LEZIONE 9Ingegneria cellulare 2

Metodi di manipolazione del genoma cellulare

Valeria Benedusi

CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGIE DEL FARMACO AA 2011-12

Titolare del corso: Adriana Maggi

• Retrovirus• Lentivirus (derivati da HIV)• Adenovirus• Virus adeno-associati• Herpesvirus

• Plasmidi nudi• Elettroporazione in vivo• Liposomi• Amine, proteine cariche

positivamente

Vettori virali:

Vettori non virali:

Infezione con vettori viraliI virus si sono evoluti per trasferire il loro DNA

nelle cellule in maniera efficiente e specifica

Infezione Iniezione del DNA Replicazione

Sintesi del capsideAssemblaggio

Lisi

Vettori virali

Vettori virali

• Si ottengono inserendo il gene di interesse nel genoma di diversi tipi di virus, sotto il controllo di un promotore forte.

• In genere vengono introdotte modifiche in modo da rendere il virus incapace di riprodursi autonomamente. Questo è importante per evitare la diffusione di virus ricombinanti

• Il principale vantaggio consiste nell’elevata efficienza di trasduzione (fino al 100% delle cellule).

Il genoma virale deve essere modificatoInserimento del gene di

interesse

Eliminazione dei “late genes”, codificanti per il capside, in modo da evitare la lisi della cellula infettata Virus difettiviPer la produzione del vettore virale si rendono necessarie coinfezioni con i virus “helper” oppure riproduzione in “packaging cell lines” (linee cellulari capaci di complementare i difetti introdotti nel virus)

Vettori virali

Linee cellulari transfettate stabilmente con geni virali codificanti per proteine strutturali

del capside (late genes), necessarie per l’assemblaggio dei virioni.

La loro transfezione transiente con il DNA-vettore determina l’impacchettamento del

costrutto nel virione.Si ottiene in questo modo un vettore virale

di transfezione completo.

Packaging cell lines

Vettori viraliVantaggi: Alta efficienza di trasduzione (fino al 100% delle cellule)

Possono essere specifici per una tipologia cellulare (minore risposta immunitaria e minori effetti off-

target in vivo)Replicano naturalmente in colture cellulari

Svantaggi: Possibilità di generare nuovi virus patogeni per ricombinazione con eventuali virus presenti nell’ospiteMutagenesi inserzionale (se integrazione casuale)Molecole di DNA di dimensioni limitateReazioni immunitarieCosti elevati

Vettore ideale: tropismo per specifiche tipologie cellulariminima trasduzione di cellule off targetalta efficienza di trasduzionedurata dell’espressione che permetta massimo effettoNo risposta immunitaria o patogenesi

Vettore virale Vantaggi Svantaggi

Retrovirus Capacità d'inserimento del gene, integrazione stabile nel DNA

dell'ospite, elevati titoli di virus ricombinante, ampio tropismo d'infettività, relativa facilità di

manipolazione del genoma virale

Difficoltà nel controllare l'infezione virale, mancata infezione delle

cellule non in divisione, integrazione a caso nel genoma

dell'ospite

Lentivirus Infezione delle cellule in divisione o meno, espressione stabile del gene, elevata

capacità d'inserimento

Mutagenesi potenziale presenza di sequenze proteiche regolatrici e

accessorie

Adenovirus Elevati titoli di virus, alta espressione genica, grande capacità d'inserimento, infezione di cellule in divisione e non in

divisione

Risposte immuni alle proteine virali, nessuna integrazione nel genoma

dell'ospite, espressione genica transitoria

Virus adeno-associati

Infettano le cellule in divisione o meno, ampio tropismo cellulare, potenziale

d'integrazione, bassa immunogenicità e non patogenicità

Limitate capacità per i transgeni, difficile generazione di alti titoli virali,

presenza di adenoviruds o herpevirus per la moltiplicazione dei virus adeno-

associati

Herpesvirus Infettano un'ampia varietà di tipi cellulari, alta capacità d'inserzione, tropismo

naturale per le cellule neuronali, seguita dalla produzione di alti titoli virali

