Sara Della Torre Adriana Maggi Lab

08.11.11

Ingegneria animale: principi di base

Manipolazione genetica tradizionale

Manipolazione genetica moderna – DNA RICOMBINANTE

Cosa mancava per passare dalla manipolazione genetica tradizionale a

quella moderna?

1967: Scoperta della DNA ligasi

1968:

Scoperta degli enzimi di restrizione

1972: Avanzamenti nelle

tecniche di trasferimento del DNA e nell’uso di

plasmidi

Double helix

Watson and Crick, 1953

DNA

hybridization,

1961

PCR

Kary Mullis, 1983

http://www.karymullis.com

Animale Transgenico: animale nel cui genoma è stato inserito uno o più frammenti di DNA esogeno

Transgene: frammento di DNA esogeno integrato stabilmente nel patrimonio genetico di cellule animali o vegetali

• Arabadopsis (plant)

• C. elegans

• Fruit flies

• Xenopus (rana)

• Zebrafish

• Topo

Organismi utilizzati come modelli transgenici:

• Ratto

• Maiale

• Pecora

• Capra

• Mucca

Tipi di transgene

• Piccole molecole di DNA ricombinante – geni o cDNA legati a sequenze di DNA che permettono la corretta espressione da parte della cellula ospite

• Construtti Reporter – promoter del gene desiderato legato ad una cassetta di espressione la cui presenza può essere facilmente rilevata; es.: GFP, lacZ, luciferasi

• Grandi molecole di DNA – yeast artificial chromosomes (YACs) o bacterial artificial chromosomes (BACs)

Metodi di Ingegneria animale

Metodi principali di ingegneria animale

Clonazione

Transgenesi condizionale

Transgenesi standard

Gene targeting

Microiniezione di DNA lineare nella cellula uovo fecondata

• SCOPO: Guadagno di funzione

• CARATTERISTICA: inserzione random, casuale

Transgenesi standard

Introduzione di una sequenza di DNA purificata in uno dei

due pronuclei della cellula uovo fecondata

Transgenesi standard Work flow

1 • Preparazione degli oociti fecondati

2 • Preparazione dei costrutti

3 • Preparazione delle femmine “pesudogravide”

• Microiniezione e trasferimento nelle femmine “pseudogravide”

4 • Screening della progenie

Cocktail ormonale per la superovulazione: • PMS (pregnant mares serum) • HCG (human chorionic gonadotropin)

♀ ♀

♂

Accoppiamento

♀

Raccolta degli oociti fecondati

Transgenesi standard Work flow: STEP1

1 • Preparazione degli oociti fecondati

Costruzione del transgene Amplificazione del transgene

Purificazione del transgene

Transgenesi standard Work flow: STEP2

2 • Preparazione dei costrutti

Accoppiamento delle femmine con maschio vasectomizzato

♂ vasectomizzato

♀

Transgenesi standard Work flow: STEP3

3 • Preparazione delle femmine “pesudogravide”

• Microiniezione e trasferimento nelle femmine “pseudogravide”

3 • Preparazione delle femmine “pesudogravide”

• Microiniezione e trasferimento nelle femmine “pseudogravide”

Transgenesi standard Work flow: STEP3

Trasferimento delle uova fecondate microiniettate con il gene di interesse nell’utero di femmina pseudogravida

♀ pseudogravida 100-200X

Transgenesi standard Work flow: STEP3

3 • Preparazione delle femmine “pesudogravide”

• Microiniezione e trasferimento nelle femmine “pseudogravide”

Estrazione DNA dalle code della progenie

Analisi tramite PCR Analisi tramite Southern-blot

M C 1 2 3 4 5 C 1 2 3 4 5

Transgenesi standard Work flow: STEP4

4 • Screening della progenie

Transgenesi standard Efficienza

Transgenesi standard Applicazioni: animali come bioreattori

• Metodo più utilizzato per produrre topi transgenici.

