DNA: riparazione e ricombinazione

Causa delle mutazioni

• Errori di replicazione

• Danni chimici. Il DNA è una molecola fragile: perdita o alterazioni di basi, rottura dello scheletro

• Inserimento di trasposoni

.

Mutazioni

• Puntiformi

• Delezioni /inserzioni

• Esposti alla mutazioni sono i microsatelliti: difficoltà a copiare sequenza ripetute, slippage

Transizioni trasversioni

Riparazione del mismatch

Mismatch repair è parte della replicazione.

In E. coli il DNA viene analizzato per distorsioni da Mut S (un dimero), lo distorce ulteriormente

Recluta MutL, che recluta MutH che taglia il filamento vicino al mismatch

Poi intervengono: elicasi, esonucleasi, DNA Pol (III) e ligasi.

Mismatch repair in E. coli

Come fa a identificare il filamento nuovo su cui operare il taglio ed escissione?

Dalla metilazione della A nella sequenza CTAG ad opera della Dam metilasi

MutS si lega al filamento non metilato

Mismatch repair in Eucarioti

• Gli eucarioti hanno omologhi di Mut(s) con più alta specificità (per mismatch, indels etc)

• Non hanno Dam Metilasi, riconoscono il filamento stampo dalle incisioni dei frammenti di Okasaki. Sono associate al sliding clamp

• Mutazioni dei geni predispongono ai tumori

Chimica delle mutazioni

Idrolisi:

• deaminazione di Citosina (anche adenosina e guanina)

• depurinazione

La chimica delle basi del DNA facilita il riconoscimento dei danni

al DNA

• La deaminazione produce basi non-naturali che possono essere riconosciute, con una eccezione: la 5-metil citosina (la sequenza CG TG

Danni al DNASono indotti da radiazioni e sostanze mutagene

• Alchilazione

• Attacco da forme reattive dell’ossigeno (OH.)

• UV: dimerizzazione delle pirimidine

• Raggi X: rompono la doppia elica

• Agenti intercalanti: inserzioni o delezioni

Analoghi ed agenti intercalanti

• 5-bromouracile nella forma enolica si lega a G

• Gli agenti intercalanti alterano lo spaziamento tra le basi e inducono inserzioni o delezioni

• Se non corretti gli errori sono trasmessi

Sitemi di riparazione umani

• Riparazione di mismatch

• Correzione diretta

• Excisione di basi (specifica)

• Excisione di nucleotidi

Riparazione del DNA• I danni causano una distorsione strutturale: cambio di

forma di una molecola.• Fotoriattivazione ripara da pyrimidine dimer che si

formano per irradiazione con ultravioletto che genera un legame covalente tra due pirimidine adiacenti nel DNA. Blocca la replicazione.

• Excision repair: un sistema di riparazione in cui uno strand è exciso direttamente e poi sostituito usando lo stand complementare come templato.

• Recombination-repair: un modo di riempire un gap in un strand usando un single strand omologo di un altro duplex

• sintesi Error-prone quando il DNA incorpora basi non-complementari nello strand figlio.

Fotoriattivazione

• La DNA fotoliasi è attivata dalla luce e rompe i legami covalenti che uniscono le pirimidine

Meccanismo di escissione delle basi

• Riconoscimento da base-flipping

Reazione dell’uracil glicosilasi

La glicosilasi di sicurezza sostituisce la A con C per riparare oxoG

Prima interviene la glicosilasi e poi endo- e eso-nucleasi

Base flipping

l’uracile e la basi alchilate sono riconosciute dalle glicosilasi e tolte direttamente dal DNA.

I dimeri delle pirimidine sono tolti rompendo i legami covalenti tra di loro.

Le metilasi aggiungono un gruppo metile alle citosine

Tutti questi tipi di enzimi agiscono girando la base fuori dalla doppia elica dove può essere eliminata o modificata e riportata nella alfa elica

Meccanismo di escissione di nucleotidi

In E. coli proteine UvrA, -B, -C e –D

• UvrA-UvrB cercano distorsioni del DNA.

• UvrB fonde il DNA e recluta UvrC che taglia il DNA 8 nt a monte e 4 nt a valle.