Possibile tossicità, rischio di ricombinazione, nessuna

integrazione virale nel DNA dell'ospite

Poxvirus Alta capacità d'inserzione, possibile inserzione di grandi framenti di DNA, alti

livelli di di espressione transgenica,, seguita da virus vivo ricombinante

Possibile effetto citopatico

Virus di Epstein-Barr Infetta cellule in divisione o meno con prevalenza per i linfociti B, alta capacità d'inserimento

Difficoltà di controllare le linee cellulari

Vettori virali

(Mutagenesi inserzionale)

Affinità per diverse tipologie cellulari

Ciclo vitale dei RetrovirusRetrovirus (genoma a ssRNA)

dsDNA non passa attraverso i pori nucleari, quindi integrazione avviene solo quando la cellula si sta dividendo

• virus con envelope• genoma di 10 Kb costituito da una molecola di RNAss• dopo l’infezione il genoma è retrotrascritto a DNAds• integra nel genoma dell’ospite (possibile mutagenesi)• infetta solo cellule in divisione

LTR LTRgag pol env

• gag: codifica per le proteine del core• pol: codifica per la trascrittasi inversa• env: codifica per le proteine dell’envelope• LTR: long terminal repeat, comprendono

promotore/enhancers e sequenze necessarie per l’integrazione

• : sequenze per il packaging

Retrovirus

Vettori retrovirali

Per costruire un vettore retrovirale è necessario rimuovere i geni codificanti per gag (core virale),

pol (trascrittasi inversa e integrasi) e env (involucro virale).

Si ottiene così lo spazio per l’inserto di DNA ma la replicazione virale può verificarsi solo nelle

“packaging cell lines” o in presenza di virus helper

Packaging cell lines

Le proteine virali necessarie per l’infezione iniziale vengono fornite in trans da virus helper

Virus helper

Vettori retrovirali

Vantaggi: Non provocano malattie umaneScarsa risposta immunitariaLunghezza inserti di DNA ≤8 kbIntegrazione stabile nel DNA dell’ospite

(transgene può essere espresso per tutta la vita dell’ospite)

Ampio tropismoAlta efficienza di trasduzione

Svantaggi: Incapacità di infettare cellule quiescentiIntegrazione casuale nel genoma dell’ospite (mutagenesi inserzionale oncogenesi)

Vettori retroviraliApplicazioni

Riparazioni ossee: vettori retrovirali usati per inviare fattori di crescita e di differenziamento a cellule ossee mature o cellule staminaliRiparazione cartilagineClinical trial per trattamento X-linked severe combined immunodeficiency (X-SCID) infezione di cellule ematopoietiche con vettori retrovirali contenenti gene per IL2Rg miglioramento funzionalità linfociti T

Lentivirus (genoma a ssRNA)

Sono una classe di retrovirusIl più comune lentivirus è l’HIV e il più comune vettore lentivirale viene costruito da questo virus.Per la costruzione del vettore i geni codificanti per gag, pol, env e per altri geni regolatori e accessori vengono deleti e inseriti in plasmidi helper (come per i retrovirus)

Virus HIV

Vettori lentiviraliVantaggi: Infezione di cellule in divisione o quiescenti

lunghezza inserti di DNA di dimensioni ≤8 kbEspressione stabile del geneIntegrazione stabile nel DNA dell’ospite

(espressione del transgene per tutta la vita dell’ospite)

Non vengono inattivati dal complementoEspressione duratura

Svantaggi: Integrazione casuale nel genoma dell’ospite (mutagenesi inserzionale)PatogenesiDifficili da coltivare

Vettori lentiviraliApplicazioni

Grazie alla loro capacità di veicolare grossi geni vengono usati per la produzione di animali transgenici con espressione tessuto-specifica del transgeneUtilizzati in cellule quiescenti (neuroni o cellule cardiache)Primo trial approvato –> Anti-HIV RNA therapyAdrenoleucodistrofiaMorbo di ParkinsonBeta-talassemiaCancro

• virus senza envelope, struttura icosaedrica regolare

• genoma di 36 Kb costituito da una molecola di DNAds

• il genoma è fiancheggiato da sequenze ITR (inverted terminal repeats) che servono come origine di replicazione

• dopo l’infezione il virus entra nel nucleo della cellula ospite e viene replicato

• non si integra nel genoma dell’ospite (resta episomale)