• L’inserzione del transgene è casuale; non si sa dove si è localizzato il transgene;

• Non si può regolare il numero di copie introdotte nel pronucleo, né quante si uniranno in concatameri per l’integrazione;

• Bassa efficienza

Transgenesi standard Vantaggi e svantaggi

Gene Targeting

Ricombinazione omologa in embrionic stem (ES) cells

• SCOPO: perdita o modifica di funzione

• CARATTERISTICA: inserzione mirata

Gene inattivo AGGTGCCTGACT X X

TTCAGCCGATCCA

TTCAGCCGATCCA

AGGTGCCTGACT

Gene inattivo AGGTGCCTGACT TTCAGCCGATCCA

Gene Targeting Meccanismo: ricombinazione omologa

Gene Targeting

Gene Targeting Meccanismo di selezione positiva e negativa

Gene Targeting

1 • Preparazione delle cellule ES pluripotenti

• Trasfezione

2 • Selezione delle cellule ES

3 • Iniezione delle cellule ES trasfettate in una nuova blastocisti

4 • Screening della progenie

Gene Targeting Work flow

Preparazione del transgene Preparazione delle ES pluripotenti dalla blastocisti

Elettroporazione

Sequenze di ricombinazione

Omologa

Neor – resistenza alla Neomicina

Tk - thymidine kinase

Gene non attivo

1 • Preparazione delle cellule ES pluripotenti

• Trasfezione

Gene Targeting Work flow: STEP1

Sequenze di ricombinazione

Omologa

Neor – resistenza alla Neomicina

Tk - thymidine kinase

Gene non attivo

Trattamento con neomicina e ganciclovir

X

X

No integrazione

Integrazione sito-specifica (1/1000)

Integrazione random

Gene Targeting Work flow: STEP2

2 • Selezione delle cellule ES

ES inserite in una blastocisti di topo agouti

Gene Targeting Work flow: STEP3

3 • Iniezione delle cellule ES trasfettate in una nuova blastocisti

Topo “chimera”

Gene Targeting Work flow: STEP4

4 • Screening della progenie

Gene Targeting

Gene Targeting Applicazioni

Mutagenesi MIRATA può avere come risultato:

• KNOCK-OUT: INATTIVAZIONE dell’espressione di un gene

• KNOCK-IN: INSERZIONE di un gene difettivo/selvatico (modelli di

patologie con mutazioni puntiformi; geni reporter)

PREMIO NOBEL per la MEDICINA 2007 Motivazione: for their work on "principles for introducing specific gene modifications

in mice by the use of embryonic stem cells and gene targeting.”

Mario R. Capecchi

Martin J. Evans Oliver Smithies

Gene Targeting Nobel Prize 2007

• RICOMBINAZIONE OMOLOGA

• L’inserzione del transgene è mirata

• Si conosce la localizzazione genica dell’inserimento del transgene;

• Problemi: espressione tempo e spazio specifica?

Gene Targeting Vantaggi e svantaggi

KO condizionali: l’induzione della mutazione tempo e tessuto specifica

Limite KO costitutivi: possibile mortalità degli omozigoti durante lo sviluppo.

Eliminare un gene in un tessuto, in un organo o in una fase particolare di sviluppo

• SCOPO: ottenere informazioni più precise sulla funzione del gene; garantire il normale sviluppo del topo knockout

• CARATTERISTICA: inserzione mirata e specifica

Transgenesi condizionale Il sistema Cre-loxP

KO condizionali Il sistema Cre-loxP

Sistema di RICOMBINAZIONE del fago P1

CRE (cyclization recombination), ricombinasi specifica

LoxP (locus of X-over P1), locus di crossover (2 seq palindrome di 13bp + regione centrale di 8nt)

Cre

KO condizionali Il sistema Cre-loxP

Il sistema Cre-loxP Ricombinazione omologa tra sequenze loxP

Il sistema Cre-loxP Esempio di delezione tessuto specifica

Bockamp E et al., Physiol. Genomics 2002

Il sistema Cre-loxP Screening tramite PCR

Il sistema Cre-loxP Il topo LERKO: esempio di delezione tessuto specifica

Della Torre et al, Cell Metabolism 2011

Il sistema Cre-loxP Ricombinazione omologa tra sequenze loxP

Controllo dell’espressione genica:

• nello SPAZIO: utilizzo di un PROMOTORE TESSUTO SPECIFICO

• nel TEMPO: utilizzo di un PROMOTORE

dipendente dallo STADIO di SVILUPPO

INDUCIBILE

Il sistema Cre-loxP Espressione genica programmabile

DELEZIONE

KO programmabile

INSERZIONE

K-IN programmabile

Il sistema CreER-loxP Delezione spazio/tempo specifica

TEMPO

SPAZIO

CreER(T): proteine di fusione tra Cre e ER (recettore degli estrogeni)

“The perfect conditional transgenic mouse

should include the following criteria:

1. induced overexpression of the transgene should be tightly controlled such that no leaky background expression precludes the accurate analysis.

