Esperienza di polarimetria Dott. Alfonso Zoleo Laboratorio di Metodologie Spettroscopiche per le...

Esperienza di polarimetria

Dott. Alfonso Zoleo

Laboratorio di Metodologie Spettroscopiche per le Biotecnologie AA 2014-2015

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Concetti fondamentali

La luce possiede una proprietà chiamata polarizzazione. La polarizzazione descrive la direzione di oscillazione del campo elettrico dell'onda.

Se guardo un’onda polarizzata linearmente che viene verso di me, il campo elettrico lo “vedo” oscillare così

Si dice che la luce è polarizzata linearmente se il campo elettrico oscilla sempre su un piano. In figura è mostrata un'onda polarizzata linearmente: il campo elettrico oscilla sempre sul piano xy (e il campo magnetico sempre sul piano xz)

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Si dice che la luce è polarizzata circolarmente se il campo elettrico ruota intorno alla direzione di propagazione. La rotazione ha luogo alla frequenza propria dell’onda. Il modulo del campo elettrico è costante.

Se guardo un’onda polarizzata circolarmente che viene verso di me, il campo elettrico lo “vedo” ruotare

La luce prodotta da una lampada (o la luce solare) è non polarizzata (il campo elettrico oscilla casualmente in ogni direzione).


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Dobbiamo inoltre considerare che il campo elettrico è un vettore, e quindi esso può essere sempre rappresentato ugualmente bene come somma delle sue componenti lungo direzioni prefissate:

y

z

x

E(t)

Ey(t)

Ez(t)

In questo esempio ho scomposto il vettore campo elettrico dell’onda, posto in una direzione qualsiasi (perpendicolare alla direzione di propagazione x), in due vettori diretti lungo y e lungo z. Sussiste la relazione:

jtEktEtE yzˆ)(ˆ)()(

k

j = versore diretto lungo y

= versore diretto lungo z


Il polarizzatore è un dispositivo che lascia passare solo la componente del campo elettrico della luce che è diretta secondo un asse (detto di polarizzazione)

polarizzatore

direzione di propagazione della luce

Luce non polarizzata

Lucepolarizzatalinearmente

lentelampada


Quando un fascio di luce polarizzata linearmente, con il campo elettrico inclinato rispetto all’asse polarizzatore, incide sul polarizzatore, la componente del campo perpendicolare all’asse viene bloccata: rimane solo la componente lungo l’asse.

I= intensità della luce. E’ proporzionale al quadrato del campo elettrico della radiazione

Intensità della luce prima di attraversare il polarizzatore

Asse del polarizzatore

EE cos()

E sen()

E cos() I0=k E2

I=k E2 cos2( Intensità della luce dopo aver attraversato il polarizzatore

I=I0 cos2( Legge di Malus!!


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Molte sostanze (dette otticamente attive) ruotano di un certo angolo il piano della luce polarizzata linearmente che attraversa una soluzione che le contiene. Praticamente tutte le sostanze di interesse biologico (enzimi, zuccheri, proteine) sono otticamente attive

Importanza dell’attività ottica in biologia

Misurare la variazione di attività ottica di una sostanza biologica è un modo per studiare reazioni e cambiamenti di quella sostanza

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Potere ottico rotatorio (POR) di una sostanza

Definizione

L'angolo di rotazione α del piano della luce polarizzata (in gradi) diviso per la lunghezza di cammino ottico attraverso il mezzo (b, in dm), diviso a sua volta o per la concentrazione in massa (c, in g/ml) della sostanza (potere ottico rotatorio specifico [a]λ

q ) o per la concentrazione molare (potere ottico rotatorio molare [am]λ

q ) .

Il POR specifico (o molare) di una sostanza dipende dalla lunghezza d’onda della luce polarizzata e dalla temperatura. Convenzionalmente si usa luce gialla monocromatica a 589 nm (riga D del sodio), e la misura è effettuata a 20°C

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Molecole otticamente attive

Enantiopuro = composto che contiene solo un tipo di enantiomero

Enantiomero = uno dei due stereoisomeri di una molecola che sono immagini speculari non sovrapponibili l’uno dell’altro

Carbonio chirale

Sperimentalmente si osserva che tutte le soluzioni di composti enantiopuri ruotano il piano della luce polarizzata.