• infetta sia celule in divisione che non

• dotato di ampio tropismo

Adenovirus (genoma a dsDNA)

Trascrizione DNA virale: Early phase: trascritti geni che portano la cellula ospite nella fase S della mitosi e ne inibiscono apoptosi, codificano per DNA Pol e altre proteine necessarie per replicazione DNA virale e inibiscono risposta cellulare all’infezioneLate phase: replicazione DNA virale, assemblaggio nuove particelle virali e rilascio tramite lisi della cellula ospite

Adenovirus

Geni deleti nella generazione di vettori

virali

• E1A: coinvolto nell’attivazione della trascrizione e nella promozione dell’entrata della cellula ospite in fase S (lega Rb inducendo il rilascio del fattore di trascrizione E2F)

• E1B: blocca azione di p53, evitando entrata della cellula in apoptosi

• E2: codifica per 3 proteine coinvolte nella replicazione del DNA e nella modulazione della trascrizione (DNA-pol; proteina terminale e DNA-binding protein)

• E3: modula la risposta immunitaria

• E4: regola la trascrizione, la transizione dell’espressione da early a late gene, la replicazione virale e l’assemblamento dei virioni

• • L1-5: coinvolti nella produzione e nell’assemblaggio delle proteine del

capside

E1a E1b L1 L2 L3 L4 E3 L5

E2b E2a E4

3’

5’

Geni Early (E) e geni Late (L)

Generati sostituendo i geni E1a e E1b con il transgene di interesse, posto sotto il controllo di un elemento enhancer e di un promotore.Il vettore così ottenuto è replicazione-difettivo e le funzioni replicative vengono fornite in trans da un virus helper (privato della sequenza e di E1) .Il vettore è cresciuto in E1-expressing cell-lines (es. cellule 293A che presentano una copia del gene E1 integrata stabilmente).

Vettori adenovirali: helper dipendenti

Vettori adenovirali helper-dipendenti di nuova generazione: sono vettori ad alta capacità.

Sfruttano il fatto che tutte le proteine adenovirali possono essere complementate in trans, quindi quasi tutta la sequenza codificante può essere sostituita dal transgene che può avere dimensioni comprese tra 100 b e 36 Kb.

Le uniche sequenze essenziali in cis sono le ITRs e la sequenza .

Vettori adenovirali: gutless

1. Vettore virale: contiene solo sequenze ITRs e + la cassetta di espressione del trangene

2. Cellule di packaging (293): esprimono gene E13. Virus Helper: E1-deleto, privo di sequenza . Fornisce elementi

strutturali

PRODUZIONE DI VETTORI GUTLESS

Vantaggi: Produzione di elevata quantità di virusEsprimono ad alti livelliLunghezza inserti di DNA ≤8 kb, fino a

36 kb per i gutless AVInfezione di cellule in divisione e quiescentiAmpio tropismoSicuri (non integrano nel genoma)

Svantaggi: Risposta immunitariaEspressione genica transitoria

Vettori adenovirali

Vettori adenoviraliApplicazioni

Cancro vettori esprimenti geni oncosoppressori come p53 o p16 alle cellule tumoraliSuicide therapy usa proteine virali per metabolizzare farmaci non tossici a farmaci tossici

Es: Cancro alla prostata: Adenovirus codificante per nitroreduttasi batterica in combinazione con

profarmaco CB1954Patologie del fegato siRNA contro PAI-1 nella fibrosi epaticaDifferenziamento cellule staminaliAIDSPatologie cardiovascolariTubercolosi

• capside icosaedrico• no envelope• genoma fiancheggiato da sequenze ITRs, che

contengono la sequenza di packaging• solo due tipi di geni: cap (proteine del

capside) rep (proteine necessarie per la replicazione e

l’integrazione)

• per replicare necessita della presenza di un adenovirus o di un Herpes simplex virus (virus helper)

• in assenza di AV o HSV, i virus AAV integrano stabilmente nel genoma della cellula ospite con un’alta frequenza, in una regione precisa del cromosoma 19 (19q 13,3q-ter)

• una successiva superinfezione con AV o HSV attiva la replicazione del virus integrato

Virus adeno-associati (genoma a ssDNA)

Virus adeno-associati

Per la costruzione di vettori virali vengono deleti geni Rep e Cap

(necessari per replicazione DNA e assemblaggio capside) per creare spazio all’inserto di DNA esogeno.

