GLI ENZIMI

Sono molecole che catalizzano le reazioni

in modo specifico.

Fattori che influenzano una reazione enzimatica

1) Concentrazione del substrato

Velocità iniziale = dc/dt

Se la [E] è in eccesso rispetto al substrato

S P (det. spettrofotometricamente)

[S] cre

scenti

CURVA DI MICHAELIS MENTEN

Se l’enzima è in eccesso,

la velocità di reazione aumenta all’aumentare

del substrato (cinetica di Primo Ordine)

Quando [S] satura tutti i siti enzimatici,

si raggiunge la velocità di reazione max

(cinetica di Ordine Zero)

Velocità di reazione

v = dc/dt

Cinetica di reazione di ordine zero

V = K [E]

Cinetica di reazione di primo ordine

V = K [S]

ENZIMA MICHAELIANO

Enzima come reagente

Enzima come indicatore di danno

Fattori che influenzano una reazione enzimatica

2) Concentrazione dell’enzima: quando la [S] è in eccesso

rispetto alla [E], la velocità della reazione è proporzionale alla [E]

3) pH

4) Temperatura

5) Cofattori

6) inibitori

Il pH ottimale viene accuratamente mantenuto con

l’utilizzo di tamponi appropriati

Fattori che influenzano una reazione enzimatica

2) Concentrazione dell’enzima: quando la [S] è in eccesso

rispetto alla [E], la velocità della reazione è proporzionale alla [E]

3) pH

4) Temperatura

5) Cofattori

6) inibitori

Alcuni enzimi necessitano di cofattori inorganici

I cofattori devono essere sempre aggiunti in eccesso

nella miscela di reazione

e/o cofattori organici (coenzimi)

Coenzimi piridinici

Fattori che influenzano una reazione enzimatica

2) Concentrazione dell’enzima

3) pH

4) Temperatura (analisi a temp strett controllate)

5) Cofattori (sempre in eccesso)

6) inibitori

http://www.youtube.com/watch?v=PILzvT3spCQ&feature=fvwrel

INIBIZIONE COMPETITIVA

Kmi > Km

Vmaxi = Vmax

Kmi = Km

Vmaxi < Vmax

INIBIZIONE NONCOMPETITIVA

Dosaggi enzimatici

Per essere dosati nel siero, urina o altri fluidi gli enzimi

devono essere:

Stabili durante la conservazione e l’analisi del campione;

Significativi dal punto di vita diagnostico

Facilmente dosabili

La concentrazione degli enzimi viene calcolata in base alla

loro attività enzimatica.

La determinazione deve essere effettuata finchè la formazione

del prodotto aumenta linearmente nel tempo (i primi minuti).

A) La miscela di reazione viene fatta

reagire per un tempo prestabilito,

finito il quale si determina la quantità

di prodotto ottenuto o di substrato

consumato.

B) La reazione viene seguita in

continuo (saggio cinetico) mediante

misurazioni successive ad intervalli

di tempo prestabiliti

[E4]

[E3]

[E2]

[E1]

Le misurazioni in continuo sono preferibili perché permettono

di individuare qualsiasi deviazione dalla linearità.

L’esempio piu’ comune di deviazione dalla linearità si verifica

quando la concentrazione di E nel campione è cosi’ elevata

che consuma tutto il substrato in tempi rapidissimi.

I livelli enzimatici vengono riportati come

Unità enzimatiche (non concentrazione)

E’ stato proposto l’utilizzo dell’UNITA’ INTERNAZIONALE (UI):

1UI è quella quantità di enzima che catalizza la trasformazione

di 1 mmole di substrato in 1 minuto.

La concentrazione enzimatica viene espressa come UI/L

giallo

TEST OTTICO SEMPLICE

incolore

TEST OTTICO ACCOPPIATO

Consiste nell’accoppiamento della reazione primaria

con una seconda NAD- o NADP-dipendente (reazione

indicatrice).

Quando il prodotto dell’enzima da dosare non è

distinguibile otticamente dal substrato.

