INGEGNERIA PROTEICA - SCOPI PRINCIPALI

(A) CARATTERIZZAZIONE PROTEINE NATURALI

(B)MODULAZIONE ATTIVITA’ PROTEINE NATURALI

(C) INTRODUZIONE DI NUOVE FUNZIONI IN PROTEINE NATURALI

(D) PROTEINE ARTIFICIALI

IN GENERALE: INTRODURREUNA NUOVA FUNZIONE E’SEMPRE PIU’ COMPLESSO CHEELIMINARNE UNAPRE- ESISTENTE

L’EFFETTO DI UNA MUTAZIONEDIPENDE DAL CONTESTO

–Posizione di superficie o interna–Tipo di struttura secondaria–Residui vicini

•L’effetto dipende da una combinazionedi questi fattori

STRATEGIE DI INGEGNERIA DELLE PROTEINE

DISEGNO RAZIONALE EVOLUZIONE GUIDATA

Le variazioni vengonointrodotte singolarmente o

in piccoli gruppi sullabase di informazioni

strutturali e/o funzionali

Le variazioni vengono introdotte permutagenesi casuale di una sequenza (genotipo)e si seleziona la funzione (fenotipo)voluta con metodi vari

BIOINFORMATICAAnalisi di sequenze similiPrevisione effetto della mutazione

Strutturaprimaria sequenza di aminoacidi

secondaria α-elica, β-foglietto, turn, random coil

Terziaria 3D (cristallografia, NMR)

Si basa sulla conoscenza dettagliata delle relazioni struttura-funzione

FunzioneSito attivo aminoacidi coinvolti & co-fattore

Catalisi meccanismo, specificità & cinetica

Regolazione Inibitori & effettori allosterici

DISEGNO RAZIONALE DI PROTEINE - IL CASO DI UN ENZIMA

INGEGNERIA DI ENZIMI

1. Specificità di substrato2. Richiesta di cofattori3. Stereochimica di reazione4. Catalisi

SONO VALIDI I PRINCIPI BIOCHIMICIGENERALI DEL RICONOSCIMENTOMOLECOLARE

E DELLA CATALISI ENZIMATICA

1. Classi di enzimi modificati:Ossido-reduttasiIdrolasiTrasferasiEnzimi di restrizione

Specificità di substrato : LATTICO DEIDROGENASIWild-type:Piruvato +NADH +H+ <--> LattatoMutante Gln102->Arg aumenta di un fattore 107

Ossalacetato +NADH +H+ <--> Malato

UNA SINGOLA MUTAZIONE

Aspartato-aminotrasferasi (AT) --> Tirosina-AT ( mutazioni multiple)

Onuffer et al. (1995) Protein Sci. 4, 1750.

3α- HSD -> 20α-HSD(inattiva gli androgeni) (inattiva gli estrogeni)

3a-HSD 20a-HSD

L’orientamento ed il riconoscimento del nuovo substrato nel sito attivo sono stati realizzati per ingegneria dei loopI LOOP DELLA 3a-HSD SONO STATI SOSTITUITI

CON QUELLI DELLA 20a-HSD

Diidrosteroide-deidrogenasi (HSD)

Ingegneria di meccanismi di catalisi

a. Gli intermedi di reazione vengono utilizzati per formare prodotti diversi da quello originale

b. Viene ottimizzata una reazione collaterale già presente nell’enzima

c. Si modifica il sito catalitico pre-esistente in mododa catalizzare una nuova reazione

d. Si modifica un sito di legame pre-esistente in mododa catalizzare una reazione

Viene ottimizzata una reazione collaterale già presente

Mioglobina --> perossidasi

Ozaki et al. J. Am. Chem. Soc. 1996, 118: 9784

Si modifica un sito di legame pre-esistente in mododa catalizzare una nuova reazione

Ciclofillina (peptidil-prolil-cis-trans isomerasi) --> serina proteasi (prolina-specifica)

Engineering cyclophilin into a proline-specific endopeptidase.Quemeneur E, Moutiez M, Charbonnier JB, Menez A.Nature 1998 391:301-4

SI REALIZZANO SISTEMI ENZIMATICI MODULARI

Polichetide sintasi:Aciltrasferasi (AT)Proteina trasportatrice di acili (ACP)Chetosintasi(KS)Chetoreduttasi (KR)Deidratasi (DH)Enoilreduttasi (ER)Tioesterasi (TE)

