ENZIMI

Tutti gli enzimi sono PROTEINE che funzionano da catalizzatori

biologici nelle reazioni cellulari (sono in grado di aumentare la

velocità delle reazioni biologiche anche di 1020 volte).

Gli enzimi catalizzano le reazioni con una Specificità molto elevata: quando un enzima funziona correttamente non si formano mai

prodotti secondari di reazione (che potrebbero essere potenzialmente tossici per la cellula)

Durante la reazione l’enzima può essere temporaneamente modificato ma

alla fine del processo ritorna nel suo stato originario, un enzima viene

«riciclato» in modo da poter prendere parte alla stessa reazione numerose

volte.

Affinché un enzima funzioni correttamente è essenziale:1) Che conservi la sua conformazione nativa: struttura proteica tridimensionale biologicamente attiva

2) Condizioni appropriate di temperatura e pH, che influenzano la stabilità della struttura proteica degli enzimi e quindi la loro attività catalitica. Ogni enzima possiede un intervallo ideale di valori di temperatura e pH all’interno del quale è attivo.

3D. Voet, J.G. Voet, C.W. Pratt, Fondamenti di biochimica, Zanichelli editore 2017

3) La presenza di gruppi funzionali specifici che partecipano alla catalisi (quelli delle catene laterali dei suoi residui amminoacidici e/o quelli di cofattori)

CLASSIFICAZIONE DEGLI ENZIMI

1. OSSIDORIDUTTASI (CATALASI, OSSIGENASI, IDROSSILASI, DEIDROGENASI, OSSIDASI, REDUTTASI, PEROSSIDASI)

Reazioni di ossidoriduzione

2. TRASFERASI (TRANSALDOLASI, TRANSCHETOLASI, ACIL-, METIL- GLUSOSIL-, FOSFORIL-TRASFERASI,CHINASI, FOSFOMUTASI)

Reazioni di trasferimento di gruppi chimici da un substrato ad un altro

3. IDROLASI (ESTERASI, GLICOSIDASI, PEPTIDASI, FOSFATASI, TIOLASI, FOSFOLIPASI, AMIDASI,DEAMMINASI, RIBONUCLEASI)

Reazioni di idrolisi, di rottura di legami tramite l’acqua

4. LIASI (DECARBOSSILASI, ALDOLASI, IDRAATSI, DEIDRATASI, SINTASI, LIASI)Reazioni di scissione di un legame C-C, o C-N, o eliminazione di CO2 o di formazione diun nuovo legame

5. ISOMERASI (ISOMERASI, MUTASI, RACEMASI, EPIMERASI)Reazioni di spostamento di un gruppo o di un doppio legame all’interno di una stessamolecola

6. LIGASI (SINTETASI, CARBOSSILASI)Reazioni di formazione di un nuovo legame C-C che richiedono l’intervento dell’ATP

L’enzima partecipa alla reazione che catalizza senza modificare lo stato di equilibrio della reazione. L’enzima non modifica la variazione di energia libera tra reagenti e

prodotti che si verifica durante la reazione.L’enzima accelera i tempi con cui reagenti e prodotti raggiungono l’equilibrio.

ΔG0 = variazione di energia libera della reazione (rende conto della spontaneità dellareazione, non della sua velocità)ΔG0 < 0 = reazione esoergonica (spontanea) (A→B)ΔG0 > 0 = reazione endoergonica (non spontanea) (è spontanea la reazione inversa B→A)

Per es.: A B

GA = Energia libera reagentiGB = Energia libera prodotti

A BΔG1

0‡ = Eatt della reazione direttaΔG-1

0‡ = Eatt della reazione inversa

Affinché avvenga la trasformazione dei reagenti in prodotti è necessario superare

un dislivello energetico: ENERGIA DI ATTIVAZIONE

(ΔG0‡)

STATO DI TRANSIZIONE: è il momento più difficile della reazione, in cui lemolecole sono orientate, avvicinate e subiscono distorsioni,contemporaneamente si rompono alcuni legami e se ne formano degli altri.