L S P

E1 E2

E1 = enzima da dosare

E2 = enzima ausiliario (reazione rivelatrice)

Affinchè la misura sia proporzionale al contenuto di E1 presente nel

campione da dosare si devono realizzare 3 condizioni:

- La reazione catalizzata da E1 deve essere di ordine zero rispetto a [L].

si realizza con un eccesso di L ([L]>> KmL)

- La reazione catalizzata da E2 deve essere di primo ordine rispetto a [S].

si realizza utilizzando E2 in largo eccesso ([S]<<Kms)

- Entrambe le reazioni devono essere irreversibili

L S P

E1 E2

TEST OTTICO ACCOPPIATO

L’enzima E1 deve costituire il fattore limitante

Alanina

Aspartato

piruvato

ossalacetato

TRANSAMINASI

Enzimi nella diagnostica: le transaminasi

AST = aspartato amminotrasferasi

Aspartato + a-chetoglutarato ossalacetato + glutammato

AST

Ossalacetato + NADH + H+ malato + NAD+

MDH Reazione indicatrice

accoppiata

AST (GOT) = Aspartato aminotrasferasi

AST (sinonimo GOT)

Indice di funzionalità epatica e muscolare

Valori ematici normali (8-20 UI/l)

Principalmente localizzata nel tessuto cardiaco, scheletrico ed

epatico.

La concentrazione intracellulare di AST è 1000 volte piu’

elevata rispetto alla concentrazione extracellulare.

Aumenta nell’epatite acuta e cronica, nell’infarto del miocardio,

nella distrofia muscolare, nella pancreatite acuta.

Dopo danni gravi, i livelli di AST possono alzarsi in 6/10 ore e

rimanere alti per circa 4 giorni.

AST (sinonimo GOT)

Dopo danni gravi, i livelli di AST possono alzarsi in 6/10 ore e

rimanere alti per circa 4 giorni.

Utile nella diagnosi e nel controllo della terapia delle malattie

epatiche.

Nell’epatite acuta: aumenta in tempi brevi (150-500 UI/l)

Nell’epatite cronica: scarso aumento (20-100 UI/l)

Alanina + a-chetoglutarato piruvato + glutammato

ALT

Piruvato + NADH + H+ Lattato + NAD+ LDH

Reazione indicatrice

accoppiata

LDH = Lattico Deidrogenasi

ALT (GPT) = Alanina aminotrasferasi

Enzimi nella diagnostica: le transaminasi

ALT = alanina amminotrasferasi

ALT (sinonimo GPT)

Indice di funzionalità epatica

Valori ematici normali (10-25 UI/l)

Principalmente localizzata nel tessuto epatico.

Aumenta nell’epatite acuta e cronica.

Nel danno infiammatorio acuto il livelli di ALT sono

superiori ai livelli di AST e rimangono elevati nel sangue

piu’ a lungo.

Enzimi nella diagnostica: la lattato deidrogenasi

Piruvato + NADH + H+ Lattato + NAD+ LDH

Valori ematici normali (100-200 UI/l)

I Livelli aumentano in patologie epatiche, cardiache,

muscolari, renali ed ematologiche

Molti farmaci possono indurre un aumento sierico di tale

enzima: anestetici, dicumarolici, nitrofurantoina, ecc

Gli eritrociti hanno una concentrazione di LDH 100-150

volte maggiore rispetto a quella che si trova nel sangue

Sono forme multiple di un enzima che catalizzano la

stessa reazione, ma differiscono nella struttura (sono

codificate da geni distinti).

Hanno spesso costanti catalitiche (Km, Vmax) diverse.

Sono presenti in tessuti diversi (cuore, fegato, ecc.)

Isoenzimi

Glucokinase and Hexokinase are typical examples of isoenzymes.

In fact, there are four Hexokinases: I, II, III and IV. Hexokinase I is present

in all mammalian tissues, and Hexokinase IV (Glucokinase) is found

mainly in liver.

Both enzymes catalyze the phosphorylation of Glucose:

Glucose + ATP Glucose 6 P + ADP

Esochinasi I: È presente in tutte le cellule

Reagisce anche con altri monosaccaridi

Km = 0.1 mM

È indipendente da insulina

Inibita da G6P

Glucochinasi (esochinasi IV): È presente solo nel fegato

Reagisce solo con glucosio (è specifica)

Km = 10 mM

È inducibile con insulina

Non inibita da G6P

x

G6P

È irreversibile

Glucokinase and Hexokinase are typical examples of isoenzymes.