• L’elicasi UvrD toglie il frammento tagliato

• Poi: DNA Pol I, ligasi

• Nell’uomo le proteine coinvolte causano lo Xeroderma pigmentoso, XP A-G

Trascrizione accoppiata alla riparazione del DNA.

• Quando la RNA polimerasi trova un mismatch, si ferma.

• Recluta il sistema di riparazione per scissione nucleotidica e si distacca.

• Al sistema partecipa FTIIH che fa parte del fattore generale di trascrizione

• XPG eucariotica taglia un frammento di 24-32 nt

Danni ai sistemi di riparazione causano tumori

Sintesi translesione

La replicazione del DNA si blocca se trova una lesione. La Pol III si distacca e al suo posto entra

• La DNA pol translesione (Pol IV o Pol V). • Copia il DNA con poca fedeltà, e poi si

stacca per far posto alla Pol III. • In E. coli queste polimerasi sono indotte

dalla risposta SOS

Sintesi del DNA translesione

Risposta SOS

Danni al DNA inducono RecA a scatenare la risposta SOS: l’espressione di geni che codificano molti enzimi di riparazione

RecA attiva l’attività di auto-taglio di LexA.

LexA reprime il sistema SOS; la sua degradazione induce la sintesi dei geni.

Le rotture alla doppia elica del DNA sono riparate efficientemente

Le cellule producono gli enzimi di riparazione in risposta al danno al DNA

I danni la DNA rallentano la progressione del ciclo cellulare

Rotture di double strandNon-homologous end-joining

(NHEJ) lega terminazioni piatte. Lo si trova in meccanismi di riparazione e di ricombinazione (come la ricombinazione delle immunoglobuline).

The NHEJ pathway può ligare le estremità piatte del DNAduplex.

Mutazioni del NHEJ pathway causano malattie

Tipi di ricombinazioni • Ricombinazione tra sequenze omologhe:

(generalized o Homologous recombination) avviene prevalentemente nella meiosi. Avviene allo stadio di “four strand”.

• Ricombinazione tra paia di sequenze specifiche: site specific ricombination. Es. nell’integrazione dei fagi. Gli enzimi sono specifici per la sequenza

• Trasposizione: sequenze vengono inserite senza biosogno di omologia di sequenza

• Copy choice: usata dai virus RNA, la polimerasi passa dal templato ad un’altra sequenza

La ricombinazione omologa

La ricombinazione omologa è coinvolta:• Nel crossing over durante la meiosi• Recuperare sequenze perse per danni al

DNA• Per far ripartire forche replicative

danneggiate• Può regolare l’espressione di alcuni geni.• Produzione di animali Knock-out

Ricombinazione omologa• La ricombinazione permette di separare i vari geni

nel genoma e di separare le mutazioni favorevoli da quelle sfavorevoli

• Le ricombinazioni avvengono tra sequenze che corrispondono perfettamente, così da non perdere nessuna base dal cromosoma ricombinante

• La frequenza non è costante ma varia con effetti globali e locali.

• Avviene 2 volte più frequentemente nella femmina che nel maschio

• Dipende dalla struttura del cromosoma ed il crossing-over non avviene in vicinanza di regioni condensate delle cromatina

La ricombinazione generale

Passaggi delle ric. omologa

1. Allineamento di due molecole di DNA omologhe

2. Introduzione di rotture del DNA3. Formazione di una corta regione di

appaiamento: invasione del filamento e formazione della Holliday junction

4. Movimento della Holliday Junction - branch migration

5. Taglio della giunzione: risoluzione

Modello di HollidayI DNA si appaiano, si ha un taglio ai siti

corrispondenti, le terminazioni libere si complementano all’altro duplex: Joint molecule, e recombinant joint

Il sito di ricombinazione: DNA ibrido o heteroduplex. Esso migra e deve essere catalizzato da enzimi

La joint molecule deve essere risolta da due tagli.

Se esso è sullo stesso strand si ottiene una zona heteroduplex: patch recombinant

Se è sull’altro strand, tutti gli strand sono stati tagliati e si ha ricombinazione: splice recombinant.

In in caso si ha una regione di heteroduplex

• La complementarietà è a livello dei single strand. Essi sono accessibili dopo rottura del DNA.

