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DNA
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RNA
Uracile al posto
della
Timina
Sempre a SINGOLO FILAMENTO
RNA MESSAGGERO
Filamento lineare di sequenze
nucleotidiche: copia l’informazione
presente sul DNA e porta il messaggio a
livello dei ribosomi
RNA RIBOSOMALE
componente dei ribosomi: fornisce un
meccanismo per decodificare l’mRNA in
amminoacidi
70S
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Subunità 30S contiene
l’rRNA 16S
Subunità 50S contiene
l’rRNA 23S + 5S
RNA TRANSFER
lega e trasferisce un amminoacido specifico
ad una catena polipeptidica in crescita a
livello dei ribosomi
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La replicazione
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INTERVENGONO PER LA
FORMAZIONE DELLA
FORCELLA =
DENATURAZIONE
SINTETIZZANO I PRIMERS
Il codice genetico
64 possibili triplette (codoni)
Codone AA Codone AAUUU Fenilalanina ACU TreoninaUUC Fenilalanina ACC TreoninaUCU Serina ACG TreoninaUCC Serina ACA TreoninaUCG Serina GGU GlicinaUCA Serina GGC GlicinaCCU Prolina GGG GlicinaCCU Prolina GGG GlicinaCCC Prolina GGA GlicinaCCG Prolina CAU IstidinaCCA Prolina CAC Istidina
Alcuni AA sono specificati da più di un codone
DEGENERAZIONE DEL CODICE GENETICO per minimizzare gli effetti delle mutazioni
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61 codoni = di senso, specificano per i 20
amminoacidi
3 codoni= di stop, sono impiegati come
segnale di arresto della traduzione: TAA,
TAG, TGA
codone di inizio: ATG (GTG TTG), a cui
corrisponde un tRNA che trasporta una N-
formil-metionina
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gene
Sequenza nucleotidica continua,
specificata da un codone di inizio,
un certo numero di codoni interni
a cui si aggiunge il codone di stop
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Codifica per un prodotto del
fenotipo
ORF= OPEN READING FRAME
REGIONE CODIFICANTE,
MA FENOTIPO
SCONOSCIUTO
La trascrizione
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Il sito promotore
Ribosomal Binding
Site = RBS
GAGG
AAGG
GGA
GGAG
AGGA
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La traduzione
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INIZIO ATG GTG TTG CTG
STOP TAA TAG TGA
Promotore della trascrizione
GENE
OPERONE
Schema di lettura aperto: Open Reading Frame
ORF
gene proteina
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Operone ribosomale
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Regolazione
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La variabilità genetica
Il DNA può cambiare
Errori durante la
replicazione
Mutazioni
TrasposizioneTrasposizione
Mutazioni
Cambio casuale ma stabile ed
ereditabile
Letali
Negative
Positive
mutazioni da transizione= purina/purina
pirimidina/pirimidina
mutazioni da transversione= purina/pirimidina
delezione o inserzione di una base = frame
shift= Mutazioni puntiformi
L’espressione di una mutazione sarà rilevata solo se
produce un fenotipo alterato che può essere
riconosciuto
La lunghezza dei trasposoni noti è compresa tra 750
e 40000 coppie di basi e nei batteri
ne sono stati trovati di due tipi :
l’ordine dei geni può cambiare ?
TRASPOSONI
segmenti di
DNA mobili
SEMPLICI chiamati anche SEQUENZE DI
INSERIMENTO O DI INSERZIONE.INSERIMENTO O DI INSERZIONE.
Sequenze ripetute invertite= IR
TrasposasiIR IR
lunghezza media sequenze IS: 1000-1500 bp
lunghezza media IR: 10-25 bp
COMPLESSI
altri geniIR IR IR IR
sequenza IS sequenza IS
trasposone marcatori genetici
(bp)
Tn3 4957 Amp
Tn501 8200 Hg
Tn951 16500 Utilizzazione lattosio
Tn5 5700 Kc
Tn9 2500 Cm
Tn10 9300 Tet
Meccanismi di trasposizione:
Semplice o non replicativa: entrambi i filamenti del DNA originale si spostano insieme da una regione all’altra senza
replicarsi.
Replicativa: coinvolge la replicazione del DNA, una copia del trasposone rimane nel suo sito originario mentre l’altra si inserisce
in un nuovo locus.