2. the inducing compound should be nontoxic and highly specific for the target gene.

3. induction kinetics should be fast and expression levels sufficiently high to produce a rapid and detectable effect.

4. the induced switch should be reversible so that defined developmental periods or critical stages in disease can be appropriately monitored.”

Bockamp E et al., Physiol. Genomics 2002

Transgenesi condizionale Controllo binario dell’espressione genica

3 principal events:

1) ligand-mediated activation of a transcriptional transactivator 2) DNA binding of the transactivator 3) transactivator-induced transcriptional activation

Bockamp E et al., Physiol. Genomics 2002

Transgenesi condizionale Controllo binario dell’espressione genica

CBS: cognate binding site

Bockamp E et al., Physiol. Genomics 2002

Transgenesi condizionale Controllo binario dell’espressione genica

Bockamp E et al., Physiol. Genomics 2002

Effector mouse, expressing a ligand-inducible transcriptional transactivator

Responder mouse, which has the capacity to specifically express a chosen transgene upon stimulation by the transactivator.

Il sistema TET-ON/TET-OFF

Sistema a 3 elementi:

• TeT-Repressor: repressore della trascrizione

• Tc/Dox: tetraciclina/doxyciclina

• TRE: tetracycline response element

Il sistema TET-OFF

tTA Tetraycline controlled

transactivator

TetR: tet repressor VP16: transactivation domain of herpes simplex virus

.

Bockamp E et al., Physiol. Genomics 2002

Il sistema TET-OFF

tTA: tetraycline controlled transactivator

Tet-off system (tTA) will activate expression in the absence of its ligand doxycycline.

Upon addition of DOX, transcription of the gene of interest is extinguished.

MHC-tTA/tetO-Ro1 mice

were obtained by crossing a

transgenic mouse line that

expresses Ro1 receptor under

the control of a tetO gene and

another mouse line

expressing tTA gene under the

regulation of a heart-specific

MHC promoter.

Il sistema TET-OFF

Il sistema TET-OFF

VANTAGGI

• Ben note proprietà della Tc/DOX: farmacocinetica, buona distribuzione tissutale, bassa tossicità, capacità di attraversare membrane cellulari

• Grande induzione in alcuni tessuti (anche 5 ordini di grandezza)

SVANTAGGI

• Attività residua del promoter minimale tetO-CMV

• Tossicità cellulare del transattivatore

• Bassa sensitività alla DOX in alcuni tessuti

• Basse cinetiche di induzione in vivo

Il sistema TET-ON

rtTA Reverse tet-on

Tetraycline controlled transactivator

rTetR: reverse tet repressor VP16: transactivation domain of herpes simplex virus

.

Il sistema TET-ON

rtTA: reverse tet-on tetraycline controlled transactivator

Bockamp E et al., Physiol. Genomics 2002

Addition of DOX to the Tet-on system (rtTA) results in transcriptional induction of the gene of interest.

.

Il sistema TET-ON vs TET-OFF

VANTAGGI

• Aumentata velocità di espressione del transgene: completa attivazione in 1 ora, rispetto alle basse cinetiche di attivazione del sistema tet-OFF (fino ad una settimana)

