REPLICAZIONE DEL DNA · Replicazione del DNA Si ottengono 2 doppie eliche complete identiche alle...

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COMPARTIMENTI INTRACELLULARI

SMISTAMENTO DELLE PROTEINE

Molte delle reazioni chimiche che avvengono nella cellula sono tra loro incompatibili (es. sintesi proteica e reazioni di degradazione del lisosoma). Le cellule hanno evoluto diverse strategie per organizzare e compartimentare le reazioni chimiche: 1)   Utilizzare dei Complessi Proteici (sia eucarioti che procarioti); 2 ) S e p a r a r e l e r e a z i o n i c h i m i c h e i n Compartimenti Diversi (eucarioti).

COMPARTIMENTAZIONE CELLULARE

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17 | 3 B. Alberts, D. Bray, K. Hopkin, A. Johnson, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts, P. Walter, BIOLOGIA MOLECOLARE DELLA CELLULA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2015

Quali sono gli organuli delimitati da membrana?


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BIOGENESI DEGLI ORGANULI DELIMITATI DA

MEMBRANA

SMISTAMENTO DELLE PROTEINE AGLI ORGANULI

CITOPLASMATICI

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•  Prima di dividersi, una cellula eucariotica duplica i suoi organuli. •  Gli organuli inoltre hanno bisogno di un continuo apporto di nuove proteine e lipidi in quanto essi si deteriorano con il tempo. •  Le proteine vengono sintetizzate nel citosol (tranne alcune proteine di mitocondri e cloroplasti).

ORIGINE DELLE PROTEINE DEGLI ORGANULI CITOPLASMATICI

In che modo le nuove proteine vengono importate negli

organuli?


1)   Trasporto attraverso i PORI NUCLEARI: proteine che si muovono dal citosol al nucleo

2)   T r a s p o r t o a t t r a v e r s o

TRASLOCATORI PROTEICI di membrana: proteine che si muovono dal citosol al Reticolo Endoplasmatico, mitocondri, c l o r o p l a s t i , p e r o s s i s o m i

3)   T r a s p o r t o a t t r a v e r s o

VESCICOLE: proteine che proseguono oltre il Reticolo Endoplasmatico ad altri sistemi m e m b r a n o s i

TRE SISTEMI

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Proteins can move between Compartments in Different Ways


SMISTAMENTO DELLE PROTEINE

I S E G N A L I D I S M I S T A M E N T O sono SPECIFICI e s o n o RICONOSCIUTI DA R E C E T T O R I P R O T E I C I SULL�ORGANULO B E R S A G L I O , O P P U R E D A TRASLOCATORI che aiutano l�associazione al recettore specifico. I segnali per lo stesso o r g a n u l o s o n o intercambiabili.

La localizzazione di una proteina è determinata dalla sua sequenza: nella sua struttura primaria: IL SEGNALE DI SMISTAMENTO. Le �sequenze segnale� sono lunghe 15-60 amminoacidi

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Peptide segnale/peptidasi

Zona segnale

(ripetuta 1-6 volte)

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Dentro il nucleo troviamo la cromatina, un complesso di DNA e proteine. Quando il nucleo sta per dividersi la cromatina si condensa in grandi strutture visibili al microscopio ottico, i Cromosomi

I l n u c l e o l o è implicato nella sintesi di specifici RNA che s e r v o n o d a c o s t i t u e n t i d e i r i b o s o m i ( R N A ribosomiale) ed è s e d e d i assemblaggio delle d u e s u b u n i t à ribosomiali

N U C L E O Il nucleo occupa circa il 10% del volume cellulare.

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NUCEOLO

E� la struttura più evidente nel nucleo di una cellula eucariotica osservata al microscopio ottico. E� il sito di modificazione di rRNA e assemblaggio nei ribosomi. Non è circondato da membrana. Le dimensioni del nucleolo riflettono il numero di ribosomi che la cellula sta producendo e quindi l�attività di sintesi proteica cellulare.

