Metodi di determinazione della struttura delle...

ADE 2008-09

Seminario 0.2 crediti(0.1 credito/h)

Dott. Giorgio Giardina

Metodi di determinazionedella struttura delle proteine:Biocristallografia

1martedì 31 marzo 2009

2

Osservare la MATERIA

The Large Hadron Collider at CERNALMA observatory


Osservare la MATERIA


Scopi della biologia

• Dettaglio atomico delle reazioni biologiche

• Relazioni tra struttura e funzione

• Comprensione dei processi biologici in sede normale, pre-patologica e patologica

• Disegno di farmaci basati sulla struttura


Metodologie

• Microscopia a forza atomica (AFM)

• Microscopia elettronica

• Risonanza magnetica nucleare (NMR)

• Cristallografia a raggi X


Piano del-l’immagine

Piano focale, contenente l’immagine di diffrazione

Immagine dell’oggetto

Formazione di un’immagine otticaL’immagine dell’oggetto e l’immagine di diffrazione sono in relazione tra di loro tramite una trasformata di Fourier






Ora, separiamo la lente in due metà:

Immagine dell’oggetto(diffrazione di una diffrazione)


Trasformata di Fourier “fisica”

Trasformata di Fourier “matematica”

L1 L2






Ora, separiamo la lente in due metà:

Immagine dell’oggetto(diffrazione di una diffrazione)


Trasformata di Fourier “fisica”

Trasformata di Fourier “matematica”

L1 L2

L’immagine dell’oggetto è una TF della diffrazione La diffrazione è una TF dell’oggetto


Microscopia aforza atomica (AFM)

• Tecnica nanoscopica per studiare la morfologia di macromolecole biologiche in condizioni fisiologiche

• Modo d’azione: una punta (max. 50 nm) scansiona il campioneimmagine topografica


Microscopia aforza atomica (AFM)

• Tecnica nanoscopica per studiare la morfologia di macromolecole biologiche in condizioni fisiologiche

• Modo d’azione: una punta (max. 50 nm) scansiona il campioneimmagine topografica

20µm


Microscopia aforza atomica (AFM)• Misura le proprietà chimico-

fisiche del campioneforze interatomicheMagneticheelettrostatiche

• Capace di monitorare quantitativamente le reazioni biochimiche


Microscopia aforza atomica (AFM)• Misura le proprietà chimico-

fisiche del campioneforze interatomicheMagneticheelettrostatiche

• Capace di monitorare quantitativamente le reazioni biochimiche

PROBE SCANNING MICRISCOPY AFM, atomic force microscopy o Contact AFM o Non-contact AFM o Dynamic contact AFM o Tapping AFM * BEEM, ballistic electron emission microscopy * EFM, electrostatic force microscope * ESTM electrochemical scanning tunneling microscope * FMM, force modulation microscopy * KPFM, kelvin probe force microscopy * MFM, magnetic force microscopy * MRFM, magnetic resonance force microscopy * NSOM, near-field scanning optical microscopy * PFM, Piezo Force Microscopy * PSTM, photon scanning tunneling microscopy * PTMS, photothermal microspectroscopy/microscopy * SAP, scanning atom probe [5] * SECM, scanning electrochemical microscopy * SCM, scanning capacitance microscopy * SGM, scanning gate microscopy * SICM, scanning ion-conductance microscopy * SPSM spin polarized scanning tunneling microscopy * SThM, scanning thermal microscopy[2] * STM, scanning tunneling microscopy * SVM, scanning voltage microscopy * SHPM, scanning Hall probe microscopy * SSM, Scanning SQUID microscope


Microscopia a forza atomica (AFM)

Ompf channel proteins open/closedEritrociti + antibiotico


Microscopia Elettronica (EM)

• Permette lo studio di cellule, strutture subcellulari, particelle virali, macromolecole e complessi macromolecolari con massa > 200kDa

• Il campione viene visualizzato direttamente perché i fasci di elettroni possono essere focalizzati da lenti elettromagnetiche

• È la tecnica elettiva per proteine di membrana e complessi supramolecolari non adatti per analisi NMR o raggiX


