Watson e Crick Rosalind Franklin - Biology, Genetics and ... · Esistono origini di replicazione...
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De Leo - Fasano - Ginelli – Biologia e Genetica, II Ed. – Capitolo 4 Rosalind Franklin Watson e Crick
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Rosalind Franklin
Watson e Crick
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Le cellule eucariotiche svolgono durante la loro vita una serieordinata di eventi che costituiscono il
Ciclo Cellulare.citochinesi:
o citodieresi. Divisione del citoplasma e formazione di membrane plasmatiche indipendenti, nelle due cellule figlie dopo la mitosi.
diploide:Che possiede un doppio assetto cromosomico.
fase G1:E' la fase del ciclo cellulare in cui la cellula non ha
ancora replicato il DNA per dividersi.
fase G2:E' la fase che precede la mitosi. Le cellule in questa
fase hanno tutti i cromosomi duplicati.
fase M:Comprende la mitosi e la citochinesi.
fase S:E' la fase del ciclo cellulare, compresa fra la G1 e la
G2, in cui il DNA viene replicato.
interfase:Periodo del ciclo cellulare durante il quale non vi è
mitosi o citochinesi.
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Interfase comprende le fasi G1, S, and G2
Le macromolecole come proteine e lipidi sono sintetizzate durante la faseG1
Il DNA è sintetizzato durante la fase S.
Durante la G2 le cellule si preparanoalla divisione (M) il DNA duplicatoviene suddiviso alle due cellule figlie.
Le cellule che non si dividono esconodal normale ciclo ed entrano nella G0.
Nelle cellule in proliferazione le 4 fasi impiegano dalle 10 – 20 orein dipendenza del tipo cellulare
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FormazioneFormazione delladella BollaBolla didi replicazionereplicazione: 2 : 2 forcelleforcelle didi replicazionereplicazione ((bidirezionalibidirezionali))
EnzimiEnzimi coninvolticoninvolti nellanella formazioneformazione delladella BollaBolla didi replicazionereplicazione: :
••ElicasiElicasi
••SSB (single strand binding protein)SSB (single strand binding protein)
••TopoisomerasiTopoisomerasi
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ProblemaProblema causaticausati dalladalla formazioneformazione
delladella bollabolla didi replicazionereplicazione::
La La torsionetorsione necessarianecessaria per per separareseparare I I
due due filamentifilamenti creerebbecreerebbe a a vallevalle delledelle
forcelleforcelle deidei grovigligrovigli didi filamentifilamenti didi
DNA DNA cheche non non permetterebberopermetterebbero
ll’’avanzamentoavanzamento delldell’’apparatoapparato didi
duplicazioneduplicazione. .
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In una molecola di DNA sono presenti 10 basi ogni giro d’elica. Lo stress torsionale necessario per aprire la doppia elica produce un superavvolgimento del DNA cheporterà ad una variazione del numero di basi per giro d’elica. Si creano così degli isomeri topologici del DNA (TOPOISOMERI).
Le topoisomerasi trasformano un topoisomero in un altro.
TopoisomerasiTopoisomerasi didi tipotipo II: tagliano uno dei due filamenti ruotandolo attorno quello non tagliato. Il taglioviene riparato ed il DNA torna in forma rilassata
TopoisomerasiTopoisomerasi didi tipotipo IIII: tagliano e ricongiungonoentrambi I filamenti.
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Topoisomerasi di tipo ITopoisomerasi di tipo I
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Topoisomerasi di tipo IITopoisomerasi di tipo II
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Le DNA polimerasi per cominciare la sintesinecessitano di un innesco (primer).
Il primer è un piccolo RNA (~ 10 nt).
Sintetizzato da una RNA polimerasi DNA dipendente: DNA DNA primasiprimasi
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Problema connesso all’avanzamento della forcella e sintesi di entrambi I filamenti:Il filamento che viene sintetizzato nella stessa direzione della forcella di replicazioneviene sintetizzato in modo continuo (filamento leading, filamento guida, filamentoanticipato).