L-alaninaD-alanina

Enantiomero LEnantiomero S

Tutti gli aminoacidi biologici (tranne la glicina) sono chirali, ovvero solo una delle forme è usata biologicamente

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Gli Zuccheri

* sono centri chirali

enantiomeri

Consideriamoun esempio

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I monosaccaridi (aldosi) semplici sono soggetti alla formazione di semiacetali

In soluzione il D-glucosio forma due diastereoisomeri

Quando una delle due forme viene sciolta in acqua, lentamente si ottiene un equilibrio delle due forme con il 36% della forma α e il 64% della forma β. Il P.O.R. misurato cambia quindi con il tempo (Mutarotazione), fino al raggiungimento dell'equilibrio. La soluzione deve essere quindi lasciata equilibrare prima di effettuare la misura.

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D-(+)-galattosio 82

D-(+)-glucosio

(destrosio)

52.7

D-(-)-fruttosio

(D-Levulose)

-89.5

Saccarosio

(glucosio-fruttosio)

66.5

Saccarosio invertito

(glucosio e fruttosio)

-20 (25 C)

Maltosio

(dimero del glucosio)

138.5

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Si prepara una soluzione dello zucchero di interesse a concentrazione nota

Si riempie con acqua o con la soluzione un tubo polarimetrico

Si predispone una fascio di luce polarizzata e lo si fa attraversare il tubo

Si trovano la orientazione della luce polarizzata in uscita quando nel tubo c'è l'acqua e quando c'è la soluzione

Dalla distanza angolare fra le due posizioni del polarizzatore analizzatore si calcola il potere ottico rotatorio

Il principio della misura è molto semplice:

Vediamo la realizzazione pratica

L’ESPERIENZA: MISURA DEL POTERE OTTICO ROTATORIO DI SACCARIDI

TEMPI ED ESECUZIONE DELL’ESPERIENZA

PRIMO GIORNO: Preparazione delle tre soluzioni del saccaride a concentrazione nota.

-Le tre soluzioni devono avere una concentrazione compresa tra 0,05 g/ml e 0,3 g/ml

-La preparazione viene effettuata in matracci da 50 ml

-Le tre soluzioni devono essere lasciate termostatare a 25°C per 24 h (equilibrio anomerico)


PRIMO GIORNO/SECONDO GIORNO: Costruzione del polarimetro

Componenti del polarimetro1) Sorgente luminosa (LED o laserino)

2) Lente collimatrice del fascio3) Chopper

4) Polarizzatore 6) Analizzatore6) Tubo polarimetrico

7) Lente collimatrice del fascio

8)Fotodiodo

2) Piazzare sulla rotaia, davanta alla lampada, la lente collimatrice, avendo cura che il centro del LED sia allineato con il centro della lente (regolando altezza e posizione della lente)



1) Mettere per prima la lampada (il LED) sulla rotaia

3) Spostare la lente lungo la rotaia fino a che il fascio appare allineato: verificarlo usando un foglio e vedendo se lo spot luminoso dopo la lente non cambia variando la distanza del foglio

4) Piazzare la lente focalizzante a 50 cm dall’altra lente

50 cm

5) Piazzare il fotodiodo nel fuoco della lente

TEMPI ED ESECUZIONE DELL’ESPERIENZAPRIMO GIORNO/SECONDO GIORNO: Costruzione del polarimetro

6) Aggiungere il CHOPPER: il chopper è un disco con dei fori che ruota azionato da un motorino elettrico. Variando la tensione dell’alimentatore del motorino è possibile cambiare la frequenza di rotazione del disco. In questo modo è possibile trasformare la luce continua in luce pulsata

7) Aggiungere il polarizzatore, il tubo polarimetrico e l’analizzatore



8) Collegare l’oscilloscopio: il trigger dal chopper e il segnale in uscita dal fotodiodo in ingresso

Perché usare il CHOPPER ?

Per avere luce pulsata. In questo modo sull’oscilloscopio si potra avere un segnale on (quando la luce colpisce il fotodiodo) e off (quando il chopper blocca la luce). La differenza delle due tracce è direttamente proporzionale all’intensità della luce che colpisce il fotodiodo. Nota bene: l’oscilloscopio lavora solo con segnali nel tempo! La sottrazione luce on-luce off consente di eliminare la luce ambientale!!

