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ADE 2008-09
Seminario 0.2 crediti(0.1 credito/h)
Dott. Giorgio Giardina
Metodi di determinazionedella struttura delle proteine:Biocristallografia
1martedì 31 marzo 2009
2
Osservare la MATERIA
The Large Hadron Collider at CERNALMA observatory
2martedì 31 marzo 2009
Osservare la MATERIA
3martedì 31 marzo 2009
Scopi della biologia
• Dettaglio atomico delle reazioni biologiche
• Relazioni tra struttura e funzione
• Comprensione dei processi biologici in sede normale, pre-patologica e patologica
• Disegno di farmaci basati sulla struttura
4martedì 31 marzo 2009
Metodologie
• Microscopia a forza atomica (AFM)
• Microscopia elettronica
• Risonanza magnetica nucleare (NMR)
• Cristallografia a raggi X
5martedì 31 marzo 2009
Piano del-l’immagine
Piano focale, contenente l’immagine di diffrazione
Immagine dell’oggetto
Formazione di un’immagine otticaL’immagine dell’oggetto e l’immagine di diffrazione sono in relazione tra di loro tramite una trasformata di Fourier
6martedì 31 marzo 2009
Piano del-l’immagine
Piano focale, contenente l’immagine di diffrazione
Immagine dell’oggetto
Formazione di un’immagine otticaL’immagine dell’oggetto e l’immagine di diffrazione sono in relazione tra di loro tramite una trasformata di Fourier
Ora, separiamo la lente in due metà:
Immagine dell’oggetto(diffrazione di una diffrazione)
Piano focale, contenente l’immagine di diffrazione
Trasformata di Fourier “fisica”
Trasformata di Fourier “matematica”
L1 L2
6martedì 31 marzo 2009
Piano del-l’immagine
Piano focale, contenente l’immagine di diffrazione
Immagine dell’oggetto
Formazione di un’immagine otticaL’immagine dell’oggetto e l’immagine di diffrazione sono in relazione tra di loro tramite una trasformata di Fourier
Ora, separiamo la lente in due metà:
Immagine dell’oggetto(diffrazione di una diffrazione)
Piano focale, contenente l’immagine di diffrazione
Trasformata di Fourier “fisica”
Trasformata di Fourier “matematica”
L1 L2
L’immagine dell’oggetto è una TF della diffrazione La diffrazione è una TF dell’oggetto
6martedì 31 marzo 2009
Microscopia aforza atomica (AFM)
• Tecnica nanoscopica per studiare la morfologia di macromolecole biologiche in condizioni fisiologiche
• Modo d’azione: una punta (max. 50 nm) scansiona il campioneimmagine topografica
7martedì 31 marzo 2009
Microscopia aforza atomica (AFM)
• Tecnica nanoscopica per studiare la morfologia di macromolecole biologiche in condizioni fisiologiche
• Modo d’azione: una punta (max. 50 nm) scansiona il campioneimmagine topografica
20µm
7martedì 31 marzo 2009
Microscopia aforza atomica (AFM)
• Tecnica nanoscopica per studiare la morfologia di macromolecole biologiche in condizioni fisiologiche
• Modo d’azione: una punta (max. 50 nm) scansiona il campioneimmagine topografica
20µm
7martedì 31 marzo 2009
Microscopia aforza atomica (AFM)• Misura le proprietà chimico-
fisiche del campioneforze interatomicheMagneticheelettrostatiche
• Capace di monitorare quantitativamente le reazioni biochimiche
8martedì 31 marzo 2009
Microscopia aforza atomica (AFM)• Misura le proprietà chimico-
fisiche del campioneforze interatomicheMagneticheelettrostatiche
• Capace di monitorare quantitativamente le reazioni biochimiche
8martedì 31 marzo 2009
Microscopia aforza atomica (AFM)• Misura le proprietà chimico-
fisiche del campioneforze interatomicheMagneticheelettrostatiche
• Capace di monitorare quantitativamente le reazioni biochimiche