NUCLEOLUS

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FUNZIONE DEL NUCLEOLO

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N U C L E O

Esso é delimitato da un involucro nucleare con due membrane concentriche dotate di pori. Attraverso i pori arrivano al nucleo specifiche proteine e vengono esportati gli RNA.

Nelle cellule eucariotiche (a differenza di quelle procariotiche nelle quali i due processi avvengono contemporaneamente) il processo di trascrizione e quello di traduzione oltre che spazialmente sono temporalmente separati.

L�involucro nucleare é direttamente collegato con il Reticolo Endoplasmatico (RE) con fasci di filamenti intermedi che circondano la membrana esterna e altri all�interno che costituiscono la lamina nucleare che è sottostante la membrana nucleare interna.


Il poro nucleare è un complesso molto grande (100 proteine diverse), di circa 125 milioni di Dalton di P.M. e del diametro di 120 nm, che però a causa della presenza di 8-9 grossi granuli proteici si restringe ad un passaggio utile di circa 10 nm.

Complesso del poro nucleare:

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Si può dilatare fino a 25 nm ma non consente il passaggio di ribosomi maturi citosolici (30nm), solo delle due subunità separate!!!


Ingresso delle proteine nel nucleo: 1. IL PORO NUCLEARE

Le proteine nucleari e gli RNA che si muovono verso il citosol e viceversa attraverso I PORI NUCLEARI, grossi complessi proteici che consentono un accesso selettivo.

Le proteine riescono a passare se h a n n o u n S e g n a l e d i localizzazione nucleare. Questi segnali legano recettori di importaz ione nuc leare . I recettori e l�energia derivante dal GTP azionano l�apertura del poro.

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Il passaggio delle molecole attraverso il poro nucleare avviene (sia in entrata che in uscita dal nucleo) attraverso due meccanismi: uno di diffusione passiva (per molecole di P.M. < 20 KDa) e l�altro di trasporto attivo (per proteine e RNA). In quest�ultimo caso il poro può allargarsi fino a 25 nm ed è s e l e t t i v o p e r l e macromolecole in entrata (proteine con segnale di localizzazione nucleare) e i n u s c i t a ( s u b u n i t à ribosomiali, mRNA).

TRASPORTO ATTRAVERSO I PORI NUCLEARI


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Segnale di importo nucleare per grandi proteine, per trasporto attivo con uso di ATP. Il segnale può essere localizzato ovunque nella sequenza della proteina e si pensa formi anse o zone segnale nella struttura tridimensionale della proteina


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PECULIARITA� DEL TRASPORTO ATTRAVERSO I PORI NUCLEARI

Il meccanismo di trasporto di macromolecole attraverso i complessi del poro nucleare è fondamentalmente diverso dai meccanismi di trasporto delle proteine attraverso le membrane di altri organelli perchè avviene attraverso un grosso poro acquoso piuttosto che attraverso un trasportatore proteico. Quindi le PROTEINE possono essere TRASPORTATE attraverso il poro nucleare mentre sono IN UNA CONFORMAZIONE COMPLETAMENTE RIPIEGATA, con la struttura tridimensionale (folding) corretta!!!

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Ingresso delle proteine nel nucleo ed export di RNA attraverso il poro nucleare

SEQUENZA SEGNALE PER L�IMPORT DI PROTEINE MITOCONDRIALI

2. Ingresso delle proteine nei mitocondri (sistemi simili per cloroplasti e perossisomi)

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2. Ingresso delle proteine nei mitocondri (sistemi simili per cloroplasti e perossisomi)

Anche se i mitocondri sintetizzano alcune proteine al loro interno, la maggior parte di queste derivano dal citosol. Queste proteine con un apposito segnale all�N-terminale, sono traslocate attraverso i contact-sites. Per essere traslocate dagli opportuni complessi proteici, queste proteine devono distendersi. Proteine chaperon mitocondriali contribuiscono poi a farle ripiegare. I fosfolipidi arrivano dal RE.


