Metodi di determ

inazione della struttura delle proteine

Scopi della biologia strutturale

•A

nalisi del dettaglio atomico delle com

ponenti biologiche di cellule e tessuti

•A

nalisi del dettaglio atomico delle reazioni

biologiche•

Comprensione dei processi biologici in sede

normale, pre-patologica e patologica

•Com

prensione delle relazioni tra struttura e funzione

• D

isegno di farmaci basati sulla struttura

Metodi sperim

entali per determinare la struttura

delle macrom

olecole

Alta risoluzione

cristallografia a raggiX | N

MR | cristallografia elettronica

Media risoluzione

microscopia elettronica | diffrazione di fibre | Spettro-

metria di m

assa | SAX

S | Microscopia a Forza A

tomica

Metodi Spettroscopici

NM

R | dicroismo circolare | A

ssorbanza | Fluorescenza | Fluorescenza anisotropa | diffusione della luce

Metodi C

himici

scambio H

-D | m

utagenesi sito specifica | modificazioni

chimiche | proteom

ica

Metodi term

odinamici

Equilibrio di (un)folding

Metodi com

putazionali predizione della struttura delle Proteine | D

ocking m

olecolare

M

etodologie

•M

icroscopia a forza atomica

•M

icroscopia elettronica

•Risonanza m

agnetica nucleare

•Cristallografia a raggi XCristallografia a raggi X

Microscopia a forza atom

ica•

Tecnica nanoscopica per studiare la morfologia di

macrom

olecole biologiche in condizioni fisiologiche•

Modo d’azione: una punta (m

ax. 50µm), collegata ad un

sistema di leve di precisione, scansiona il cam

pione!

imm

agine topografica•

Misura le proprietà chim

ico-fisiche del campione

! forze interatom

iche, magnetiche o elettrostatiche

•Capace di m

onitorare quantitativamente le reazioni

biochimiche

Microscopia a forza atom

ica•

Un esem

pio: organizzazione delle molecole di

acquaporina umana nel doppio strato fosfolipidico

Denaturazione m

eccanica

Variazione di forza ionica10nm

10nm

Microscopia Elettronica

•Perm

ette lo studio di cellule, strutture subcellulari, particelle virali, m

acromolecole e com

plessi m

acromolecolari con m

assa > 200kDa

•Il cam

pione viene visualizzato direttamente perché i

fasci di elettroni possono essere focalizzati da lenti elettrom

agnetiche•

È la tecnica elettiva per proteine di mem

brana e com

plessi supramolecolari non adatti per analisi N

MR

o raggiX

Microscopia Elettronica

Un esem

pio: acquaporina um

ana a 4Å di

risoluzione

Risonanza Magnetica N

ucleare•

Tecnica spettroscopica per lo studio della struttura di m

acromolecole a risoluzione atom

ica

•È basata sull’interazione dei singoli nuclei atom

ici m

agneticamente attivi ( 1H

, 15N, 13C e 31P) con il cam

po magnetico

esterno e con i campi m

agnetici dei nuclei adiacenti

•Il cam

pione viene analizzato in soluzione e in condizioni fisiologiche

•L’im

magine 3D

non è diretta, ma ricostruita

•Lim

itata a campioni !50kD

a

•Produce inform

azioni sulla dinamica, sulle conform

azioni, sul folding e sulle interazioni interm

olecolari

NM

R: un esperimento tipo

Cristallografia a raggi XCristallografia a raggi X

•A

ttualmente tecnica di elezione per la determ

inazione di strutture 3D

a risoluzione atomica

•Tecnica indiretta: l’im

magine va ricostruita

•N

on ci sono limitazioni nelle dim

ensioni delle macrom

olecole

•Svantaggi:–

cristalli singoli–

altamente ordinati

–ragionevolm

ente grandi (80-100!M

)

Perché i raggi X?

Per poter visualizzare due oggetti come entità separate, la

lunghezza d’onda della radiazione elettromagnetica deve

essere dello stesso ordine di grandezza della distanza tra gli oggettidistanza interatom

ica "1Å!

raggiX = 0.1÷2Å

" con i raggiX

“vedo” gli atomi

Perché cristallografiacristallografia e non

miscroscopia a raggiX

?