PROBE SCANNING MICRISCOPY AFM, atomic force microscopy o Contact AFM o Non-contact AFM o Dynamic contact AFM o Tapping AFM * BEEM, ballistic electron emission microscopy * EFM, electrostatic force microscope * ESTM electrochemical scanning tunneling microscope * FMM, force modulation microscopy * KPFM, kelvin probe force microscopy * MFM, magnetic force microscopy * MRFM, magnetic resonance force microscopy * NSOM, near-field scanning optical microscopy * PFM, Piezo Force Microscopy * PSTM, photon scanning tunneling microscopy * PTMS, photothermal microspectroscopy/microscopy * SAP, scanning atom probe [5] * SECM, scanning electrochemical microscopy * SCM, scanning capacitance microscopy * SGM, scanning gate microscopy * SICM, scanning ion-conductance microscopy * SPSM spin polarized scanning tunneling microscopy * SThM, scanning thermal microscopy[2] * STM, scanning tunneling microscopy * SVM, scanning voltage microscopy * SHPM, scanning Hall probe microscopy * SSM, Scanning SQUID microscope
8martedì 31 marzo 2009
Microscopia a forza atomica (AFM)
Ompf channel proteins open/closedEritrociti + antibiotico
9martedì 31 marzo 2009
Microscopia Elettronica (EM)
• Permette lo studio di cellule, strutture subcellulari, particelle virali, macromolecole e complessi macromolecolari con massa > 200kDa
• Il campione viene visualizzato direttamente perché i fasci di elettroni possono essere focalizzati da lenti elettromagnetiche
• È la tecnica elettiva per proteine di membrana e complessi supramolecolari non adatti per analisi NMR o raggiX
10martedì 31 marzo 2009
Drosofila
Cellula tumorale
E. coli
Microscopia Elettronica (EM)
11martedì 31 marzo 2009
Cryo Electron Microscopy (EM)
12martedì 31 marzo 2009
HIV-1 envelope spikes
Human copper
transporter
acquaporina umana
Cryo Electron Microscopy (EM)
12martedì 31 marzo 2009
Risonanza Magnetica Nucleare
• Tecnica spettroscopica per lo studio della struttura di macromolecole a risoluzione atomica
• È basata sull’interazione dei singoli nuclei atomici magneticamente attivi - 1H, 15N, 13C e 31P - con il campo magnetico esterno e con i campi magnetici dei nuclei adiacenti
13martedì 31 marzo 2009
Risonanza Magnetica Nucleare
• Tecnica spettroscopica per lo studio della struttura di macromolecole a risoluzione atomica
• È basata sull’interazione dei singoli nuclei atomici magneticamente attivi - 1H, 15N, 13C e 31P - con il campo magnetico esterno e con i campi magnetici dei nuclei adiacenti
13martedì 31 marzo 2009
NMR: un esperimento tipo
14martedì 31 marzo 2009
(800 MHz) NMR spectrometer
Risonanza Magnetica Nucleare
• Il campione viene analizzato in soluzione e in condizioni fisiologiche
• L’immagine 3D non è diretta, ma ricostruita
• Limitata a campioni ≤50kDa
• Produce informazioni di:– dinamica– conformazioni– folding– interazioni intermolecolari
15martedì 31 marzo 2009
(800 MHz) NMR spectrometer
campione
Risonanza Magnetica Nucleare
• Il campione viene analizzato in soluzione e in condizioni fisiologiche
• L’immagine 3D non è diretta, ma ricostruita
• Limitata a campioni ≤50kDa
• Produce informazioni di:– dinamica– conformazioni– folding– interazioni intermolecolari
15martedì 31 marzo 2009
Risonanza Magnetica Nucleare
• Il campione viene analizzato in soluzione e in condizioni fisiologiche
• L’immagine 3D non è diretta, ma ricostruita
• Limitata a campioni ≤50kDa
• Produce informazioni di:– dinamica– conformazioni– folding– interazioni intermolecolari
16martedì 31 marzo 2009
Risonanza Magnetica Nucleare
• Il campione viene analizzato in soluzione e in condizioni fisiologiche
• L’immagine 3D non è diretta, ma ricostruita
• Limitata a campioni ≤50kDa
• Produce informazioni di:– dinamica– conformazioni– folding– interazioni intermolecolari
16martedì 31 marzo 2009
Cristallografia a raggi X
• Attualmente tecnica di elezione per la determinazione di strutture 3D a risoluzione atomica
• Tecnica indiretta: l’immagine va ricostruita
• Non ci sono limitazioni nelle dimensioni delle macromolecole
• Svantaggi:– cristalli singoli– altamente ordinati– ragionevolmente grandi (80-100µM)
17martedì 31 marzo 2009
Perché i raggi X?