È l’energia necessaria a raggiungere e superare lo stato di transizione della reazione.

Ostacoli da superare1) URTI MOLECOLARI2) ORIENTAMENTO3) FORZE REPULSIVE4) DESOLVATAZIONE

L’energia di cui necessitano le molecole di reagente per essere trasformate inprodotto è fornita dalla En. cinetica che le molecole stesse possiedono.

L’En. cinetica è convertita in energia libera G: le molecole di reagente che hannoun’En. cinetica > all’Eatt superano lo STATO DI TRANSIZIONE e si trasformano inprodotto.

Se l’Eatt è BASSA: un gran numero di molecole avrà l’en. cinetica media≥ all’Eatt

Se l’Eatt è ALTA: un piccolo numero di molecole avrà l’en. cinetica media≥ all’Eatt

LA VELOCITÀ DELLA REAZIONE è inversamente proporzionale all’ENERGIA DI ATTIVAZIONE

La reazione sarà VELOCE

La reazione sarà LENTA

8D. Voet, J.G. Voet, C.W. Pratt, Fondamenti di biochimica, Zanichelli editore 2017

Cosa cambia in una reazione catalizzata?

L’ENZIMA AGISCE ABBASSANDO L’ENERGIA DI ATTIVAZIONE Modifica il meccanismo della reazione e crea un ambiente in cui i reagenti nonincontrano ostacoli alla reazione. Promuove direttamente l’evento cataliticorilasciando il prodotto e ritornando inalterato nel suo stato originario.

E + S

ΔG0‡ ES

ES‡

ES

EP‡

ΔG0‡ EP

E + P

S‡ (in assenza di enzima)

Stato intermedio della reazione che si trova ad un minimo energetico

Substrato(reagente)

ProdottoComplesso

Enzima/substrato

Complessi transitori

S + E ES E + P

S + E ES E + PS + E ES E + P

L’interazione fra enzima e substrato (o più substrati) è reversibile. La formazione del complesso ES comporta il legame fra il SITO ATTIVO

dell’enzima e il substrato/i.

Tasca della proteina in cui sporgono le catene laterali di alcuni residuiamminoacidici che costituiscono il sito di legame per il substrato (responsabiledella specificità) e di altri residui amminoacidici, o cofattori che costituiscono il sitocatalitico (responsabile dell’evento catalitico)

La formazione di legami fra il sito attivo dell’enzima e il substrato è un processo esoergonico: libera ENERGIA DI LEGAME che va ad abbassare

la barriera costituita dall’Enatt.

COMPLESSO ENZIMA-SUBSTRATO

EP

Quando il substrato si lega al sito attivo dell’enzima (ES), viene bloccato nella corretta posizione

(La specificità di legame fa si che il complesso ES si formi molto facilmente).

S = substrato da scindere

stato di transizione

Il substrato viene desolvatato e nel sito attivo subisce distorsioni in modo che gli atomi che

devono reagire sono avvicinati.

Le interazioni fra sito attivo di un enzima e substrato diventano ottimali

solo quando è raggiunto lo stato di transizione del passaggio ES → E + P

6 | 12Nelson • Cox, I PRINCIPI DI BIOCHIMICA DI LEHNINGER, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2014

Se il sito attivo fosse perfettamente complementare al substrato la reazione non procederebbe

Substrato

La specificità del legame enzima/substrato può essere spiegata col modello chiave-serratura di Fisher

Il sito attivo possiede dei punti di ancoraggio specifici per i gruppi funzionali del substrato

Il potere catalitico di un enzima può essere spiegato col modello dell’adattamento indotto di Koshland

L’enzima ha un sito che può alloggiare in modo specifico un substratoma questo sito diventacomplementare al substratosolo nello stato di transizionee solo attraverso uncambiamento conformazionaledell’enzima stesso

Quando si forma il complesso ES, nel distorcere il substrato, l’enzimastesso cambia conformazione adattando perfettamente la forma delsito catalitico allo stato di transizione del substrato e presentando adesso i suoi gruppi catalitici.