Drosofila

Cellula tumorale

E. coli

Microscopia Elettronica (EM)


Cryo Electron Microscopy (EM)


HIV-1 envelope spikes

Human copper

transporter

acquaporina umana

Cryo Electron Microscopy (EM)


Risonanza Magnetica Nucleare

• Tecnica spettroscopica per lo studio della struttura di macromolecole a risoluzione atomica

• È basata sull’interazione dei singoli nuclei atomici magneticamente attivi - 1H, 15N, 13C e 31P - con il campo magnetico esterno e con i campi magnetici dei nuclei adiacenti


NMR: un esperimento tipo


(800 MHz) NMR spectrometer


• Il campione viene analizzato in soluzione e in condizioni fisiologiche

• L’immagine 3D non è diretta, ma ricostruita

• Limitata a campioni ≤50kDa

• Produce informazioni di:– dinamica– conformazioni– folding– interazioni intermolecolari


(800 MHz) NMR spectrometer

campione







Cristallografia a raggi X

• Attualmente tecnica di elezione per la determinazione di strutture 3D a risoluzione atomica

• Tecnica indiretta: l’immagine va ricostruita

• Non ci sono limitazioni nelle dimensioni delle macromolecole

• Svantaggi:– cristalli singoli– altamente ordinati– ragionevolmente grandi (80-100µM)


Perché i raggi X?

Per poter visualizzare due oggetti come entità separate, la lunghezza d’onda della radiazione

elettromagnetica deve essere dello stesso ordine di grandezza della distanza tra gli oggetti

distanza interatomica ≈1Å (10 nm)

λraggiX= 0.1÷2Å

⇒ con i raggiX “vedo” gli atomi



Perché cristallografia e non miscroscopia a raggiX ?

Non esistono lenti in grado di focalizzare i raggiX ⇒ la matematica ci viene in aiuto



Visione d’insieme del processo

ProteinCrystal Collection

FFT

X-ray beam





FFT

X-ray beam


Cristallizzazione




FFT

X-ray beam


Cristallizzazione

Diffrazione dei Raggi X




FFT

X-ray beam


CristallizzazioneRisoluzione della struttura e affinamento

Diffrazione dei Raggi X


… perché un cristallo?

ab

c

abc




ab

c

abc

L’immagine di diffrazione da una singola molecola si forma per interazione dei raggi X con gli elettroni degli atomi della molecola,




MA: - è troppo debole (↓segnale/rumore) - impossibile separarla dalla radiazione di fondo (aria + soluzione)

⇒ è praticamente impossibile ricostruire la molecola

ab

c

abc







ab

c

abc

In un cristallo, miliardi di molecole sono disposte in modo ripetuto e ordinato nelle tre dimensioni







ab

c

abc

In un cristallo, miliardi di molecole sono disposte in modo ripetuto e ordinato nelle tre dimensioni

Cristallo ≡ amplificatore del segnale

⇒ buone immagini di diffrazione (↑segnale/rumore)

⇒ si può ricostruire la molecola




Come si formano i cristalli

Processo di nucleazione: aggregazione lenta e ordinata delle macromolecole in un reticolo cristallino con esclusione del solvente

ΔG = ΔH - TΔS

La cristallizzazione è un processo spontaneo, con un fattore entropico sfavorevole e interazioni molecolari altamente favorite

Soluzione sottosatura

Soluzione sovrasatura

Zona metastabile

Legenda del diagramma di fase: precipitato amorfo; nucleazione; crescita

Curva di saturazione

[agente precipitante]

[pro

tein

a]Cristallografia a raggi X


Cristalli



Abbiamo ottenuto cristalli … e poi?Raccolta dati

Temperatura ambiente (293-298K)

Temperature criogeniche (50 - 100K)

Il cristallo viene montato in un capillare di quarzo

Il cristallo, protetto con un anticongelante, viene montato in un loop di nylon e raffreddato sotto flusso di N2 alla T=100 K



Raccolta dati

Lunghezza d’onda fissaλ(Cukα) = 1.5486Å

Lunghezza d’onda fissa e/o variabile

Anodo rotante

Sincrotrone

• bassa intensità raggio diretto• tempi di esposizione lunghi (giorni)• basso danno radiologico (a temperature criogeniche)