Queste proteine necessarie vengono espresse da un plasmide

coinfettato, eliminando la necessità di coinfettare la cellula

con Adenovirus helper

• Il vettore: è costruito sostituendo il transgene a Cap e Rep, in quanto le sequenze ITRs contengono tutte le informazioni necessarie per l’integrazione e per il packaging.

• Le cellule di packaging: linea cellulare 293 transfettata con un plasmide contenente i geni cap e rep e successivamente infettata con un adenovirus helper difettivo per E1 e privo della sequenza .

Recentemente è stato sviluppato un nuovo sistema di produzione: il virus helper è sostituito con un plasmide mini-Ad (contiene parte del genoma di adenovirus)

Vettori virali adeno-associati

Vantaggi: non patogeni per l’uomoAmpio tropismoAlta efficienza di trasduzioneInfezione di cellule in divisione o quiescentiMantiene alti livelli di espressione in

vivo (anni)Integrazione sito-specifica nel genomaProdotti in grosse quantità

Svantaggi: Lunghezza inserti di DNA ≤4,1-4,9 kbnon è in grado di replicarsi senza assistenza di virus helper (Es. Adenovirus) o Herpes virus

Vettori virali adeno-associati

Adatti per ingegneria tissutale perché stabili in diversi tessuti fino a 1 anno (cervello, muscolo, occhio)Diversi sierotipi hanno diverse proteine del capside che conferiscono specificità tissutale:Es: AAV1 muscolo

AAV6 polmoneAAV7 fegato

Sierotipi mosaico: combinazione di diversi vettori AAVTrials per terapia genicaPatologie monogeniche e cancroFibrosi cistica aerosol con vettore AAV contenente regolatore transmembrana della Fibrosi cistica

Vettori adeno-associati Applicazioni

Vantaggi: Tropismo per cellule neuronaliLunghezza inserti di DNA di 30-100 kbPossibilità di produrre alti titoli virali

Svantaggi: TossicitàRischio ricombinazioneMancata integrazione nel genoma dell’ospite

Herpes simplex virus (genoma a dsDNA)

Inizialmente effettua un’infezione produttiva nelle cellule epiteliali (ciclo litico), risale poi attraverso le terminazioni dei nervi sensoriali fino ai gangli dorsali. Qui stabilisce un’infezione latente (non necessita di espressione genica). Il ciclo litico viene riattivato periodicamente: le nuove particelle virali vengono trasportate con trasporto anterogrado e provocano lesioni a livello epiteliale

1. DISABLED HSV VECTORS

Virus ricombinanti ottenuti eliminando uno o più geni precoci immediati.Vengono prodotti in cellule di packaging che complementano i geni mancanti.

Vettori di ultima generazione: prodotti eliminando il gene che codifica per la glicoproteina-H di HSV-1 e cresciuti in una linea cellulare che complementa questa proteina. I virus ottenuti sono infettivi, ma possono effettuare un solo ciclo di infezione.

2. AMPLICON HSV VECTORSSi usa un amplicone, un plasmide contenente:

• un’origine di replicazione batterica (generalmente da Escherichia coli),

• un’origine di replicazione di HSV-1 (OriS)• la sequenza di packaging di HSV-1• il transgene

Il tutto viene inserito in una linea cellulare infettata da un virus helper contenente i geni regolatori e strutturali mancanti.

Baculovirus (genoma a dsDNA)

Vantaggi: Non patogeno e non tossicoIncapace di replicare in cellule di mammifero Si degrada nella cellula ospite col tempoNon immunogenico: poiché in natura infetta

insetti e invertebrati, l’uomo non ha anticorpi o linfociti T contro questo virus

Lunghezza inserti di DNA ≤ 30 kb

Svantaggi: Rapida inattivazione da parte del sistema del complemento (vettore ricoperto con

Polietilenimine per proteggerlo)Molto utilizzato in studi su animali per veicolare geni a diverse tipologie cellulari e per la produzione di proteine ricombinanti in insetti, sarà oggetto di futuri studi

Poxvirus (genoma a dsDNA)