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Problema connesso all’avanzamento della forcella e sintesi di entrambi I filamenti:Il filamento neosintetizzato che espone il 5’ P verso la direzione diavanzamento della forcella non può essere sintetizzato di continuo ma per frammenti(sintetizzati nella direzione opposta) che prendono il nome di frammenti di Okazaki. Questo filamento viene chiamato filamento lagging, filamento in ritardo, filamentolento.
filamento
filamento leadingleading
filamen
to
filamen
tolag
ging
laggin
g
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La sintesi in un filamento (3’-5’) è continua nell’altro (5’ – 3’) è discontinua.
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Gli inneschi di RNA verranno rimossi dall’attività esonucleasica 5’P 3’OH di DNApolI nel proc. e dall’ RNasi H negli euc.
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Attività esonucleasica 3’OH 5’P della DNA pol III dei batteri e δ negli eucarioti.AttivitAttivitàà di correzione di bozzedi correzione di bozze
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Sito di origine: oriCoriC (ricco in A-T)Proteina di inizio: dnaAdnaAElicasiElicasi e e PrimasiPrimasi formanoformano ililprimosomaprimosomaSSB: SSB: stabilizzano i singoli filamenti.La primasiprimasi sintetizza il primer di RNALa DNA DNA polpol IIIIII comincia a sintetizzare il filamento leadingTopoisomerasi II (girasigirasi)Elicasi: per lo svolgimento di ogni giro d’elica impiega una mol di ATP
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Il filamento lagging forma un’ansa consentendo alla DNA pol III di muoversinella stessa direzione della forcella e sintetizzare I nuovi filamenti su entrambigli stampi in direzione 5’P – 3’OH
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Le due forcelle di replicazione si
incontreranno in una regione del cromosoma
batterico che prende il nome di TERTER
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Genoma molto più esteso rispetto ai procarioti
Velocità di polimerizzazione più bassa di 10 volte rispetto ai procarioti
Esistono origini di replicazione multiple (repliconirepliconi) distanti tra loro 30 – 50 kb
Durata della sintesi del DNA ~ 6 – 8 ore.
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Complesso Primasi/DNApolPrimasi/DNApolααααααααpolimerizza il primer ed un piccolo tratto di DNA.
Il fattorefattore didi replicazionereplicazione CC (RF-C) e ll’’AntigeneAntigene NucleareNucleare didiProliferazioneProliferazione CellulareCellulare (PCNA) in un processo ATP dipendentescalzano il complessoPrimasi/DNApolα e consentono illegame della DNApolDNApolδδδδδδδδ
La DNApolDNApolαααααααα ha un ruolo anche neiprocessi di riparazione
I primers sono rimossi dall’’RNasiHRNasiHin cooperazione con FENFEN--11 (Flap Endonuclease)DNA polymerase εεεε also plays a major role in DNA replication; its precise role is unclear, but it may sometimes substitute for DNA polymerase δ in lagging strand synthesis
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RNA primers are placed every 50 or so nucleotides. About 10-nucleotide lengths of RNA primer are extended through additionof 10 to 20 deoxynucleotides by DNA polymerase α before DNA
polymerase δ (or ε) enters
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Il PCNAPCNA oltre ad avere un ruolofondamentale nella duplicazione, è coinvolto nella regolazioneregolazionedel del ciclociclo cellularecellulare. .
È in grado di legare la ciclinaciclina DD(che ha un ruolo importante per l’ingresso delle cellule in faseG1). La ciclina D blocca PCNA edevita che si abbia la sintesi del DNA. Quando la cellula entra in fase S I livelli di ciclina D diminuiscono e PCNA puòiniziare la trascrizione.
PCNA è coinvolto anche nellariparazioneriparazione del DNAdel DNA. Quandoil DNA è danneggiato vieneattivata la proteina p21p21 che legaPCNA e blocca la sintesi del DNA sino a quando il danno non saràriparato
De Leo - Fasano - Ginelli – Biologia e Genetica, II Ed. – Capitolo 4ÈÈ un un problemaproblema cheche riguardariguarda
ll’’estremitestremitàà 33’’OH OH deidei telomeritelomeri. .
DopoDopo cheche ilil primer primer didi RNA RNA èè statostato
rimossorimosso come come verrverràà riempitoriempito ilil
gap?gap?