Tn10 9300 Tet
Tn1681 2061 Enterotossina stabile al calore
Inattivazione del gene bersaglio
promotore DNA
mRNA
proteina
promotore DNA
mRNA
proteina assente o tronca
Attivazione di geni silenti
promotore
deboleDNA
gene non trascritto o scarsamente trascritto
promotore
forte
gene altamente trascritto
Endodesossiribonucleasi di restrizione = Endonucleasi = ER
Eco RI da E. coli 5’ –G-A-A-T-T-C--C-T-T-A-A-G-5’
Siti di restrizione=
Hae III da Haemophilus aegyptius 5’ –G-G-C-C-
La cellula può proteggersi dalle
variazioni?
Hae III da Haemophilus aegyptius 5’ –G-G-C-C--C-C-G-G-5’
Hpa II da Haemophilus parainfluenzae 5’ –C-C-G-G--G-G-C-C-5’
Fanno parte del sistema di MODIFICAZIONE/RESTRIZIONE presente in molte cellule batteriche
Come possiamo sfruttare in laboratorio le conoscenze sul DNA?
1° Estrazione e purificazione dalle cellule batteriche
2° Quantificazione e visualizzazione spettrofotometrica
3° Visualizzazione per via elettroforetica
Identificazione tassonomica: %GC e 4° Identificazione tassonomica: %GC e riassociazione molecolare DNA/DNA
5° Amplificazioni di porzioni specifiche del cromosoma
6° Riconoscimento a livello di specie e ceppo in funzione dello studio molecolare delle porzioni amplificate
Estrazione e purificazione dalle cellule batteriche
Raccolta e lavaggio delle cellule
Risospensione in tampone + saccarosio (6%)
Aggiunta di agente litico: lisozima (pH 7-8, 37°C per 30 min)
Aggiunta di tensioattivo: SDS al 20%
Deproteinizzazione mediante estrazione con solventi: fenolo, CHF/isoamilico
Centrifugazione e raccolta del surnatanteFase acquosa contenente il DNA
InterfaseInterfaseSolvente
Ulteriore deproteinizzazione e raccolta del surnatante
Trattamenti enzimatici con RNAsi e Proteinasi
Precipitazione del DNA con 2 vol. di EtOH
Scioglimento del DNA in tampone
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Quantificazione e visualizzazione spettrofotometrica
Il DNA ha un massimo di assorbimento a 260 nm
1 OD260nm = 50 µg/ml
Il DNA si denatura per effetto del calore = si rompono i legami Il DNA si denatura per effetto del calore = si rompono i legami H e si separano i due filamenti
Per l’EFFETTO IPERCROMICO delle basi nucleotidiche, all’aumentare della separazione dei due filamenti aumenta la OD260nm
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� una molecola carica posta all’interno di un campoelettrico migra in direzione del polo di caricaopposta
� in un gel costituito da un polimero organicomolecole di dimensioni diverse (ma di uguale carica)migrano con velocità diverse, perché le molecole didimensioni maggiori incontrano maggiore resistenzatra le maglie di un gel
Visualizzazione per via elettroforetica
È così possibile visualizzare il DNA facendolomigrare all’interno di un supporto solido (gel) ecolorandolo opportunamente
I REAGENTI DELL’ELETTROFORESI:
Tampone : crea continuità nella vaschetta
AGAROSIO: polimero che costituisce il gel
Indicatore DI CORSA: permette di visualizzare la corsa ed aumenta la densità della soluzione di DNA da inserire nelle taschine del gel
BROMURO di ETIDIO: si intercala tra le basi azotate delle molecole di DNA e lo ‘colora’
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LA STRUMENTAZIONE DELL’ELETTROFORESI:
1) ALIMENTATORE:
crea la differenza di potenziale
2) VASSOIO e VASCHETTA ELETTROFORETICA:ELETTROFORETICA:
vi si alloggia il gel, vi si instaura il campo elettrico
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POLO -
] bande di DNA
frammenti di lunghezza maggiore
frammenti di lunghezza minore
IL RISULTATO DI UNA CORSA ELETTROFORETICA
VISUALIZZAZIONE MEDIANTE TRANSILLUMINATORE A LUCE ULTRAVIOLETTA (254-312nm)
POLO +
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