Lezione VII. Struttura e replicazione del DNA · Forma A Forma B Forma Z destrorse sinistrorsa....
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Struttura e replicazione del DNA
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Struttura e replicazione del DNA
La struttura del DNA e’ stata chiarita nel 1953 ad opera di Watson e Crick
A quel tempo si sapeva che:
- I geni erano fattori ereditari (Mendel)
- I geni controllano la struttura delle proteine
- I geni si trovano sui cromosomi
- I cromosomi consistono in DNA e proteine
Il DNA e’ il materiale genetico (Griffith 1928)
Virulento con rivestimento o capsula polisaccaridica
S (smooth)
Agente eziologico della polmonite Streptococcus Pneumoniae, letale per i topi
Non virulento
R (rough)
La trasformazione
Dai cadaveri dei topi morti vennero recuperate cellule batteriche vive che formavano colonie di tipo liscio e che in una successiva infezione risultavano virulente
I resti delle cellule virulente (S) morte col calore avevano convertito le cellule R vive in cellule S
trasformazione
Avery, McLeodSaggio delle componenti dei batteri virulenti uccisi dal calore
Il DNA e’ in grado di trasformare le cellule R, determinando la capacita’ di produrre il “carattere”virulento rappresentato dalla capsula polisaccaridica
Dimostrazione definitiva: esperimenti di Hersey/Chase
DNA• Molecola trasmessa dai fagi nei
batteri e che permette la formazione di nuove particelle fagiche
• Materiale ereditario• Molecola semplice• Come traduce l’informazione in
proteine?• Come si replica?
La sintesi del DNA avviene nella fase S
Le unita’ costitutive del DNA: i nucleotidi
A G
C T
Acido desossiribonucleico
DNA RNA
Le basi azotate
Diffrattogramma del DNA-Molecola lunga e sottile
-Composta da 2 parti simili fra loro parallele
- Molecola elicoidale
Le regole di ChargaffT+C=A+G
A+T≠C+G
Rapporti molari delle basi in DNA di varia origine
La doppia elica di DNA di
Watson & Crick
Modello della struttura ad elica del DNA
Legami idrogeno
Direzioni opposte: 2 catene antiparallele
La stima del diametro del DNA si accorda con l’appaiamento base purinica-base pirimidinica
Legami idrogeno A-T, C-G
Tratti di DNA C-G sono piu’stabili dei tratti A-T
L’impilamento delle basi dà origine a 2 solchi: solco maggiore e solco minore
Forma A Forma B Forma Z
destrorse sinistrorsa
Modello della replicazione del DNA proposto da Watson e Crick
Data la complementarieta’ delle basi, ciascuno dei 2 filamenti di DNA funge da STAMPO per formare 2 doppie eliche,
identiche a quelle originali, usando i nucleotidi liberi presenti nella cellula
Ogni filamento funge da stampo per la costruzione di una nuova catena di DNA
La complementarietà delle basi, ovvero l’inserimento
della base complementare sul nuovo filamento, garantisce la
fedeltà della trasmissione dell’informazione genetica
Modelli alternativi per la replicazione del DNA
Replicazione semiconservativa
Replicazione conservativa
Replicazione dispersiva
Prove della replicazione semiconservativa del DNA: Meselson-Stahl (1958)
Meselson-Stahl
Purificazione del DNA in gradiente di CsCl
Soluzione CsCl
soluzione CsCl
soluzione CsCl
Bande di DNA pesante (15N) e leggero (14N)
Solo il modello semiconservativo e’ in accordo con l’esperimento di Meselson-Stahl
15N
15N
15N
Cromosomi arlecchinoVisualizzazione della replicazione semiconservativa dei
cromosomi durante la mitosi con l’uso della BUdR(Bromodeossiuridina) al posto della Timidina. Una delle
proprietà del DNA risultante è che non assume il colorante Giemsa in modo normale (bande chiare)
BUdR
In questo modo si possono anche vedere gli scambi tra cromatidi fratelli in mitosi
Colchicina, blocco in metafase
Watson e Crick avevano proposto la formazione di una FORCELLA REPLICATIVA
durante la replicazione del DNA
Replicazione del DNA batterico in presenza di timidinatriziata (3H Timidina)
Filamento “freddo”
Filamento“caldo”
Strutture theta
θ
La replicazione a circoli rotanti dei DNA circolari (plasmidi, virus, etc)
3’-OH libero
Replicazione a circoli rotanti
Ogni base del filamento stampo controlla l’inserimento della base complementare in corso di
sintesi
DNA polimerasiEnzima che catalizza la reazione
PPi
3’
5’
Rilascio di pirofosfato determinante affinche’ avvenga la reazione
DNA polimerasi
Reazione di polimerizzazione dal 5’ al 3’
Proprieta’ della DNA polimerasi
1)Catalizza l’allungamento 5’->3’
2)Attivita’esonucleasica 5’->3’rimuove i ribonucleotididei frammenti di Okazaki
3)Attivita’esonucleasica 3’->5’correzione di bozzerimuove le basi noncomplementari “missmatches”
Oloenzima DNA polIII di E.Coli
Le DNA polimerasi
In E.Coli si distinguono almeno 5 DNA polimerasi diverse, le fondamentali sono:
-DNA polimerasi I replica il DNA
-DNA polimerasi II ripara il DNA danneggiato
-DNA polimerasi III replica il DNA
Negli eucarioti si distinguono circa 15 DNA polimerasi, le fondamentali sono:
α, δ, simili alla pol I/III procariotiche
β riparazione del DNA
ε, γ, mitocondri e altro
Le DNA polimerasi
Le 3 attivita’ della DNA polimerasi
Attivita’polimerasica5’->3’
Attivita’esonucleasica5’->3’
Attivita’esonucleasica3’->5’
Attivita’ esonucleasica 5’->3’
Fedelta’ di replicazione-L’accuratezza della replicazione del DNA e’ fondamentale per la corretta trasmissione dell’informazione genetica
-Valutando la frequenza di basi malappaiate in una varieta’ di geni, si stima che la DNA polimerasi inserisce 1 BASE ERRATA OGNI 109-1010 nucleotidiinseriti. Questo significa che su genomi grandi come quelli eucariotici (uomo, 3x109 bp) si inserisce solo 1 errore su 109 bp. Ma solo il 25% del genoma umano ha una funzione!