Ext Ch1 Ch2Trigger dal chopper

Luce on

Luce off

Chopper Fotodiodo

Intensità della luce

Luce


SECONDO GIORNO: Esecuzione della misura

1) Inserire l’acqua nel tubo polarimetrico. Mettere il tubo fra i polarizzatori

Analizzatore

2) Ruotare l’analizzatore finché il segnale sull’oscilloscopio scompare



3) Ruotare in senso inverso (antiorario in figura) di 20° l’analizzatore (c’è un goniometro per la lettura dei gradi)

Analizzatore

20°

4) Leggere l’intensità della luce (in mV) sull’oscilloscopio e l’angolo leggibile sul goniometro dell’analizzatore in questa posizione



5) Ruotare di 4° in senso orario l’analizzatore e prendere nuovamente il valore di intensità (in mV) letto sull’oscilloscopio e l’angolo letto sul goniometro

Analizzatore

6) Ripetere il punto 4) per un totale di 10 punti (spazzata di 40°)



7) Svuotare il tubo polarimetrico e riempirlo con la soluzione zuccherina più diluita

8) Ripetere la misura per la soluzione (punti 1-6)

9) Ripetere per le altre due soluzioni in concentrazione crescente (punti 1-8)

NOTA BENE: 1) Non cambiare configurazione ai polarizzatori nel passaggio da una soluzione ad un’altra

2) Quando si passa da una soluzione all’altra, l’angolo di minimo (cioè quando non si vede più segnale sull’oscilloscopio) va cercato in prossimità del minimo precedente.

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Parti dello strumento

Rotaia e supporti

Polarizzatori

Lenti

Rivelatore Sorgente a 589 nm

Tubo polarimetrico

ELABORAZIONE E PRESENTAZIONE DEI DATI

Al termine del secondo giorno di lavoro, ogni gruppo avrà a disposizione i seguenti set di dati:

1)Un gruppo di 10 punti (mV, angolo) acquisiti ogni 4° nell’intorno del minimo per l’acqua pura

2)Tre gruppi di 10 punti (mV, angolo), acquisiti ogni 4°, nell’intorno del minimo: un gruppo per ognuna delle tre soluzioni di zucchero


I punti acquisiti ogni 4° , relativi all’acqua pura e alle soluzioni zuccherine, vengono messi in grafico con il software Origin. Poiché i punti sono presi in una zona limitata attorno al punto di minimo, si assume che possano seguire una parabola.

I punti vengono fittati in modo non-lineare usando l’equazione parabolica nella forma ax2+bx+c

Il punto di minimo della parabola è dato da x0=-b/(2a)

Dalla differenza fra la distanza angolare di minimo x0 di ogni soluzione con la distanza agolare di minimo dell’acqua si calcola il potere ottico rotatorio di ogni soluzione:

Riportando in grafico il POR di ogni soluzione contro la concentrazione, e facendo un fitting lineare pesato con Origin, si ricava il POR specifico (o molare, a scelta degli studenti):


x0(sol)-x0(acq)

b c []

Relazione

Ogni gruppo deve presentare una relazione sulla polarimetriaLa relazione deve essere essenziale:

1)Max. una paginetta (= una facciata) di introduzione con le basi e l’obiettivo del lavoro2)Max 4 pagine di parte sperimentale

GruppiMer 5/11/2014

Gio 6/11/2014

Ven 7/11/2014

Mer 19/11/2014

Gio 20/11/2014

Ven 21/11/2014

1 UV Pol/UV Pol Elab Rec Rec



4 Pol Pol UV Elab Rec Rec



Turni e gruppi

Organizzazione

Mercoledì 5/11

14:00-15:00 spiegazione pratica UV-VIS e fluorescenza + preparazione delle soluzioni zuccherine 15.00-18.00: Gruppi 1-3 esecuzione UV-VIS, gruppi 4-6 preparazione soluzioni e montaggio del polarimetro

Giovedì 6/11

14:00-18:00: gruppi 1-3 preparazione soluzioni zuccherine + elaborazione UV-VIS; gruppi 4-6 misure polarimetriche

Venerdì 7/11

14:00-18:00: gruppi 1-3 montaggio polarimetro e misure polarimetriche; guppi 4-6 UV-VIS

Mercoledì 19/11

14:00-18:00: Elaborazione/Recupero

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