In fact, there are four Hexokinases: I, II, III and IV. Hexokinase I is present

in all mammalian tissues, and Hexokinase IV (Glucokinase) is found

mainly in liver.

Both enzymes catalyze the phosphorylation of Glucose:

Glucose + ATP Glucose 6 P + ADP

Hexokinase I has a low Km and is inhibited by glucose 6 (P).

Glucokinase is not inhibited by Glucose 6 (P) and his Km is high. Since Glucokinase is not inhibited by glucose 6 phosphate, in conditions

of high concentrations of glucose this enzyme continues phosphorylating

glucose, which can be used for glycogen synthesis in liver. Additionally,

since Glucokinase has a high Km, its activity does not compromise the

supply of glucose to other organs; in other words, if Glucokinase had a

low Km, it would continue converting glucose to glucose 6 phosphate in

the liver, making glucose unavailable for other organs (remember that

after meals, glucose arrives first to the liver through the portal system).

Isoenzima H4 nel cuore M4 nel muscolo scheletrico

Lattico Deidrogenasi (LDH) è un tetramero costituito da 2 tipi di subunità (H e M)

33%

45%

1%

3%

18%

Nel s

iero

di in

div

idui s

ani

È un modo per ri-ossidare il NADH

http://www.youtube.com/watch?v=edozxR4Hxjw

In myocardial infarction, total LDH increases, and since heart muscle

contains more LDH1 than LDH2, LDH1 becomes greater than LDH2

between 12 and 24 hours, after the infarction, so the ratio LDH1/LDH2

becomes higher than 1 and will stay flipped for several days.

http://www.youtube.com/watch?v=edozxR4Hxjw

Enzimi nella diagnostica: la creatin chinasi

l’isoenzima CPK2 compare nel siero generalmente 4-8 ore dopo l’episodio acuto

e raggiunge un massimo dopo 24 ore

scompare dal plasma dopo 48 h (degradato)

ATP

Fosforilazione

ossidativa

Glicolisi

anaerobica

Creatina

chinasi

Fosforilazione

a livello del substrato

nel ciclo di Krebs

Adenilato

chinasi

Vie di produzione dell’ATP

Phosphocreatine Creatine

ADP ATP

Creatine

kinase

Phosphocreatine Creatine

ADP ATP

Vie di produzione Substrati Velocità diproduzione di ATP

(mmol/g/s)

ATP ricavabile dallacompletautilizzazione deisubstrati

(mmol/g)

Tempo per la totalescomparsa deisubstrati

Creatina chinasi Fosfocreatina 4.0 30 7.5 s

Glicolisi anaerobia Glicogeno 2.0 100 2.5 min

Fosforilazioneossidativamitocondriale

Glicogeno eglucosio

0.6 100 90 min

Fosforilazioneossidativamitocondriale

Acidi grassi 0.3 12 milioni 83 ore

E. Newsholme, The Biochemist, 14-17, June 1998

0 50 100 150 200 250 300 3500

20

40

60

80

100

Time (sec.)

% o

f to

tal

con

trib

uti

on

to A

TP

pro

duct

ion

fosfocreatina

glicolisi

Fosforilazione ossidativa

Enzimi nella diagnostica: la creatin chinasi

l’isoenzima CPK2 compare nel siero generalmente 4-8 ore dopo l’episodio acuto

e raggiunge un massimo dopo 24 ore

scompare dal plasma dopo 48 h (degradato)

Determinazione spettrofotometrica della creatin chinasi

Sintesi della creatina

CK3

CK2

CK1

CK-MB nella diagnosi dell’infarto acuto

Isoenzimi della CK

L’esempio presentato mostra la separazione elettroforetica di diversi campioni di

plasma su gel di agarosio. Le isoforme sono state rese visibili aggiungendo

direttamente i substrati sulla lastrina ed evidenziando l’NADPH, prodotto dalla

catena di reazioni enzimatiche, in base alla sua fluorescenza. La banda MM3 è in

posizione catodica ed è la più lenta, mentre la banda MB1 è in posizione anodica

ed è quella con maggiore mobilità elettroforetica. Una determinazione

semiquantitativa della concentrazione relativa delle diverse isoforme può essere

ottenuta per mezzo di un fotometro a scansione.