Non esistono lenti in grado di focalizzare i raggiX

"

la matem

atica ci viene in aiuto

Piano del-l’im

magine

Piano focale, contenente l’imm

agine di diffrazione

Imm

agine dell’oggetto

Formazione di un’im

magine otticaL’im

magine dell’oggetto e

l’imm

agine di diffrazione sono in relazione tra di loro tram

ite una trasformata di

Fourier

Ora, separiam

o la lente in due metà:Im

magine

dell’oggetto(diffrazione di una diffrazione)

Piano focale, contenente l’im

magine di diffrazione

Trasformata di

Fourier “fisica”Trasform

ata di Fourier “m

atematica”

L1

L2

L’imm

agine dell’oggetto è una TF della diffrazione La diffrazione è una TF dell’oggetto

… perché un cristallo?

MA

: - è troppo debole (!segnale/rum

ore) - im

possibile separarla dalla radiazione di fondo (aria + soluzione)!

è praticamente im

possibile ricostruire la molecola

ab

c

abc

In un cristallo, miliardi di

molecole sono disposte in

modo ripetuto e ordinato

nelle tre dimensioni

Cristallo " am

plificatore del segnale!

buone imm

agini di diffrazione (#segnale/rumore)

! si può ricostruire la m

olecola

L’imm

agine di diffrazione da una singola molecola si form

a per interazione dei raggi X

con gli elettroni degli atomi della m

olecola,

Come si form

ano i cristalliProcesso di nucleazione:

aggregazione lenta e ordinata delle m

acromolecole in un

reticolo cristallino con esclusione del solvente

Abbiam

o ottenuto cristalli … e poi?

•Raccolta dati di diffrazione

•A

nalisi matem

atico-statistica dei dati•

Costruzione e analisi delle mappe di densità elettronica

•Controllo qualità

Abbiam

o ottenuto cristalli … e poi?

•Raccolta dati di diffrazione

•A

nalisi matem

atico-statistica dei dati•

Costruzione e analisi delle mappe di densità elettronica

•Controllo qualità

QuickTim

eª!and!aSilicon!G

raphics!JPEG!decom

pressorare!needed!to!see!this!picture.

Abbiam

o ottenuto cristalli … e poi?

•Raccolta dati di diffrazione

•A

nalisi matem

atico-statistica dei dati•

Costruzione e analisi delle mappe di densità elettronica

•Controllo qualità+

=

Densità iniziale

InterpretazioneStruttura 3D

finaleStruttura 3D

finale

Abbiam

o ottenuto cristalli … e poi?

•Raccolta dati di diffrazione

•A

nalisi matem

atico-statistica dei dati•

Costruzione e analisi delle mappe di densità elettronica

•Controllo qualità

!Estrazione dell’inform

azione biologica dai dati strutturali

Un esem

pio pratico: la proteasi del virus H

IV

Enzima om

odimerico: ogni m

onomero ha 99 am

mino acidi

Residui catalitici: A

sp 29 e 30

Un esem

pio pratico: la proteasi del virus H

IV

La cavità centrale è ampia e può legare un polipeptide in

conformazione estesa

Residui catalitici: A

sp 29 e 30

Un esem

pio pratico: la proteasi del virus H

IV

QuickTim

eª!and!aJPEG

!2000!decompressor

are!needed!to!see!this!picture.

Com’è stata utilizzata l’inform

azione strutturale?

La tasca è stata “riempita” con analoghi non idrolizzabili del substrato:

! inibitori com

petitivi altamente specifici e selettivi

KN

I577

Com’è stata utilizzata l’inform

azione strutturale?

! inibitori non com

petitivi altamente specifici e selettivi

! nuova generazione di farm

aci “intelligenti” con pochi effetti collaterali

AB-2

Un esem

pio: il complesso

dell’ATP sintasi mitocondriale

Il V com

plesso della catena respiratoria utilizza il gradiente protonico, generato dagli altri com

plessi, per sintetizzare ATP:A

DP + Pi + 1/2 O

2 + 2H+ + 2e

- $ ATP + H2 O

NA

DH

Deidro-

genasi

CytC

- QO

ssidoreduttasi

CytC

ossidasi

ATPsintasi

SuccinatoD

eidro-genasi

Matrice

Spazio interm

embrana

C

Prima della cristallografia: M

icroscopia elettronica dell’ATP sintasi

mitocondriale

matrice

F1

Prima della cristallografia: M

icroscopia elettronica dell’ATP sintasi

mitocondriale

matrice

F1

Ricostruzione a bassa risoluzione del complesso

Cristalli di F1 in presenza e in assenza di A

DP e

ATP hanno chiarito il meccanism

o di azione

T

O

L

Cristalli di F1 in presenza e in assenza di A

DP e

ATP hanno chiarito il meccanism

o di azione