A questo gruppo appartiene il virus del vaioloTra i primi virus animali usati per costruire vettori per gene transferReplicazione del genoma nel citoplasma e non nel nucleo

Vantaggi: Incapacità di replicare nelle cellule umane (linee MVA e NYVAC)

Lunghezza inserti di DNA ≤ 25 kbAlti livelli di espressione

Svantaggi: Possibile citossicità

PoxvirusApplicazioni

Studiati come vettori virali per suscitare risposta immunitaria in patologie diventate resistenti ai farmaci Cancro utilizzati per veicolare antigeni alle cellule tumorali che ne permettano il riconoscimento da parte del sistema immunitario

Vantaggi dei vettori non virali

• Impossibile la generazione di nuovi virus patogeni• Riduzione del rischio di reazione immunitaria• Possono trasferire molti tipi diversi di molecole, e permettono di trasdurre

molecole di DNA anche molto grandi• Possibilità di produzione in grandi quantità a basso costo

Svantaggi dei vettori non virali• Scarsa efficienza sia di trasduzione che di integrazione • Se integrati possono a loro volta dare mutagenesi inserzionale

Vantaggi dei vettori virali

Svantaggi dei vettori virali

• Alta efficienza di trasduzione

• Possibilità di generare nuovi virus patogeni per ricombinazione con eventuali virus presenti nell’ospite

• Mutagenesi inserzionale (per quelli che si integrano in maniera casuale nel genoma)

• Molecole di DNA di dimensioni limitate• Reazioni immunitarie• Costi elevati

Caratteristiche del vettore ideale per la TERAPIA GENICA

• Efficiente (trasdurre un numero di cellule elevato).• Dovrebbe garantire una prolungata produzione della proteinaterapeutica (a livelli adeguati).• Capace di incorporare DNA di varie dimensioni.• Dovrebbe garantire la regolazione (trascrizionale, traduzionale opost-traduzionale) dell’espressione del gene terapeutico• Non dovrebbe essere patogeno.• Somministrabile direttamente nel paziente.• In grado di raggiungere specificamente le cellule bersaglio.• Ben tollerato.• Non dovrebbe avere componenti che inducono risposta immune.• Facile da produrre in maniera riproducibile.

Integrazione di DNA esogeno nel genoma cellulare

Gene trapping ( integrazione casuale nel genoma di un costrutto contenente un gene

reporter (entrapment vector))

Gene targeting (integrazione sito-specifica mediante ricombinazione omologa)

SA

Endogenous gene X

SA pA

P'

pA

Vector Integration

DNA

RNA

protein

Spliced transcript

β-gal NeoR

Gene Trapping

SA

PROTEIN X

Vector

lac Z neo

lac Z neo

lac Z neo

PromotoreASSENTE

Introne gene X

Promotore e pAINDIPENDENTI

Distruzione GENE X e ANALISI ESPRESSIONE

Gene Trapping

Il GENE TRAPPING consente

1)Identificazione NUOVI GENI2)Produzione di TOPI TRANSGENICI (KO)3)ANALISI dell’ESPRESSIONE di GENI

GENE TARGETING

Mutagenesi MIRATA mediante ricombinazione omologa in cellule ES

Permette la creazione di una mutazione in un gene PREDETERMINATO

Questa mutagenesi può avere come risultato:

1) INATTIVAZIONE dell’espressione di un gene (KNOCK-OUT)2) DIMINUZIONE dell’espressione di un gene (KNOCK-DOWN)3) INSERZIONE di un gene difettivo/selvatico (correzione) (KNOCK-IN)

IL GENE TARGETING SFRUTTA LA RICOMBINAZIONE OMOLOGA

DNA esogeno

DNA genomico

La ricombinazione omologa è il processo alla base della

integrazione sito specificaEs. di gene targeting

vettori utilizzati per GENE TARGETING

1) VETTORI DI INSERZIONE (per produzione di TOPI KNOCK-OUT)

2) VETTORI DI SOSTITUZIONE (per produzione di TOPI KNOCK-IN)

Gene di interesse

M: marker esternoalla regione omologa

Gene di interesse

M: marker internoalla regione omologa

Singolo evento di ricombinazioneDistruzione del locus genico: KO

Doppia ricombinazioneSostituzione di parti del locus genico1) Per correggere un gene2) Per produrne forma inattiva

C9H13N5O4 peso molecolare: 255.23

Gancyclovir, un analogo della 2-deossi-guanosina che puo’ essere fosforilato ad un analogo della deossi-guanosina trifosfato (dGTP) da parte dell’enzima timidina chinasi di

Herpes simplex.