Il sistema TET-ON/TET-OFF

Il sistema TET-ON/TET-OFF

La Tc SPEGNE il GENE La Tc ACCENDE il GENE

http://www.zmg.uni-mainz.de/tetmouse/

Il sistema TET-ON/TET-OFF

Clonazione

Trasferimento del nucleo di una cellula somatica

in un oocita anucleato

• SCOPO: ottenimento di “gemelli” di un fenotipo di interesse

• CARATTERISTICA: il materiale genetico viene copiato in toto

I Cloni vengono ottenuti attraverso Somatic Cell Nuclear Transfer

Clonazione

Clonazione

Clonazione

Clonazione Possibili applicazioni: Trapianto con cellule autologhe

Clonazione Possibili applicazioni: trapianto con cellule autologhe

Cellule staminali ADULTE SCNT

Clonazione Efficienza molto bassa & etica

Vettori retrovirali

Altre tecniche

Yac-transgenic mice

Integrazione di materiale genetico nella cellula ospite

• SCOPO: Guadagno di funzione

• CARATTERISTICA: - inserzione random, casuale

- vettore max 8Kb

- l’animale puo’ risultare contaminato da retrovirus delle cellule helper

Vettori retrovirali

Vettore virale

Vantaggi Svantaggi

Retrovirus Capacità d'inserimento del gene, integrazione stabile nel DNA dell'ospite,

elevati titoli di virus ricombinante, ampio tropismo d'infettività, relativa facilità di

manipolazione del genoma virale

Difficoltà nel controllare l'infezione virale, mancata infezione delle cellule

non in divisione, integrazione a caso nel genoma dell'ospite

Lentivirus Infezione delle cellule in divisione o meno, espressione stabile del gene, elevata capacità

d'inserimento

Mutagenesi potenziale presenza di sequenze proteiche regolatrici e

accessorie

Adenovirus Elevati titoli di virus, alta espressione genica, grande capacità d'inserimento, infezione di

cellule in divisione e non in divisione

Risposte immuni alle proteine virali, nessuna integrazione nel genoma

dell'ospite, espressione genica transitoria

Virus adeno-associati Infettano le cellule in divisione o meno, ampio tropismo cellulare, potenziale d'integrazione,

bassa immunogenicità e non patogenicità

Limitate capacità per i transgeni, difficile generazione di alti titoli virali, presenza di

adenoviruds o herpevirus per la moltiplicazione dei virus adeno-associati

Herpesvirus Infettano un'ampia varietà di tipi cellulari, alta capacità d'inserzione, tropismo naturale per le cellule neuronali, seguita dalla produzione

di alti titoli virali

Possibile tossicità, rischio di ricombinazione, nessuna integrazione

virale nel DNA dell'ospite

Poxvirus Alta capacità d'inserzione, possibile inserzione di grandi framenti di DNA, alti livelli di di

espressione transgenica,, seguita da virus vivo ricombinante

Possibile effetto citopatico

Virus di Epstein-Barr Infetta cellule in divisione o meno con prevalenza per i linfociti B, alta capacità d'inserimento

Difficoltà di controllare le linee cellulari

Vettori retrovirali

• Alta efficienza di trasduzione

• Possibilità di generare nuovi virus patogeni per ricombinazione con eventuali virus presenti nell’ospite

• Mutagenesi inserzionale (per quelli che si integrano in maniera casuale nel genoma)

• Molecole di DNA di dimensioni limitate (max 8 kb)

• Reazioni immunitarie

• Costi elevati

Vettori retrovirali Vantaggi e Svantaggi

YAC (Yeast Artificial Chromosome)

• SCOPO: trasferire GENI di grandi dimensioni 300-1000Kb.

• CARATTERISTICA: cromosoma artificiale che contiene sequenze (telomeri, centromeri, origini di

replicazione) necessarie per la replicazione e la preservazione nelle cellule del lievito.

Yac-transgenic mice

COME SI TRASFERISCE uno YAC nel TOPO?

• Fusione di SFEROPLASTI (cellule Lievito senza parete) + cellule

ES (rischio di contaminazione con genoma Lievito)

• Purificazione di YAC (separato per elettroforesi) + microiniezione

nel pronucleo (se YAC non ha dimensioni grandi, altrimenti si frammenta)

• Trasferimento di YAC nelle ES tramite LIPOSOMI (vescicole lipidiche artificiali per fusione con membrana)

Yac-transgenic mice

Yac-transgenic mice

• YAC di 670Kb contenente il gene umano HPRT in cellule ES di topo (funzione renale)

• YAC di 400Kb contenente il gene umano APP in cellule ES di topo (codifica il precursore della proteina amiloide Alzheimer)

• YAC contenente il gene umano catena leggera/pesante IgG in topo (produzione di anticorpi)

Yac-transgenic mice Esempi di applicazione