QuestoQuesto fenomenofenomeno causerebbecauserebbe
ll’’accorciamentoaccorciamento deidei cromosomicromosomi ad ad
ogniogni ciclociclo didi replicazionereplicazione..
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Le telomerasitelomerasi allungano l’estremità 3’OH dei telomeri consentendo così di avere uno
stampo più lungo per l’azione della primasi
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Le telomerasitelomerasi sono costituite da
1. una parte enzimatica: TERTTERT (trascrittasi inversa)
2. Un piccolo RNA (TERCTERC) che riconosce le
sequenze ripetute che caratterizzano le estremità
telomeriche
Le telomerasi sono inattiveinattive nelle cellule somatiche,
ma attiveattive nelle cellule germinali, staminali e
tumorali
Proteine come TRF1TRF1 e TEBPTEBP (telomere end binding
protein) regolano l’azione delle telomerasi. TEBPTEBP
si lega sul tratto a singola elica sintetizzato dalla
telomerasi (spiazzandola) proteggendola ed
evitando che inneschi un segnale di danno al
DNA che potrebbe arrestare la progressione del
ciclo cellulare
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after telomerase has extended the 3′ end by a sufficient amount a new Okazakifragment is primed and synthesized, converting the 3′ extension into a completely double-stranded end.
The telomerase RNA then translocates to a new base-pairing position slightly furtheralong the DNA polynucleotide and the molecule is extended by a few more nucleotides. The process can be repeateduntil the chromosome end has beenextended by a sufficient amount.
De Leo - Fasano - Ginelli – Biologia e Genetica, II Ed. – Capitolo 4L'energia luminosa ultravioletta viene assorbita dal doppio legame che si rompe e può reagire con la base azotata vicina. Se questa è un'altra timina o citosina si può formare un legame covalente tra le due basi.
Questi dimeri sono pericolosi e formano una rigida piega nel DNA che causa dei problemi quando la cellula deve duplicare il DNA. La DNA Polimerasi legge con difficoltà il dimero perchè questo non si adatta in modo flessibile alla forma del suo sito attivo.
l'enzima fotoliasi che rompe i legami che tengono unite le due basi azotate del dimero (utilizza la luce visibile per innescare il processo)
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Vi sono glicosidasi diverse per diversi tipi di lesione. La base danneggiata viene riconosciuta dalla glicosidasi in quanto protrude fuori dalla doppia elica.
La distorsionenella catena, prodotta dallalesione, induce la rimozione diun corto segmento a singolofilamento che include la lesione.Tale attività in E.coli dipendedall’attività di 4 proteine (UvrA-BC-D). Un sistema analogo, mamolto più complesso è attivonegli eucarioti (proteine XPA,XPC, ecc.).
Lo stesso sistema ècapace di recuperare lemolecole di RNA polimerasibloccate in seguito a lesione.Tale fenomeno noto comeriparazione accoppiata allatrascrizione garantisce lariparazione del DNA in regioniattivamente trascritte.
(NER)
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Il complesso di proteine UVR è
il responsabile del
riconoscimento del sito
danneggiato e del suo taglio.
La DNA pol I sintetizza il DNA
mancante e la ligasi ripristina il
legame fosfodiesterico.
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Difetti a carico dei geni coinvolti neimeccanismi di NER:
Xeroderma pigmentoso (ipersensibilità agliUV)
Sindrome di Cockayne (ipersensibilità agliUV ed agli agenti chimici)
Tricotiodistrofia: sensibilità della pelle e fragilità di unghia e capelli
De Leo - Fasano - Ginelli – Biologia e Genetica, II Ed. – Capitolo 4MISMATCH REPAIRMISMATCH REPAIR
Rimozione di una base mal appaiata: vienericonosciuto e tagliato solo il filamento di nuovasintesi grazie al riconoscimentoriconoscimento didi un un tagliotaglio(nick) che normalmente caratterizza i filamenti dinuova sintesi (negli eucarioti); mentre nei procariotiviene riconosciutoriconosciuto ilil filamentofilamento demetilatodemetilato(caratteristica dei filamenti neosintetizzati)