Venendo incorporato nel DNA al posto della dGTP inibisce per competizione l’incorporazione di dGTP da parte della

DNA polimerasi virale, portando alla terminazione dell’elongazione del DNA virale.

A neor tk

A*

A neor A neor tk

neomicina neomicina neomicina

A neor A neor tk

gancyclovir gancyclovir

Integrazione sito-

specificaIntegrazione

random

Nessuna inserzione

Cellule uccise dalla neomicina

Cellule resistenti alla neomicina, uccise da gancyclovir

A neor

Cellule resistenti sia alla neomicina che al gancyclovirRegioni di omologia

Tk = timidina kinasi

GENE knock-out; GENE Knock-in

Mutanti tk- non sopravvivono in terreno HAT (contenente ipoxantina, aminopterina e timidina) se la via di salvataggio non è

praticabile

Timidino chinasiNucleotidi: Biosintesi ex novo o

“salvataggio”L’enzima tk è necessario alla via di salvataggio

5-fosforibosil-1-pirofosfato

Uridina monofostato

Inosina monofosta

to

Timidina monofostato

AMINOPTERINA

Guanina monofostato

Adenina monofostato

IpoxantinaTimidina

Blocca sintesi purine e pirimidine

3. Modalità di trasfezione

Transfezione transiente o stabileTecnologia per la transfezione

Transfezioni transienti o stabili

Transfezioni transienti: il gene esogeno entra nel nucleo e viene trascritto dalla RNA pol II ma non si integra nel genoma della cellula transfettata. Serve

marcatore dell’efficienza di transfezione. A ogni mitosi raddoppiano le cellule e si dimezza la quantità di DNA

trasfettato in rapporto alle cellule che viene perso dopo pochi cicli replicativi

Transfezioni stabili: il gene esogeno viene integrato nel genoma della cellula ed in presenza di una adeguata

pressione selettiva (gene marcatore che conferisce alla cellula la capacità di crescere in un terreno selettivo)

viene mantenuto per numerosi passaggi in coltura duplicandosi con il genoma cellulare.La probabilità di integrazione stabile è dell’ordine di 10-

4, 10-6 sul totale delle cellule transfettate

Transfezione stabile

Durante le prime 48 ore dopo la transfezione, fino al 50%

delle cellule contengono il DNA esogeno. In seguito, a causa della degradazione e della

diluizione, le cellule che non hanno integrato tale DNA nel loro genoma lo perdono. Per isolare le cellule transfettate stabilmente occorre applicare

una pressione selettiva, utilizzando un apposito marker

di selezione.

Marcatori di selezione per cellule di mammifero

Tk fosforila la timidina

Aminopterina (Inibisce sintesi

timidina-P)

Timidina chinasi (Tk)

XGPRT sintetizza GMP

Acido micofenolico(Inibisce sintesi

GMP)

Xantina-guanina fosforibosil

transferasi (XGPRT)

Inattiva Xyl-A9-b-D-furanosil (Xyl-A)

(danneggia DNA)

Adenosina deaminasi (ADA)

HPH inattiva igromicina

Igromicina B (Inibitore sintesi

proteica)

Igromicina fosfotransferasi

(HPH)

Variante resistente DHFR

Metotrexate (Inibisce DHFR)

Diidrofolato reduttasi (DHFR)

APH inattiva G418G418 (Inibitore sintesi proteica)

Aminoglicoside fosfotransferasi

(APH)

MECCANISMOFARMACOENZIMA

Transfezione transiente - applicazione

Studio della regolazione dell’espressione genica con sistemi reporter

Studio dei meccanismi di trasduzione del segnale

Identificazione di molecole attive su enzimi o recettori

Studi di correlazione struttura attività di mutanti

Transfezione stabile - applicazioni

Generazione di linee cellulari con caratteristiche specifiche per la

produzione di biofarmaci o lo screening di molecole farmacologicamente attive.

Servono markers specifici per poter selezionare le cellule transfettate