Tecniche spettroscopiche

basate sulla interazione tra radiazioni elettromagnetiche e materia

Quando le radiazioni elettromagnetiche interagiscono con la materia possono avvenire fenomeni diversi :● assorbimento● fluorescenza o fosforescenza (assorbimento e riemissione) ● reazioni fotochimiche (assorbimento e trasformazioni chimiche)● riflessione ● diffusione

c = λ x ν e quindi λ = c / ν ν = c / λ

Lo spettro elettromagnetico nel vuoto è costituito da onde di varia νe λ ,in movimento con la stessa velocità c ( 300.000 Km /sec)

L’energia collegata ad un’onda è E = h x νossia la sua frequenza per la costante di Plank (h = 6.6 x10-27 erg /sec)

pertanto la frequenza e la lunghezza d'onda non sono indipendenti, ma sono legate tra loro attraverso la velocità dell'onda:

quindi l’energia di una radiazione elettromagnetica è inversamente proporzionale alla sua lunghezza d’onda E = h x c/λ

Struttura che subisce transizione regione dello spettro

ELETTRONI DELLE ORBITE INTERNE Raggi x

SPIN ELETTRONICO Microonde

SPIN NUCLEARE ONDE RADIO

ELETTRONI DELL’ORBITA ESTERNA Radiazioni UV/VIS

L’assorbimento di una radiazione porta un atomo o una molecola ad un livello energetico superiore.Radiazioni elettromagnetiche di diversa lunghezza d’onda ed energia interagiscono con la materia provocando transizioni energetiche a livelli diversi di struttura

Quando un atomo o una molecola assorbono una radiazione UV o visibile gli elettroni esterni passano da uno stato fondamentale (E0) ad uno stato eccitato (E1)

Livelli energetici di un atomo

(sodio)Livelli energetici molecolari

questa transizione si verificaquando l’atomo di sodio assorbeuna radiazione di λ = 589 nm

Per un atomoSPETTRO A RIGHE

Per una molecola SPETTRO A BANDE

lo spettro di assorbimentolo spettro di assorbimento è un grafico che definisce il tipo e la quantità delle radiazioni elettromagnetiche assorbite da un atomo o da una molecola: riporta in ascisse le λ assorbite ed in ordinata una misura dell’assorbimento.

A

LA LA FOTOMETRIAFOTOMETRIA MISURAMISURA LA QUANTITLA QUANTITÀÀ DI LUCE DI LUCE

ASSORBITA DA ASSORBITA DA MOLECOLE IN SOLUZIONEMOLECOLE IN SOLUZIONE

Le sostanze incolori possono assorbire luce ultravioletta

Le sostanze colorate assorbono luce visibile

IL TIPO DI RADIAZIONE ASSORBITA DIPENDE DALLA STRUTTURA CHIMICAIL TIPO DI RADIAZIONE ASSORBITA DIPENDE DALLA STRUTTURA CHIMICA

La La λλ della luce assorbita aumenta con ldella luce assorbita aumenta con l’’aumentare del aumentare del grado di delocalizzazione elettronicagrado di delocalizzazione elettronica

La presenza di legami di tipo π (insaturazione) e di doppietti elettronici liberi sono responsabili dell’assorbimento nel UV/VIS

MONOCROMATORE: dispositivo che permette di isolare fasci

di luce monocromatica da luce policromatica

▪ PRISMA

▪ RETICOLO DI DIFFRAZIONE

RIFRAZIONE della luce bianca attraverso un prisma

la luce incidente sul reticolo subisce il fenomeno della diffrazione e viene quindi deviata in diverse direzioni in funzione della distanza tra le incisioni e della lunghezza d’onda

superficie metallica riflettente sulla quale sono incisi numerosi tratti rettilinei equidistanti

RETICOLO DI DIFFRAZIONE

CUVETTECUVETTE

USA E GETTA

in polistirene per il visibilein metacrilato per il vicino UV

IN VETRO PER IL VISIBILE

IN QUARZO PER L’UV

Sistema di rivelazioneSistema di rivelazione

Cellula fotoelettricaCellula fotoelettricaIL fotone colpisce il catodo che è ricoperto di una superficie metallica fotosensibile che emette elettroni