EVOLUZIONE GUIDATA - STRATEGIA GENERALE

IL PERCORSO SEGUITO DA UNA PROTEINANEL CORSO DELLA SUA EVOLUZIONE PUO’ ESSERE DESCRITTO COME:Fitness landscape (scenario del successo evolutivo): descrivele possibilità che si presentano ad una data proteina in termini di fitness. Per esplorare queste possibilità la sequenza della proteina deve variare all’interno di uno….Spazio di sequenza: La complessità della diversità dei sistemi proteici:

20n

E’ MOLTO DIFFICILE ESPLORARE TUTTE LE POSSIBILITA’ IN UN TEMPO RAGIONEVOLE

LA VARIABILITA’ DELLA POPOLAZIONE DIPROTEINE DA OTTENERE DI SOLITO E’ LIMITATA DA RAGIONI OGGETTIVE

STRATEGIA GENERALE DI EVOLUZIONE DIRETTA

Complessità

Espressione

Identificazione

METODI PER CREARE UNA POPOLAZIONE COMPLESSA

• ceppi ad elevata frequenza di mutagenesi• mutageni chimici• PCR a bassa fedeltà

-attività 3’->5’ esonucleasica- MnCl2-- sbilanciamento dei precursori- numero di cicli aumentato-pH

*Problemi: preferenza di mutazioni A<->G e T<->Cbassa probabilità di sostituzioni multiple vicine

MUTAGENESI CASUALE SU REGIONI ESTESEminore livello di complessità ma su tutta la sequenza

• Random Insertion deletion mutagenesis (RID): tagli casuali con Cs(IV)-EDTA

In generale i risultati migliori si ottengono inserendopoche mutazioni per volta in cicli successivi

• Frammenti del gene originario sono sostituiti da oligonucleotidi sintetici contenenti:

- singole posizioni casuali- più posizioni casuali- sottoframmenti semi-casuali

*Oligonucleotidi: sintesi automatica in fase solida(codoni di stop evitati --> solo G o C in terza posizione

MUTAGENESI CASUALE SU REGIONI LIMITATEMaggiore livello di complessità locale

RICOMBINAZIONE

• DNA shuffling: frammentazione + PCR

• StEP (Staggered Extension Process): estensione corta + PCR

• Random-priming: primers casuali + PCR

UTILIZZA LA VARIABILITA’ GIA’ PRESENTE IN REGIONI SEPARATE DI UNA SEQUENZAO PIU’ SEQUENZE

RICOMBINAZIONE

SU GENE SINGOLO

SU GENI MULTIPLI DI UNA FAMIGLIA PROTEICAIncroci di molecole

CEFALOSPORINASIIdentità

Singolociclo

LO SPAZIO DI SEQUENZA ESPLORATO E’ MOLTO DIVERSO

PRINCIPALI STRATEGIE DI ESPRESSIONE

Requisito essenziale: associazione genotipo-fenotipo

• librerie di espressione in procarioti ed eucarioti (cell display)

• librerie di espressione su batteriofagi (phage display)

Problemi: efficienza di introduzione del DNA nelle cellule

•librerie di espressione su ribosomi (ribosome display)

- mRNA tradotti in vitro su ribosomi- arresto della traduzione indotto- la proteina viene esposta sulla superficie del

ribosoma

Problemi: valido soprattutto per proteine con proprietà di legame

IDENTIFICAZIONE DEI CLONI

SELEZIONEIN VIVO

SCREENING

CONFRONTO TRA STRATEGIE DI IDENTIFICAZIONE

METODO VANTAGGI LIMITI---------------------------------------------------------SELEZIONE (connessione attività-vitalità cellulare)

selezione dei positivi falsi positivi (vitali ma non ottimali)

-----------------------------------------------------------------------------------

      eliminazione di varianti misura indirettanon volute enzimatica

-----------------------------------------------------------------------------------      saggi su popolazioni complessità della

molto vaste (ca. 1010) manipolazione-----------------------------------------------------------------------------------SCREENING (cloni individuali - spesso richiesti substrati cromogenici ofluorogenici)

saggio di attività diretto complessità della manipolazione

-----------------------------------------------------------------------------------   saggi in condizioni saggi su popolazioni non vaste

non naturali (ca. 105 se automatico-----------------------------------------------------------------------------------     valutazione di più parametri precisione abbassa la resa-----------------------------------------------------------------------------------