• Uno strand spiazza (invade) quello corrispondente dell’altro duplex e i due duplex rimangono fisicamente uniti

Holliday junction

La giunzione può migrare in entrambe le direzioni

Risoluzione di una Holliday Junction

La risoluzione della giunzione di Holliday dà luogo a ricombinanti convenzionali o recombinant patches in base allo strand che è tagliato

Modello della Rottura del

double strand (DSB)Lo scambio genetico solitamente inizia

con un taglio del double strand (double strand brake)

Il DNA ricevente si taglia. Esonucleasi agiscono e liberano un 3’. Questo invade il DNA omologo e si estende. Si forma un D-loop.

Il D loop si estende e si annila al DNA ricevente, e viene ricopiato

Ci sono due regioni uniteIl DNA del donatore ha sostituito quello

dell’accettore

Risoluzione della riparazione del DSB

• Se i tagli avvengono simmetricamente si risolve in un patch

• Se asimmetrici nella ricombinazione

Correzione degli errori di replicazione A replication fork may stall when it encounters a damaged site or a nick in DNA.

A stalled fork may reverse by pairing between the two newly synthesized strands.

The structure of the stalled fork is the same as a Holliday junction and may be converted to a duplex and DSB by resolvases.

Meccanismi molecolari della RO• In E. coli il sistema di riparazione dei

double stand breaks (DSB) è il sistema RecBCD

• Il complesso si lega a DSB, ha attività elicasica e nucleasica e taglia entrambi i filamenti. Quando raggiunge un sito chi (Cross-over Hotspot Instigator, CHI) digerisce solo con polarità 5’-3’ producendo una coda 3’

• Il DNA senza siti viene digerito completamente

• RecA si lega al 3’- la proteina che scambia filamento

• RecA copre il 3’ in maniera cooperativa e catalizza l’appaiamento con il DNA omologo

I substrati di recA per lo scambio

Requisiti:

• DNA complementari tra i partner

• Una regione a singolo filamento

• La possibilità alla nuova elica di avvolgersi

RecA

RecA• Modello per la ricerca del filamento

omologo. Formazione della molecola giuntata

• Negli eucarioti Rad51 e Dmc1

• Polarità dell’assemblaggio di RecA

RuvA, RuvB• RuvAB riconosce la giunzione di Halliday e ne

promuove la migrazione• RuvA è un tetramero, RuvB un esamero con

attività ATPasica. • RuvC è una resolvasi che risolve il complesso

tagliando in una delle due direzioni

RuvAB si lega alla Holliday J.

• RuvA si lega specificamente alla Holliday J.

• Recluta RuvB che è un’ATPasi simile a elicasi, che muove la Halliday J.

• RuvC risolve le Holliday J.

Negli eucarioti• Nei procarioti la RO serve per

riparare le rotture del dsDNA, permettere alle forche bloccate di ripartire e ricombinare con DNA fagico o di coniugazione

• Negli eucarioti è anche necessaria per la meiosi per l’appaiamento dei cromosomi omologhi

• Ricombinazione meiotica

Ricombinazione meiotica: Spo11

• Spo11 inizia la ricombinazione meiotica producendo dei tagli del dsDNA

• Taglia in zone non associate a nucleosomi ed attive

Nella meiosi• Inizia quando una

endonucleasi taglia il doppio strand. Una esonucleasi produce i 3’ protundenti. Questi trovano la regione omologa di un secondo cromosoma per formare la sinapsi

MRX processa le estremità tagliate

• MRX è un complesso con attività esonucleasica. Degrada i filamenti con estremità 5’, attaccati as Spo11. Produce filamenti con estremità 3’.

• Dmc1 è l’omologo di RecA, specifico per la meiosi. La ricombinazione avviene tra cromosomi non-fratelli

RO negli eucarioti

• È richiesta per l’appaiamento dei cromosomi omologhi nella meiosi

• Durante la meiosi viene espresso SPO11 che introduce rotture del DNA a doppio filamento

• MRX degrada il filamento dal 5’ al 3’. • Le estremità 3’ legano Rad51 o Dmc1

(omologhi di RecA)

• L’appaiamento dei cromosomi è necessario per la ricombinazione

• Rotture di doppio strand accadono presto nella meiosi in zone calde (hot spots) per la ricombinazione, spesso promotori o zone accessibili della cromatina

• La frequenza della ricombinazioni declina in entrambi i lati in un gradiente

La conversione genetica nella meiosi

Conversione genetica per una correzione