Per poter visualizzare due oggetti come entità separate, la lunghezza d’onda della radiazione
elettromagnetica deve essere dello stesso ordine di grandezza della distanza tra gli oggetti
distanza interatomica ≈1Å (10 nm)
λraggiX= 0.1÷2Å
⇒ con i raggiX “vedo” gli atomi
Cristallografia a raggi X
18martedì 31 marzo 2009
Perché cristallografia e non miscroscopia a raggiX ?
Non esistono lenti in grado di focalizzare i raggiX ⇒ la matematica ci viene in aiuto
Cristallografia a raggi X
19martedì 31 marzo 2009
Visione d’insieme del processo
ProteinCrystal Collection
FFT
X-ray beam
Cristallografia a raggi X
20martedì 31 marzo 2009
Visione d’insieme del processo
ProteinCrystal Collection
FFT
X-ray beam
Cristallografia a raggi X
Cristallizzazione
20martedì 31 marzo 2009
Visione d’insieme del processo
ProteinCrystal Collection
FFT
X-ray beam
Cristallografia a raggi X
Cristallizzazione
Diffrazione dei Raggi X
20martedì 31 marzo 2009
Visione d’insieme del processo
ProteinCrystal Collection
FFT
X-ray beam
Cristallografia a raggi X
CristallizzazioneRisoluzione della struttura e affinamento
Diffrazione dei Raggi X
20martedì 31 marzo 2009
… perché un cristallo?
ab
c
abc
Cristallografia a raggi X
21martedì 31 marzo 2009
… perché un cristallo?
ab
c
abc
L’immagine di diffrazione da una singola molecola si forma per interazione dei raggi X con gli elettroni degli atomi della molecola,
Cristallografia a raggi X
21martedì 31 marzo 2009
… perché un cristallo?
MA: - è troppo debole (↓segnale/rumore) - impossibile separarla dalla radiazione di fondo (aria + soluzione)
⇒ è praticamente impossibile ricostruire la molecola
ab
c
abc
L’immagine di diffrazione da una singola molecola si forma per interazione dei raggi X con gli elettroni degli atomi della molecola,
Cristallografia a raggi X
21martedì 31 marzo 2009
… perché un cristallo?
MA: - è troppo debole (↓segnale/rumore) - impossibile separarla dalla radiazione di fondo (aria + soluzione)
⇒ è praticamente impossibile ricostruire la molecola
ab
c
abc
In un cristallo, miliardi di molecole sono disposte in modo ripetuto e ordinato nelle tre dimensioni
L’immagine di diffrazione da una singola molecola si forma per interazione dei raggi X con gli elettroni degli atomi della molecola,
Cristallografia a raggi X
21martedì 31 marzo 2009
… perché un cristallo?
MA: - è troppo debole (↓segnale/rumore) - impossibile separarla dalla radiazione di fondo (aria + soluzione)
⇒ è praticamente impossibile ricostruire la molecola
ab
c
abc
In un cristallo, miliardi di molecole sono disposte in modo ripetuto e ordinato nelle tre dimensioni
Cristallo ≡ amplificatore del segnale
⇒ buone immagini di diffrazione (↑segnale/rumore)
⇒ si può ricostruire la molecola
L’immagine di diffrazione da una singola molecola si forma per interazione dei raggi X con gli elettroni degli atomi della molecola,
Cristallografia a raggi X
21martedì 31 marzo 2009
Come si formano i cristalli
Processo di nucleazione: aggregazione lenta e ordinata delle macromolecole in un reticolo cristallino con esclusione del solvente
ΔG = ΔH - TΔS
La cristallizzazione è un processo spontaneo, con un fattore entropico sfavorevole e interazioni molecolari altamente favorite
Soluzione sottosatura
Soluzione sovrasatura
Zona metastabile
Legenda del diagramma di fase: precipitato amorfo; nucleazione; crescita
Curva di saturazione
[agente precipitante]
[pro
tein
a]Cristallografia a raggi X
22martedì 31 marzo 2009
Cristalli
Cristallografia a raggi X