RUOLO DELL�ENERGIA NELL�IMPORT DELLE PROTEINE MITOCONDRIALI

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Ingresso delle proteine nel Reticolo Endoplasmatico rugoso Il Reticolo Endoplasmatico rappresenta i l

componente principale e la fonte delle proteine di un vasto sistema di membrane intracellulari comprendente l�apparato di Golgi, i lisosomi, gli endosomi, i vacuoli.

Al Reticolo endoplasmatico arrivano anche le

proteine destinate alla membrana plasmatica o quelle destinate alla secrezione (esocitosi).

Dal Ret ico lo endoplasmat ico le prote ine

raggiungono la loro destinazione grazie alle vescicole di trasporto.


Le proteine destinate al reticolo endoplasmatico hanno una part icolare sequenza segnale per i l ret icolo endoplasmatico situata all�N-terminale. Le proteine idrofiliche vanno nel lume del reticolo endoplasmatico, quelle idrofobiche si fermano nella membrana.

Ingresso delle proteine nel Reticolo Endoplasmatico rugoso

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TRADUZIONE DELLE PROTEINE

inizia SEMPRE sui ribosomi liberi •  Le proteine destinate al citosol, nucleo, mitocondri, cloroplasti, perossisomi, sono sintetizzate sui ribosomi liberi.

•  Le proteine destinate alla secrezione, reticolo endoplasmatico, Golgi, lisosomi, membrana plasmatica sono sintetizzate sui ribosomi associati al reticolo endoplasmatico rugoso (RER)


L�inserimento delle proteine nel Reticolo Endoplasmatico (RE) è COTRADUZIONALE ed avviene grazie a ribosomi che si fissano al reticolo endoplasmatico formando il reticolo endoplasmatico rugoso. I ribosomi che rilasciano le proteine nel citosol sono invece detti ribosomi liberi. I due tipi di ribosomi sono strutturalmente e funzionalmente identici.

Ingresso delle proteine nel reticolo endoplasmatico

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La sequenza segnale della proteina nascente è riconosciuta da una proteina detta SRP (signal-recognition particle) che si lega successivamente a un recettore per SRP situato sul reticolo endoplasmatico. La sintesi proteica si interrompe finché la proteina non si lega al canale di traslocazione del reticolo endoplasmatico e la SRP si dissocia.



La sequenza segnale apre il canale di traslocazione e vi rimane legata finché tutta la proteina è stata sintetizzata ed inserita nel RE. Terminata la sintesi la sequenza segnale è tagliata da una peptidasi del segnale e la nuova proteina viene rilasciata nel lume del RE.


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Il sistema varia per le proteine transmembrana. Alcune di queste proteine contengono una sequenza di arresto del trasferimento. Questa sequenza idrofobica blocca la proteina all�interno della membrana.

Inserimento delle proteine nella membrana del reticolo endoplasmatico


Le proteine transmembrana multipasso contengono varie sequenze di inizio e di arresto del trasferimento che non vengono mai tagliate. Si ha un�alternanza di inizio e fine ella traslocazione.

Inserimento delle proteine nella membrana del reticolo endoplasmatico

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RIPIEGAMENTO E MODIFICAZIONI DELLE PROTEINE NEL RETICOLO

ENDOPLASMATICO RUGOSO

ü  modificazioni durante la loro traslocazione attraverso la membrana o nel lume del RE (es. Rimozione della sequenza segnale).

Proteina DISOLFURO ISOMERASI: facilita la formazione di ponti disolfuro tra le catene laterali di residui di cisteina (anche azione dell’ambiente ossidante del lume)

Proteine CHAPERONE: aiutano la proteina neosintetizzata a raggiungere un corretto ripiegamento e riconoscono proteine ripiegate in maniera scorretta


La principale modificazione chimica che avviene nel RE consiste nella glicosilazione (legame covalente a catene oligosaccaridiche) di quasi tutte le proteine. Le proteine della membrana plasmatica cellulare che fanno parte del glicocalice sono tutte sintetizzate nel reticolo endoplasmatico.

