analisi

Procedimento per l’analisi di una miscela i cui componenti presentano spettri risolti

Se gli spettri dei componenti di una miscela sono risolti sufficientemente (come nel caso

di 1 e 2), le concentrazioni della miscela si determinano risolvendo una sistema di due

equazioni

A’ = ’X b [X] + ’Y b [Y]

A’’ = ’’X b [X] + ’’Y b [Y]

Ove A’ e A’’ sono l’assorbanza rispettivamente a ’ e ’’

A’ = ’X b [X] + ’Y b [Y]

A’’ = ’’X b [X] + ’’Y b [Y]

Risolvendo l’equazione nelle due incognite X e Y si ottengono i seguenti risultati:

[X] =

A’ ’YbA’’ ’Yb

’Xb ’Yb’’Yb ’Yb

[Y] =

’Xb A’’’Yb A’’

’Xb ’Yb’’Yb ’Yb

Ciascun simbolo a bc d è detto determinante ed è un modo

abbreviato per scrivere (a x d) – (c x b)

Si considerino le sostanze X e Y le cui assorbività molari sono di seguito riportate

(nm) X Y

272 16440 3870

327 3990 6420

Una mscela di composti X e Y è caratterizzata da una assorbanza di 0.957 a 272 nm e di 0.559 a 327 nm. Calcolare la concentrazione di X eY nella miscela

Punto isosbestico

Se in una reazione chimica una specie assorbente X viene convertita un un’altra specie

assorbente Y e se gli spettri delle due specie si intersecano in un punto, qualsiasi spettro

registrato durante tale reazione passerà per quel punto detto punto isosbestico

L’esistenza del punto isosbestico è una buona prova del fatto che esistono solo due specie principali