M0 + hυ → M+ + e-

LEGGE DI LAMBERT LEGGE DI LAMBERT -- BEERBEER

LA QUANTITÀ DI LUCE ASSORBITA [ASSORBANZA, A][ASSORBANZA, A] DIPENDE DAL NUMERO DELLE MOLECOLE PRESENTI IN SOLUZIONE,

e quindi dalla concentrazione della soluzione e dalla lunghezza del cammino ottico

A = k A = k ll ccI0 I

I0 I I0 I

Variazione di c variazione di l

I0 luce incidente I luce trasmessa

k = A / l c

se c ed l hanno valore unitari k = A

a λ di massimo assorbimento c = 1 M e l = 1 cm

k k == E E == COEFFICIENTE DI ESTINZIONE MOLARECOEFFICIENTE DI ESTINZIONE MOLARE

A = k A = k ll cc

è l’assorbanza di una soluzione 1M, determinata a 550 nm,in un cuvetta di 1 cm di cammino ottico

LA TRASMITTANZA (T) È LA FRAZIONE DI RADIAZIONE CHE

ATTRAVERSA UN MEZZO ASSORBENTE

è data dal rapporto tra luce trasmessa (I) e luce incidente (I0)

T = I/I0

T = 0 se la soluzione assorbe tutta la luce incidente (I = 0)

T = 1 se la soluzione è completamente trasparente (I = I0)

0 ≤ T ≤ 1

In un fotometro non si misura direttamente l’assorbanza, ma si ricava dalla misura delle radiazioni trasmesse, non assorbite

RELAZIONE TRA TRASMITTANZA E ASSORBANZA

T = 10-A

T = 10 -klc

A = klc

A = - log TPer T = 1 A = 0Per T = 0 A = ∞

Variazioni della Assorbanza e della Trasmissionein funzione della concentrazione della sostanza assorbente

Devo “azzerare l’apparecchio”tarando la trasmissione al 100% su un Blank che contenga tutte le molecole diverse dal campione di interesse ma capaci di assorbire

Spettrofotometro a doppio raggioSpettrofotometro a doppio raggio

PERMETTE DI AZZERARE AUTOMATICAMENTE E IN MODO PERMETTE DI AZZERARE AUTOMATICAMENTE E IN MODO CONTINUO LO STRUMENTO SUL BLANKCONTINUO LO STRUMENTO SUL BLANK

S1 ed S2 in posizione a : alla fotocellula arriva il raggio che ha attraversatoil Blank (R)

S1 ed S2 in posizione b : alla fotocellula arriva il raggio che ha attraversatoil campione (C)

Analisi qualitative

Lo spettro di assorbimento è diverso da molecola a molecola e ne permette il riconoscimento

Spettro di assorbimento dell’emoglobina

Spettri di assorbimento di varie forme dell’EMOGLOBINA

Lunghezza d’onda (nm)

Ass

orba

nza

i nucleotidi e gli acidi nucleici assorbono a 260 nm

Spettro del NAD ossidato e ridotto

La legge di Beer è valida per soluzioni diluite.

Ad alte concentrazioni si osservano deviazioni positive (2) o negative (3)

Analisi quantitative

CURVA DI TARATURA

Stabilisce l’ambito di linearità della legge di Lambert -Beer

Permette la determinazione della concentrazione di una sostanza in soluzione tramite il confronto della sua assorbanza con l’assorbanza di una soluzione della stessa sostanza a concentrazione nota.

Posso determinare la concentrazione anche dal valore del coefficiente di estinzione, se lo si conosce

• Analisi quantitatitiva:

Misura della concentrazione di molecole che assorbonola luce come le proteine e gli acidi nucleici

Misura della concentrazione di molecole che non assorbonola luce, dopo derivatizzazione con un cromoforo o conversionechimica in un composto che assorbe la luce

Studio delle cinetiche di reazione (cinetica enzimatica)

i nucleotidi e gli acidi nucleici assorbono a 260 nm

La denaturazione del DNA rende le basi più accessibili e provoca un aumento della assorbanza a 260 nm.Questo effetto ipercromico può essere utilizzato per seguire la denaturazione, valutando la frazione di DNA denaturato come incremento di assorbanza.

Determinazione colorimetrica di proteine

• Misura diretta a 280 nm – Aminoacidi aromatici

• Misura diretta a 205 nm– Legame peptidico

• Metodi indiretti– Biureto– Folin-Lowry– Bradford (blu Coomassie G-250)

Bradford Reattivo Blu Coomassie

BluSi lega agli aminoacidi basici ed aromaticiMax assorbimento a 595 nm