Modificazioni covalenti delle proteine nel reticolo endoplasmatico

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Quasi tutte le proteine che passano dal reticolo endoplasmatico non vi restano ma proseguono verso l�apparato di Golgi. Solo le proteine ben conformate possono lasciare il reticolo endoplasmatico. Proteine chaperon trattengono le proteine mal ripiegate finché non si ripiegano o eventualmente le degradano.

�Controllo di qualità� nel reticolo endoplasmatico


Struttura dell�apparato di Golgi - Le modificazioni prevedono rimaneggiamenti delle catene oligosaccaridiche. Lo smistamento avviene verso i lisosomi (segnale presente in uno zucchero), o verso la membrana plasmatica.

Apparato di Golgi: ulteriori modificazioni e smistamento

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Generalmente il RE rappresenta solo la prima tappa nel trasporto di una proteina. Questa in genere va poi verso l�apparato di Golgi e subisce varie trasformazioni (es. glicosilazione). I movimenti da un compartimento all�altro avvengono grazie a VESCICOLE DI TRASPORTO.

Importante è la SPECIFICITÀ dei materiali da trasportare e delle DESTINAZIONI FINALI del le vescicole.

3. Trasporto vescicolare


TRASPORTO VESCICOLARE Connette compartimenti cellulari interni con lo spazio extracellulare

Nella direzione opposta opera una via endocitica. Naturalmente ci possono essere deviazioni da queste vie (es. biogenesi dei lisosomi).

N e l t r a f f i c o v e s c i c o l a r e p o s s i a m o distinguere una via secretoria, che partendo d a l r e t i c o l o endoplasmatico, passando per il G o l g i , a r r i v a f i n o a l l a m e m b r a n a plasmatica.

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Vescicole rivestite di clatrina

Questa vescicole gemmano dall�apparato di Golgi se devono essere secrete all�esterno della cellula (esocitosi); gemmano dalla membrana plasmatica se sono dirette all�interno della cellula (endocitosi).


CLATRINA

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Figure 13-4 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

DIVERSI TIPI DI PROTEINE DI RIVESTIMENTO DELLE VESCICOLE

DIVERSI TIPI DI PROTEINE DI RIVESTIMENTO DELLE VESCICOLE

Coinvolgimento dei tre tipi noti di proteine di rivestimento COP I, COP II e clatrina nel traffico vescicolare lungo le vie secretoria ed endocitotica.

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La specificità nella destinazione finale delle vescicole è conferita da proteine presenti sulla membrana della vescicola (v-SNARE) che si legano ad analoghe molecole presenti sulla membrana dove la vescicola è diretta (t-SNARE).

Il trasporto vescicolare: PROTEINE SNARE

In seguito a questa interazione si ha la fusione delle membrane ed il rilascio del contenuto della vescicola.

Ci sono almeno 20 SNARE diverse nelle cellule animali, ciascuna con specificità di trasporto diverso. t-SNARE e v-SNARE hanno domini ad α-elica che si avvolgono, durante l�interazione, per bloccare le membrane.

PROTEINE SNARE

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Nella cellula è sempre attivo un traffico vescicolare che trasporta lipidi e proteine verso la membrana plasmatica (via secretoria - esocitosi). Questa via parte dal reticolo endoplasmatico e passa attraverso l�apparato di Golgi. Il movimento avviene attraverso vescicole di trasporto. Durante questo tragitto le proteine subiscono delle modificazioni chimiche.

Le vie secretorie

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La secrezione avviene per esocitosi. Si può avere una secrezione costitutiva (rifornisce la membrana plasmatica di nuovi lipidi e proteine) o una secrezione regolata presente solo in cellule specializzate (es. cellule beta del pancreas, neuroni).

SECREZIONE COSTITUTIVA E REGOLATA


La formazione delle vescicole per la secrezione regolata avviene nell’apparato del Golgi trans. Qui avviene una aggregazione selettiva della proteina da secernere. Tutte le secrezioni aumentano la superficie di membrana. Questa tuttavia si riduce in seguito a concomitanti eventi di endocitosi.