esochinasi (è una trasferasi: trasferisce sul C-6 del glucosio un gruppo fosfato donato dall’ATP e produce glucosio-6-fosfato)

velocità di reazione

Effetto della temperatura sulla velocità di una reazione enzimatica

Optimum di temperatura: è diverso per i diversi enzimi

La velocità di reazione aumenta all’aumentare della temperatura sino a raggiungere un valore massimo (Mantenendo costanti pH, [E] e [S])

A T° superiori a quella ottimale:

- sono alterate le interazioni che consentono la formazione di ES;

- l’enzima va incontro a modificazioni strutturali del

sito attivo (rottura dei legami deboli, denaturazione)

Temperatura (C°)

Effetto del pH sulla velocità di una reazione enzimatica

Da ricollegare al diverso stato di protonazione delle catene laterali di residui amminoacidici che costituiscono il sito catalitico e il sito di legame per il substrato.

Vel

oci

tà d

i rea

zio

ne

CINETICA ENZIMATICAGli esperimenti di cinetica enzimatica si basano sulla determinazione della velocità

di reazione, misurata come variazioni della concentrazione del prodotto o del reagente in un dato intervallo di tempo.

S → P[P] = aumenta nel tempo[S]= diminuisce nel tempo

v = Δ[P] = _ Δ[S]Δt Δt

v = Δ[P] = _ Δ[S]Δt Δt

All’inizio della reazione la velocità è molto elevata. Ma col procedere della reazione le curve cinetiche si appiattiscono: la velocità

non subisce variazioni. S è consumato perché trasformato in P e la reazione tenderà a

raggiungere l’equilibrio.

[S] [P]

S → P v = Δ[P] = _ Δ[S]Δt Δt

v = Δ[P] = _ Δ[S]Δt Δt

Problema: se miscelo un enzima con diverseconcentrazioni di substrato (5, 10 o 20 mM,per es…), come varia la velocità dellareazione alle diverse concentrazioni disubstrato utilizzate?

[P][S] =5 mM

[P][S] =10 mM[P][S] =20 mM

Tempo (min)5 10 15 20 25 30 35 40 45

Tempo (min)5 10 15 20 25 30 35 40 45

Tempo (min)5 10 15 20 25 30 35 40 45

Devo misurare la velocità della reazione alMOMENTO INIZIALE (entro i primi 30-50 sec),quando la quantità di prodotto formato è moltobassa e la concentrazione del substrato ha unvalore preciso e noto (quello iniziale stabilito dallosperimentatore).

In questo modo posso associare al valore di [S] utilizzata un dato valore di V0 (velocità iniziale)

tempo

[P][S]La velocità della reazione aumenta

all’aumentare della [S], ma per avere un valore preciso devo considerare la VELOCITA’

INIZIALE di reazione

Substrato [S] = 1 mM

enzimaProdotto

v = Δ[P] = _ Δ[S]Δt Δt

v = Δ[P] = _ Δ[S]Δt Δt

[S] = 1 mM

[S] = 5 mM

Substrato [S] = 5 mM

Substrato [S] = 2 mM

[S] = 2 mM

Studio di una reazione enzimatica semplice (1 solo substrato e 1 solo stadio intermedio):1) miscelo l’enzima con il suo substrato, lavoro a temperatura e pH costanti,2) Preparo un certo numero di miscele di reazione in cui la [E] è inalterata, ma la [S] è

diversa: per ogni esperimento misuro come varia la concentrazione del prodotto che siforma nel tempo.