23martedì 31 marzo 2009
Abbiamo ottenuto cristalli … e poi?Raccolta dati
Temperatura ambiente (293-298K)
Temperature criogeniche (50 - 100K)
Il cristallo viene montato in un capillare di quarzo
Il cristallo, protetto con un anticongelante, viene montato in un loop di nylon e raffreddato sotto flusso di N2 alla T=100 K
Cristallografia a raggi X
24martedì 31 marzo 2009
Raccolta dati
Lunghezza d’onda fissaλ(Cukα) = 1.5486Å
Lunghezza d’onda fissa e/o variabile
Anodo rotante
Sincrotrone
• bassa intensità raggio diretto• tempi di esposizione lunghi (giorni)• basso danno radiologico (a temperature criogeniche)
• intensità 100-1000 maggiore• tempi di esposizione brevi (da 30 minuti a 2-3 ore)• alto danno radiologico• λ modulabile
Cristallografia a raggi X
25martedì 31 marzo 2009
Raccolta dati
Lunghezza d’onda fissaλ(Cukα) = 1.5486Å
Lunghezza d’onda fissa e/o variabile
Anodo rotante
Sincrotrone
• bassa intensità raggio diretto• tempi di esposizione lunghi (giorni)• basso danno radiologico (a temperature criogeniche)
• intensità 100-1000 maggiore• tempi di esposizione brevi (da 30 minuti a 2-3 ore)• alto danno radiologico• λ modulabile
Cristallografia a raggi X
25martedì 31 marzo 2009
Le Onde elettromagnetiche sono funzioni periodiche
f (t)=Asin(kr+2πt/T+φ)A=ampiezzaΦ=faseΤ=periodo
Ι raggi X sono onde elettromagneticheCon lunghezze d’onda nel seguente intervalloλ= 0.1÷5Å
Onda elettromagnetica
Cristallografia a raggi X
26martedì 31 marzo 2009
Le Onde elettromagnetiche sono funzioni periodiche
f (t)=Asin(kr+2πt/T+φ)A=ampiezzaΦ=faseΤ=periodo
Ι raggi X sono onde elettromagneticheCon lunghezze d’onda nel seguente intervalloλ= 0.1÷5Å
Onda elettromagnetica
Cristallografia a raggi X
26martedì 31 marzo 2009
Le Onde elettromagnetiche sono funzioni periodiche
f (t)=Asin(kr+2πt/T+φ)A=ampiezzaΦ=faseΤ=periodo
Ι raggi X sono onde elettromagneticheCon lunghezze d’onda nel seguente intervalloλ= 0.1÷5Å
Onda elettromagnetica
Cristallografia a raggi X
26martedì 31 marzo 2009
Diffrazione di un’onda elettromagnetica
Se le onde diffratte sono in fase avremoUn’interferenza costruttiva (le ampiezze si sommano)
Se le onde diffratte non sono in fase avremoun’interferenza costruttiva (le ampiezze si ssottraggono)
27martedì 31 marzo 2009
Diffrazione di un’onda elettromagnetica
Se le onde diffratte sono in fase avremoUn’interferenza costruttiva (le ampiezze si sommano)
Se le onde diffratte non sono in fase avremoun’interferenza costruttiva (le ampiezze si ssottraggono)
27martedì 31 marzo 2009
Diffrazione di un’onda elettromagnetica
Se le onde diffratte sono in fase avremoUn’interferenza costruttiva (le ampiezze si sommano)
Se le onde diffratte non sono in fase avremoun’interferenza costruttiva (le ampiezze si ssottraggono)
27martedì 31 marzo 2009
Legge di Bragg
•La differenza di cammino tra l’onda 1 e l’onda 2 è = CB+BD•L’interferenza costruttiva ci sarà solo quando: CB+BD=2CB=nλ•Poiché CB=dsenθ allora avremo:
2d senθ=nλ (Legge di Bragg)Dato un reticolo di piani che distano d e la lunghezza d’onda dell’onda incidentePotrò avere interferenza costruttiva solo per certi valori dell’angolo teta
Immagine di diffrazione
n=1,2,3,4…
28martedì 31 marzo 2009
Immagine di diffrazione
Cristallografia a raggi X
29martedì 31 marzo 2009
Posso calcolare la densità elettronica?
Ampiezza dei fattori di struttura (I = |F|2)Fase dei fattori di struttura, persa durante l’esperimento
Cristallografia a raggi X
30martedì 31 marzo 2009
Posso calcolare la densità elettronica?