Secrezione regolata

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Le vie secretorie


SECREZIONE COSTITUTIVA:

BIOGENESI DELLA MEMBRANA PLASMATICA

v La secrezione costitutiva rifornisce la membrana plasmatica di nuovi lipidi e proteine attraverso il trasporto vescicolare.

v Le proteine di membrana, il colesterolo, i fosfolipidi

sono contenuti nelle vescicole di secrezione costitutiva che prendono origine dal Reticolo Endoplasmatico.

v Le proteine di membrana, il colesterolo, i fosfolipidi

sono sintetizzati a livello del Reticolo Endoplasmatico Rugoso/liscio.

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BIOGENESI DELLA MEMBRANA PLASMATICA


Endocitosi

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Destino dei recettori di membrana


LISOSOMA

Digeriscono anche materiale intracellulare intrappolato negli autofagosomi

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AUTOPHAGY The term autophagy

(from the Greek words auto meaning ‘self ’ and phagein meaning ‘to eat’) refers to a collection of diverse processes that enable cells to digest

their cytoplasmic contents in lysosomes. Autophagy depends on specialized Autophagy-related Proteins (ATGs)

V. Deretic et al. | OCTOBER 2013 | VOLUME 13 , 722-737 Nature Review

AUTOFAGIA

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Yoshinori Ohsumi - Autophagy - an Intracellular Recycling System Yoshinori Ohsumi Tokyo Institute of Technology, Tokyo, Japan

http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/2016/ohsumi-lecture.html

http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/2016/ohsumi-lecture.html

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•  Autophagy is a highly conserved catabolic process induced under various conditions of cellular stress, which prevents cell damage and promotes survival in the event of energy or nutrient shortage and responds to various cytotoxic insults. (Mechanism and medical implications of mammalian autophagy - Nature Reviews Molecular Cell

Biology (2018)

•  Autophagy has primarily cytoprotective functions and needs to be tightly regulated to respond correctly to the different stimuli that cells experience, thereby conferring adaptation to the ever-changing environment.

•  Autophagy is an intracellular degradation system that delivers cytoplasmic constituents to the lysosome. ( Autophagy: process and function - Noboru Mizushima Genes Dev. November 15, 2007)

•  Autophagy is a general term for the degradation of cytoplasmic components within lysosomes (Cuervo 2004; Levine and Klionsky 2004; Shintani and Klionsky 2004; Klionsky 2005, 2007; Mizushima and Klionsky 2007).

•  AUTOPHAGY is a highly dynamic, multi-step process

AUTOPHAGY

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AUTOPHAGY AND DISEASES

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Snap25

SNARE NEL RILASCIO DI VESCICOLE SINAPTICHE

Le SNARE meglio caratterizzate sono quelle delle cellule nervose, dove mediano la fusione di vescicole sinaptiche alla membrane plasmatica, a livello delle terminazioni nervose.

FORMAZIONE DI VESCICOLE SINAPTICHE

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I complessi SNARE ALLE TERMINAZIONI NERVOSE sono i BERSAGLI DI POTENTI NEUROTOSSINE che sono secrete da batteri e che causano il tetano e il botulismo

I batteri gram-positivi Clostridium botulinum (bacilli) contaminano gli alimenti producendo un’esotossina molto potente. La TOSSINA BOTULINICA è una proteina neurotossica e rappresenta uno dei più potenti veleni naturali esistenti al mondo. E� costituita da una catena pesante e una catena leggera che interagiscono mediante ponti disolfuro

La catena leggera è un enzima proteasi che attacca una delle proteine (la SNAP-25, la sintaxina o la sinaptobrevina) della giunzione neuromuscolare, impedendo il rilascio di acetilcolina dalle vescicole. Inibendo il rilascio di questo neurotrasmettitore, la tossina interferisce con l'impulso nervoso e causa paralisi dei muscoli, caratteristica del botulismo.

CELLULE TARGET: NEURONI COLINERGICI (che rilasciano acetilcolina) presinaptici a livello delle giunzioni neuromuscolari. Esistono sette tipi di tossina botulinica, descritti dalle lettere dell'alfabeto dalla A alla G (BoNT/A,B…G)

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