COME DETERMINO LA VELOCITA’ INIZIALE?

v = Δ[P] = _ Δ[S]Δt Δt

v = Δ[P] = _ Δ[S]Δt Δt

-1/Δt = k(costante di

velocità specifica per ogni reazione)

-Reazione di 1°ordine-

3) Osservo che a velocità di reazione aumenta all’aumentare della concentrazionedel substrato utilizzata come in una reazione di 1° ordine.

v = k [S]

v = Δ[P] = _ Δ[S]Δt Δt

v = Δ[P] = _ Δ[S]Δt Δt

v0 (3)

(4)

v0 (2)

v0 (1)

- La v0 aumenta all’aumentare della concentrazione di reagente[Substrato] usata per la reazione.- La dipendenza di v0 dalla [S] è descritta da una curva iperbolica(Modello cinetico di Micaelis-Menten)

VELOCITA’ INIZIALE (v0) è calcolata come pendenza della tangente alla curva cinetica.Per ognuna delle curve cinetiche ottenute a diverse [S] viene calcolata la v0

4) Calcolo il valore della velocità di reazione nello stadio iniziale (v0) alle diverse [S].

Ogni punto rappresenta un diverso esperimento, ed è definito da due parametri: v0 e [S]

Leonor Micaelis1875-1949

Maud Menten1879-1960

ENZIMI CHE SEGUONO IL MODELLO CINETICO DI MICHAELIS-MENTEN

Mostrano una dipendenza della velocità iniziale (v0) dalla concentrazione di substrato di tipo IPERBOLICO.

Catalizzano una reazione enzimatica che nel caso più semplice prevede:1 prima tappa veloce e reversibile (ΔG‡ minore e k maggiore)

S + E ES

1 seconda tappa lenta e irreversibile (ΔG‡ maggiore e k minore) che determina la velocità globale di reazione

ES E + P

k1

k-1

k2

k-2

k1 = cost cinetica reazione di formazione del complesso ESk-1 = cost cinetica reazione di decomposizione del complesso ES in E + Sk2 = cost cinetica reazione di decomposizione del complesso ES in E + Pk-2 = talmente piccola da essere trascurabile

Inserendo in un grafico i valori di v0 ottenuti per le diverse [S] utilizzate ottengo una curva iperbolica

Concentrazione substrato [S] (mM) V

elo

cità

iniz

iale

v0

(μM

/min

)

Alte [S] = la v0 non varia molto alvariare di [S], l’enzima è quasicompletamente saturato, vieneraggiunta asintoticamente una velocitàdi reazione massima. La v0 nondipende più da [S].

Basse [S] = la velocità di reazione v0dipende strettamente dalla [S],aumenta all’aumentare della [S]

Posso spiegare questo comportamento con un’equazione che correla la v0 alla [S], alla Vmax e ad una costante di affinità (Km)

S + E ES E + Pk1k-1

k2S + E ES E + Pk1k-1

k2S + E ES E + PS + E ES E + Pk1k-1

k21a tappa: Passaggio rapido

2a tappa: Passaggio lento

v = k2 [ES]

La v0 GLOBALE della reazione enzimatica dipende da [ES]

v = k1 [E] [S]

v = k-1 [ES]

v0 = k2 [ES]Questa equazione non è sufficiente a spiegare la relazione iperbolica esistente tra v0 e [S].

[ES] = non è facilmentemisurabile, e k2 non è nota

Bisogna ricavare un’equazione alternativa partendo dalla considerazione che la [ES] rimane costante nel tempo della reazione, e che la 1a tappa della reazione enzimatica raggiunge rapidamente lo STATO STAZIONARIO

S + E ESk1

k-1

S + E ESk1

k-1

k1

k-1

STATO STAZIONARIO

La concentrazione dell’enzima libero[E] in soluzione diminuisce manmano che va a formare il complesso[ES].

Ma poiché il complesso ES èdemolito continuamente (in E + S o inE + P), l’ENZIMA è di nuovo resolibero.