Attivita’ di Proofreading o Correzione di bozze della DNA polimerasi
La DNA polimerasi e’ in grado di discriminare appaiamenti corretti da appaiamenti non
corretti
Attivita’ di correzione di bozze
L’attivita’ di Proofreading puo’ spiegare perche’l’estensione del DNA avviene in direzione 5’->3’
Replicazione del genoma procariotico
Origine di replicazione
Terminatore della replicazione
La replicazionebidirezionale nei
procarioti
Ciclo di replicazione batterico 40 min
Origini di replicazione eucarioticheCiclo di replicazione eucariotico da 1h a 200h
Origini di replicazione
nell’uomo circa 30,000distanti 50-
300 Kb
Pulse-ChaseReplicazione in presenza di [3H]Timidina e poi somministrazione di timidina non marcata
->autoradiogramma
Origini di replicazione eucariotiche
Bolle di replicazione
Innesco della sintesi di DNALa DNA polimerasi puo’ allungare la catena di DNA ma non la
puo’ iniziare-> necessita’ di un primer (innesco) o breve oligonucleotide
La Primasi catalizza la formazione di un breve frammento di RNA (30 bp) che funge da innesco per la reazione di allungamento
Comparazione procarioti/eucarioti
La polimerasi α coopera con la primasi per la sintesi dell’innesco
5’
3’
3’
5’
Replicazione continua e discontinua del DNA
La DNA ligasi salda con legami covalenti le catene di DNA
Frammenti di Okazaki
La DNA pol I grazie alla sua attivita’esonucleasica 5’->3’rimuove gli inneschi di RNA
La DNA ligasi salda tra loro i frammenti usando ATP
Passaggi nella sintesi del filamento copia di DNA
Un dimero di DNA polimerasi III puo’
sintetizzare contemporaneamente
i 2 nuovi filamenti
Elicasi
Elicasi-> enzima che rompe i legami idrogeno tra le basi usando ATP
Le proteine SSB stabilizzano il singolo filamento e bloccano la formazione del duplex
Elicasi
Topoisomerasi
Regioni di DNA superavvolte si accumulano in seguito all’azione dell’elicasi
La topoisomerasirimuove le torsioni positive a valle della forca di replicazione, introducendo dei tagli a singolo o doppio filamento sul DNA, permettendo ai 2 filamenti di ruotare liberamente uno intorno all’altro
Topoisomerasi
La replicazione ai telomeri
Segmento non polimerizzatocromosoma piu’ corto
La replicazione ai telomeri
Telomeri_ Sono formati da DNA altamente ripetuto (2000 ripetizioni di TTAGGG nell’uomo) e non codificante
Telomerasi-> trascrittasi inversa (ribonucleoproteina, TERT) che a partire dall’RNA stampo (snoRNA, TERC) catalizza la sintesi di pezzi di DNA
Replicazione ai terminali cromosomali
Telomerasi
I telomeri proteggono i terminali comosomali dall’accorciamento
In molte cellule somatiche i telomeri vengono persi ad ogni divisione cellulare e le cellule smettono di dividersi-> causa della senescenza
La telomerasi si trova generalmente in:- cellule della linea germinale- cellule embrionali- cellule staminali adulte- cellule cancerose- cellule di eucarioti unicellulari come Tetrahymena thermophila
Le cellule cancerose producono alti livelli di telomerasi
La telomerasi non si trova nelle cellule somatiche umane
Cellule di un neonato in coltura-> si dividono circa 100 volte
Cellule di un 50enne in coltura-> circa 12 divisioni
Le cellule somatiche degli individui affetti da
progeria hanno telomeri piu’ corti e mostrano una diminuzione della capacita’ proliferativa in coltura
La lunghezza dei telomeri e’ correlata con l’invecchiamento precoce
Alcuni genomi virali ad RNA
Replicazione del virus dell’HIV
Retroviral virusRetroviral virus
Fusion
ReverseTranscription
NuclearImport
INTEGRATION
NuclearExport
Transcription
Traduction
Assemblament
Denaturazione e rinaturazione di una molecola di DNA
100°C
Si rompono i legami idrogeno
Denaturazione del DNA
Rinaturazione per riassociazione delle
sequenze complementari
Ogni frammento di DNA ha una caratteristica temperatura di fusione (Tm-> melting temperature)