Ampiezza dei fattori di struttura (I = |F|2)Fase dei fattori di struttura, persa durante l’esperimento
NO
Cristallografia a raggi X
30martedì 31 marzo 2009
Posso calcolare la densità elettronica?
Ampiezza dei fattori di struttura (I = |F|2)Fase dei fattori di struttura, persa durante l’esperimento
• Sperimentalmente misuriamo le intensità delle onde diffratte dagli atomi nel reticolo cristallino.• La densità elettronica nel punto (xyz) è data dalla risultante di tutte le onde diffratte dal piano (hkl) nel cristallo, la cui ampiezza dipende dal numero di elettroni presenti e la cui fase dipende dalla somma delle fasi.
NO
Cristallografia a raggi X
30martedì 31 marzo 2009
Abbiamo ottenuto le MAPPE … e poi?
Densità iniziale
Cristallografia a raggi X
31martedì 31 marzo 2009
Abbiamo ottenuto le MAPPE … e poi?
Densità iniziale
+
Interpretazione
Cristallografia a raggi X
31martedì 31 marzo 2009
Abbiamo ottenuto le MAPPE … e poi?
Densità iniziale
+
Interpretazione
=
Struttura 3D finale
Cristallografia a raggi X
31martedì 31 marzo 2009
• La qualitá delle MAPPE dipende dalla risoluzione.
• La risoluzione dipende dalla qualitá dei cristalli.
Cristallografia a raggi X
32martedì 31 marzo 2009
• La qualitá delle MAPPE dipende dalla risoluzione.
• La risoluzione dipende dalla qualitá dei cristalli.
Cristallografia a raggi X
32martedì 31 marzo 2009
OK ho la STRUTTURA…
…e adesso?
33martedì 31 marzo 2009
⇒
Estrazione dell’informazione biologica dai dati strutturali
Cristallografia a raggi X
34martedì 31 marzo 2009
Un esempio: il complessodell’ATP sintasi mitocondriale
NADHDeidro-genasi
CytC - QOssido
reduttasi
CytCossidasi
ATPsintasi
SuccinatoDeidro-genasi
Matrice
Spazio intermembrana
C
35martedì 31 marzo 2009
Un esempio: il complessodell’ATP sintasi mitocondriale
Il V complesso della catena respiratoria utilizza il gradiente protonico, generato dagli altri complessi, per sintetizzare ATP:
ADP + Pi + 1/2 O2 + 2H+ + 2e- → ATP + H2O
NADHDeidro-genasi
CytC - QOssido
reduttasi
CytCossidasi
ATPsintasi
SuccinatoDeidro-genasi
Matrice
Spazio intermembrana
C
35martedì 31 marzo 2009
matrice
F1
Ricostruzione a bassa risoluzione del complesso
Prima della cristallografia:Microscopia elettronica
dell’ATP sintasi mitocondriale
36martedì 31 marzo 2009
La biocristallografia ha svelato la struttura atomica di tutte le subunità di F0 e F1
F0
F1
37martedì 31 marzo 2009
Cristalli di F1 in presenza e in assenza di ADP e ATP hanno chiarito il meccanismo di azione
T
O
L
38martedì 31 marzo 2009
39martedì 31 marzo 2009
39martedì 31 marzo 2009
40martedì 31 marzo 2009
40martedì 31 marzo 2009
Un esempio pratico:la proteasi del virus HIV
41martedì 31 marzo 2009
42
42martedì 31 marzo 2009
Enzima omodimerico: ogni monomero ha 99 ammino acidi
Residui catalitici: Asp 29 e 30
Un esempio pratico:la proteasi del virus HIV
43martedì 31 marzo 2009
La cavità centrale è ampiapuò legare un polipeptide in conformazione estesa
Un esempio pratico:la proteasi del virus HIV
44martedì 31 marzo 2009
Com’è stata utilizzata l’informazione strutturale?
La tasca è stata “riempita” con analoghi non idrolizzabili del substrato:inibitori competitivi altamente specifici e selettivi
KNI577
45martedì 31 marzo 2009
46
46martedì 31 marzo 2009
Com’è stata utilizzata l’informazione strutturale?
nuova generazione di farmaci “intelligenti” con pochi effetti collaterali inibitori non competitivi altamente specifici e selettivi
AB-2
47martedì 31 marzo 2009
Replicazione del HIV
48martedì 31 marzo 2009
Replicazione del HIV
48martedì 31 marzo 2009