• intensità 100-1000 maggiore• tempi di esposizione brevi (da 30 minuti a 2-3 ore)• alto danno radiologico• λ modulabile



Le Onde elettromagnetiche sono funzioni periodiche

f (t)=Asin(kr+2πt/T+φ)A=ampiezzaΦ=faseΤ=periodo

Ι raggi X sono onde elettromagneticheCon lunghezze d’onda nel seguente intervalloλ= 0.1÷5Å

Onda elettromagnetica



Diffrazione di un’onda elettromagnetica

Se le onde diffratte sono in fase avremoUn’interferenza costruttiva (le ampiezze si sommano)

Se le onde diffratte non sono in fase avremoun’interferenza costruttiva (le ampiezze si ssottraggono)


Legge di Bragg

•La differenza di cammino tra l’onda 1 e l’onda 2 è = CB+BD•L’interferenza costruttiva ci sarà solo quando: CB+BD=2CB=nλ•Poiché CB=dsenθ allora avremo:

2d senθ=nλ (Legge di Bragg)Dato un reticolo di piani che distano d e la lunghezza d’onda dell’onda incidentePotrò avere interferenza costruttiva solo per certi valori dell’angolo teta

Immagine di diffrazione

n=1,2,3,4…


Immagine di diffrazione



Posso calcolare la densità elettronica?

Ampiezza dei fattori di struttura (I = |F|2)Fase dei fattori di struttura, persa durante l’esperimento





NO





• Sperimentalmente misuriamo le intensità delle onde diffratte dagli atomi nel reticolo cristallino.• La densità elettronica nel punto (xyz) è data dalla risultante di tutte le onde diffratte dal piano (hkl) nel cristallo, la cui ampiezza dipende dal numero di elettroni presenti e la cui fase dipende dalla somma delle fasi.

NO



Abbiamo ottenuto le MAPPE … e poi?

Densità iniziale




Densità iniziale

+

Interpretazione




Densità iniziale

+

Interpretazione

=

Struttura 3D finale



• La qualitá delle MAPPE dipende dalla risoluzione.

• La risoluzione dipende dalla qualitá dei cristalli.



OK ho la STRUTTURA…

…e adesso?


⇒

Estrazione dell’informazione biologica dai dati strutturali



Un esempio: il complessodell’ATP sintasi mitocondriale

NADHDeidro-genasi

CytC - QOssido

reduttasi

CytCossidasi

ATPsintasi

SuccinatoDeidro-genasi

Matrice

Spazio intermembrana

C


Un esempio: il complessodell’ATP sintasi mitocondriale

Il V complesso della catena respiratoria utilizza il gradiente protonico, generato dagli altri complessi, per sintetizzare ATP:

ADP + Pi + 1/2 O2 + 2H+ + 2e- → ATP + H2O

NADHDeidro-genasi

CytC - QOssido

reduttasi

CytCossidasi

ATPsintasi

SuccinatoDeidro-genasi

Matrice

Spazio intermembrana

C


matrice

F1

Ricostruzione a bassa risoluzione del complesso

Prima della cristallografia:Microscopia elettronica

dell’ATP sintasi mitocondriale


La biocristallografia ha svelato la struttura atomica di tutte le subunità di F0 e F1

F0

F1


Cristalli di F1 in presenza e in assenza di ADP e ATP hanno chiarito il meccanismo di azione

T

O

L


Un esempio pratico:la proteasi del virus HIV


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Enzima omodimerico: ogni monomero ha 99 ammino acidi

Residui catalitici: Asp 29 e 30



La cavità centrale è ampiapuò legare un polipeptide in conformazione estesa



Com’è stata utilizzata l’informazione strutturale?

La tasca è stata “riempita” con analoghi non idrolizzabili del substrato:inibitori competitivi altamente specifici e selettivi

KNI577


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Com’è stata utilizzata l’informazione strutturale?

nuova generazione di farmaci “intelligenti” con pochi effetti collaterali inibitori non competitivi altamente specifici e selettivi

AB-2


Replicazione del HIV


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