Tm-> temperatura alla quale meta’ delle molecole di DNA sono denaturate in singoli filamenti
Maggiore e’ il contenuto delle G C, maggiore e’ la Tm
…
Effetto ipercromico delle basi nucleotidiche, all’aumentare della separazione dei due
filamenti aumenta la OD a 260nm
Applicazioni sperimentali della complementarietà delle basi
Le cinetiche di riassociazione suggeriscono che il DNA umano e’formato da:
fast
intermediate
slow
Cinetica di rinaturazionedel genomaumano
Fast: DNA altamente ripetuto, presente in numerose copie (trasposoni inattivi, copie geniche inattive, ripetizione di sequenze semplici, sequenze ripetute in tandem, duplicazioni segmentali)
Intermediate: DNA mediamente ripetuto
Slow: DNA presente in sequenze uniche
Composizione del genoma umano
PCR (Polymerase Chain Reaction o reazione a
catena della polimerasi)
Gene a sequenza nota
La PCR permette l’amplificazione di un milione di volte o piu’ di una sequenza specifica di DNA che e’ gia’ nota o di cui sono note delle piccole sequenze all’estremita’ del gene
Oligonucleotidi o primers
Oligonucleotidi o primers
PCR (Polymerase Chain Reaction)
Reazione 2n dove n=numero di cicliSi possono ottenere informazioni sulla sequenza a partire da ridottissime quantita’ di DNA come sangue, capelli, etc
Southern/Northern Blot
Ibridazione con sonda di DNA
Ibridazioni in situ
Il sequenziamento del DNA (Sanger)
Determinazione della sequenza nucleotidicadel DNA
il metodo di il metodo di SangerSanger 22’’--33’’DIDEOSSINUCLEOTIDIDIDEOSSINUCLEOTIDI
Il contenuto di ciascuna provetta viene caricato in 4 pozzetti separati di un gel di poliacrilammide
* Indica il primer (lungo 15 nucleotidi)
** I dNTP sono ad una concentrazione 100 volte superiore di quella dei ddNTP in ciascuna provetta
SequenziamentoSequenziamento del DNA: del DNA: il metodo di il metodo di SangerSangerpozzetti
autoradiogramma
Si legge la sequenza mano mano sintetizzata dal basso verso l’ alto. Il nucleotide G è il più vicino al primer (* indica il primer (lungo 15 nucleotidi)) e l’estremità 5’ mentre il nucleotide T è all’estremità 3’. 5’GCTCCACGTAACGT3’ Questa sequenza è complementare al filamento stampo.
ddNTP marcati con fluorofori
cromatogramma
Mappe fisiche di molecole di DNA basate su taglio di enzimi di restrizione (Mappe di Restrizione)
Un Sito di restrizione o sequenza consenso viene definito come una particolare sequenza di DNAriconosciuta da un enzima di restrizione o endonucleasi come il punto in cui tagliare la molecola di DNA. Questi siti sono generalmente palindromici e con una sequenza ben precisa.
Gli enzimi di restrizione sono degli enzimi che i batteri utilizzano per difendersi dagli attacchi di un DNA estraneo
Frammenti di restrizione
La mobilita’ di ciascun fammento e’ inversamente proporzionale al logaritmo della sua lunghezza
RFLP (Restriction fragment lenght polymorfism) polimorfismo dovuto a differenze di dimensione di frammenti di restrizione allelici causati dalla presenza o assenza di un sito di restrizione
DETERMINAZIONE DI RFLP PATOGENIAnemia falciforme
Applicazione del DNA ricombinante: Diagnosi dell’anemia falciforme tramite Southern Blot
La mutazioneabolisce il sito MstII
![Dottorando: Arianna Gabrieli - air.unimi.it · si basa su un meccanismo di replicazione a circolo rotante (Rolling Circle Amplification, RCA.) [9] attraverso cui le molecole di DNA](https://static.fdocumenti.com/doc/165x107/5d49b4f188c993de768b626e/dottorando-arianna-gabrieli-airunimiit-si-basa-su-un-meccanismo-di-replicazione.jpg)
![5 Clonaggio [modalità compatibilità] - Giancarlo Accattatis · Successivamente si avrà la replicazione di questo DNA modificato (RICOMBINANTE) migliaia o milioni di volte fornendo](https://static.fdocumenti.com/doc/165x107/5c68496a09d3f226188d1aee/5-clonaggio-modalita-compatibilita-giancarlo-accattatis-successivamente.jpg)