+ anodo - catodo

Proteine mutate nelle

distrofie muscolari

Enzimi nella diagnostica: la g-glutamil trasferasi (GGT)

Enzima presente in tutti i tessuti, particolarmente nel rene e nel fegato,

a livello dei dotti biliari.

[GGT] aumenta:

1) Ostruzione dei dotti biliari

2 ) Abuso cronico di alcol

Negli alcolisti, la GGT sierica aumenta per un meccanismo di induzione

enzimatica, quindi indipendentemente dalla presenza o meno di danno

epatico alcol-correlato (se presente, comunque, l'aumento della GGT è più consistente).

Determinazione spettrofotometrica della GGT

GGT

COO-

COO-

Misura in

bicromatismo

(405 e 600 nm) colorato

Per migliorare il metodo, Persijn studiò i derivati del Glu-4-NA e scoprì che il γ-glutamil-3-

carbossi-4-nitroanilide era superiore al Glu-4-NA dal punto di vista della solubilità e stabilità.

Le fosfatasi sono enzimi che determinano l’idrolisi di

fosfomonoesteri (idrolizzano il legame estereo).

Si distinguono in base al pH ottimale d’azione

ALCALINA (pH 9-10) ACIDA (pH 5)

FOSFATASI ALCALINA (ALP)

ALP è presente soprattutto nel fegato (canalicoli biliari) e nelle

ossa (osteoblasti), placenta e rene.

FOSFATASI ALCALINA (ALP) aumenta nelle:

• affezioni del sistema epato-biliare (poco in cirrosi, epatite);

• Alterazioni della sostanza ossea (rachitismo, metastasi

ossee, Morbo di Paget);

• Iperparatiroidismo

• Patologie infiammatorie croniche intestinali

giallo incolore

pH 10

Determinazione spettrofotometrica della fosfatasi alcalina ALP

CARATTERISTICHE DEI PRINCIPALI ISOENZIMI

DELLA ALP

FOSFATASI ACIDA (ACP)

ACP è presente soprattutto nella prostata, milza rene, globuli

rossi, piastrine

FOSFATASI ACIDA (ACP) aumenta nel:

Carcinoma della prostata

Incolore incolore

pH 5

Determinazione spettrofotometrica della fosfatasi acida ACP

Per determinare l’ACP prostatica si sfrutta la sua caratteristica di essere

inibita da L-tartrato.

Si sottopone campione a dosaggio in assenza e in presenza di L-tartrato e

si misura la differenza tra i due.

ACP prostatica = ACP totale – ACP dopo inibizione con tartrato

Diventa giallo dopo

aggiunta di alcali

Enzimi nella diagnostica: amilasi

Indice di funzionalità pancreatica

Valori 100-300 UI/L

Sono enzimi idrolitici implicati nella scissione dei polisaccaridi

Vengono prodotti in vari organi da cui prendono il nome (isoenzimi):

• salivare (ptialina) presente anche nel sudore, lacrime, liquido amniotico;

• pancreatica, viene rilasciata nell’intestino

AMILASI aumenta nelle:

Pancreatiti acute (livelli 20-30 volte superiore rispetto a

individui sani, raggiunge il massimo dopo 24 h);

Determinazione spettrofotometrica dell’amilasi

Enzimi nella diagnostica: lipasi

Indice di funzionalità pancreatica

Valori 100-300 UI/L

Sono enzimi che catalizzano l’idrolisi dei trigliceridi

Vengono prodotti principalmente dal pancreas

LIPASI aumenta nelle:

Pancreatiti acute (è più specifica dell’amilasi, si libera più

tardivamente e permane più a lungo in circolo);

Determinazione della lipasi

Metodo titrimetrico

Una emulsione di olio d’oliva viene incubata con un campione di

plasma. Gli acidi grassi eventualmente formati vengono titolati

con NaOH (indicatore timolftaleina)

Metodo turbidimetrico

Più rapido e semplice, si basa sul fatto che i grassi in ambiente

acquoso creano un’emulsione.

Enzimi nella diagnostica: la tripsina

Prodotta esclusivamente dalle cellule acinose

pancreatiche.

Si dosa solo con metodi radioimmunologici, il che riduce

la sua applicabilità in emergenza clinica.

I livelli aumentano 5-10 volte nel corso di panceatite

acuta e permangono elevati per 4-5 giorni dall’inizio dei

sintomi.