COMPLESSIVAMENTE [ES] RIMANE COSTANTE NEL TEMPO

Tempo

[P][S]

[ES]

[E]

[E] = [E]TOT – [ES] poiché la concentrazione TOTALE di Enzima è [E]TOT = [E] + [ES]

Velocità di Formazione di ES (E + S → ES): V = k1 [E] [S] = k1 ([E]TOT—[ES]) [S]

[ES] rimane costante: la velocità della sua formazione è uguale alla velocità della sua demolizione

S + E ES E + Pk1k-1

k2S + E ES E + Pk1k-1

k2S + E ES E + PS + E ES E + Pk1k-1

k2

Velocità di Demolizione di ES (ES → S + E …..ES → P + E): V = k-1 [ES] + k2 [ES]V = [ES] (k-1 + k2 )

V formazione ES = V demolizione ES

k1 ([E]TOT—[ES]) [S] = [ES] (k-1 + k2 )

Riarrangiando l’equazione tramite operazioni algebriche si ottiene che:

Se è raggiunto lo stato stazionario posso dire che:

([E]TOT — [ES]) [S] = ( k-1 + k2)[ES] k1

k-1 + k2k1

Costante di Michaelis-Menten

Km =

Il rapporto fra le costanti cinetiche della dissociazione di ES e quella della sua

formazione è uguale alla COSTANTE DI DISSOCIAZIONE DEL COMPLESSO ES

k-1 + k2k1

Costante di Michaelis-Menten

Km =

Semplificando i termini dell’equazione precedente si ottiene che:

[ES] Km = [E]TOT [S] — [ES][S]

[E]TOT [S][ES] =

[S] + Km

[ES] Km + [ES][S] = [E]TOT [S]

[ES] (Km +[S]) = [E]TOT [S]

[E]TOT [S] — [ES][S] = [ES] Km

([E]TOT — [ES]) [S] = Km[ES]

[E]TOT [S][ES] =

[S] + Km

Poiché la v0 globale di reazione è :

v0 = k2 [ES] e quindi:[ES] = v0 / k2

k2[E]TOT [S]v0 =

[S] + Km

k2 [E]TOT = Vmax

Introduciamo un altro parametro importante: la Velocità massima di reazione. Quando sono presenti nella miscela di reazione concentrazioni saturanti di

substrato, allora, tutto l’enzima è complessato col substrato e la [E]TOT = [ES]La velocità globale di reazione non dipende più dalla concentrazione di

substrato, ma solo dalla concentrazione totale dell’enzima:

v0 = k2 [ES] diventa Vmax = k2 [E]TOT

Il valore della Km si può determinaresperimentalmente = Corrisponde alla[S] alla quale raggiungo la metà dellaVmax. Ha le unità di misura di unaconcentrazione

[S] (mM)

v 0(μ

M/m

in)

Equazione di Michaelis-Menten

La velocità iniziale della reazione enzimatica dipende dalla [S] in modo iperbolico ed è correlata allaVmax (= k2[E]tot) e alla Km

v0 = ½ VmaxKm + [S] = 2 [S]

Km = [S]

Vmax [S]v0 =

Km + [S]

Vmax [S]v0 =

Km + [S]

S + E ES E + Pk1

k-1

k2S + E ES E + Pk1

k-1

k2S + E ES E + PS + E ES E + Pk1

k-1

k2

Vmax [S]=

[S] + Km

Vmax [S]=

[S] + Km

1 [S]=

2 [S] + Km

1 [S]=

2 [S] + KmSolo se v0 = ½ Vmax

La Km fornisce informazioni sull’affinità che un enzima ha nei confronti del suo substrato ed è SPECIFICA per ogni diverso enzima nei confronti di un dato substrato.Più è grande, minore sarà l’affinità dell’enzima per il substrato (maggiore sarà la costante di dissociazione del complesso ES, k-1 > k1)

Più è piccola maggiore sarà l’affinità (minore la costante di dissociazione di ES, k1 > k-1)

k-1Km =

k1

k-1Km =

k1

(k2

Berg et al., BIOCHIMICA 6/E, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2007

La Km fornisce informazioni sulla efficienza della catalisi e sul controllo della velocitàse [S] >> 10 Km → concentrazioni saturanti di substrato, la reazione è molto efficienteperché quasi a Vmax, ma non controllabile variando la [S]se [S] > 10 Km

[S]