1 DNA struttura e replicazione Cromosomi. 2 Nei primi decenni del 900 si raccolgono evidenze che i...

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1 DNA struttura e DNA struttura e replicazione replicazione Cromosomi Cromosomi

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DNA struttura e replicazioneDNA struttura e replicazioneCromosomiCromosomi

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Nei primi decenni del ‘900 si raccolgono evidenze che i Nei primi decenni del ‘900 si raccolgono evidenze che i

cromosomi sono costituiti da DNA e proteine.cromosomi sono costituiti da DNA e proteine.

- Qual è la molecola responsabile dell’informazione - Qual è la molecola responsabile dell’informazione

biologica? biologica?

- Qual è la sua struttura? - Qual è la sua struttura?

Esperimenti di importanza fondamentale (Griffith, Esperimenti di importanza fondamentale (Griffith,

Avery et al., Hershey et al.) vengono effettuati negli Avery et al., Hershey et al.) vengono effettuati negli

anni ’30-50 su organismi semplici, quali batteri e anni ’30-50 su organismi semplici, quali batteri e

batteriofagi e dimostrano che il materiale genetico è il batteriofagi e dimostrano che il materiale genetico è il

DNADNA

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1950 E. Chargaff scopre che nel DNA di specie diverse1950 E. Chargaff scopre che nel DNA di specie diverse c’è proporzionalità nella composizione in basi azotate:c’è proporzionalità nella composizione in basi azotate:

organismoorganismo A%A% T%T% G%G% C%C%

PneumococcoPneumococco 29.829.8 31.631.6 20.520.5 18.018.0

lievitolievito 31.331.3 32.932.9 18.718.7 17.117.1

Riccio di Riccio di maremare

32.832.8 32.132.1 17.717.7 18.418.4

E.coliE.coli 2626 24.924.9 24.824.8 25.225.2

uomouomo 30.930.9 29.429.4 19.919.9 19.819.8

rattoratto 28.628.6 28.428.4 21.421.4 21.521.5

La quantità totale delle purine (A+G) è uguale a quella delle pirimidine (T+C)La quantità totale delle purine (A+G) è uguale a quella delle pirimidine (T+C)

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Cristallografia a raggi X (1952 R. Franklin)Cristallografia a raggi X (1952 R. Franklin)

L’ immagine di diffrazione ottenuta è compatibile con una struttura elicoidaleL’ immagine di diffrazione ottenuta è compatibile con una struttura elicoidale

R. FranklinM. Wilkins

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Nel 1953 James Watson e Francis Crick, basandosi sulle Nel 1953 James Watson e Francis Crick, basandosi sulle

osservazioni di cristallografia ai raggi X di Rosalind osservazioni di cristallografia ai raggi X di Rosalind

Franklin e sull’osservazione di Erwin Chargaff, propongono Franklin e sull’osservazione di Erwin Chargaff, propongono

il modello a doppia elica per la molecola di DNAil modello a doppia elica per la molecola di DNA

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Il DNA è un polimero di nucleotidiIl DNA è un polimero di nucleotidiNucleotide: molecola formata da uno zucchero pentoso (desossiribosio),Nucleotide: molecola formata da uno zucchero pentoso (desossiribosio),un gruppo fosfato e una base azotata (A, C, G, T)un gruppo fosfato e una base azotata (A, C, G, T)

A

G

T

C

5’

3’

5’

3’

1’

2’

4’

purine pirimidinepurine pirimidine

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Il DNA ha una struttura ad elica (in accordo coi dati di cristallografia) a doppio Il DNA ha una struttura ad elica (in accordo coi dati di cristallografia) a doppio

filamentofilamento

Gli scheletri zucchero-fosfato sono posizionati esternamente, mentre le basi sono Gli scheletri zucchero-fosfato sono posizionati esternamente, mentre le basi sono

dirette verso l’interno e si appaiano (tramite legami dirette verso l’interno e si appaiano (tramite legami

idrogeno) alle basi “complementari” del filamento idrogeno) alle basi “complementari” del filamento

opposto in accordo con quanto osservato da opposto in accordo con quanto osservato da

Chargaff (in tutti i DNA % A = % T; % C = % G). Chargaff (in tutti i DNA % A = % T; % C = % G).

L’appaiamento è sempre purina-pirimidinaL’appaiamento è sempre purina-pirimidina

e questo mantiene il diametro dell’elica uniformee questo mantiene il diametro dell’elica uniforme

I due filamenti sono antiparalleliI due filamenti sono antiparalleli

Modello a doppia elica del DNAModello a doppia elica del DNA

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Il diametro si mantiene costante perché le purine si appaiano alle Il diametro si mantiene costante perché le purine si appaiano alle pirimidinepirimidine

2nm

G ≡ C: 3 legami H

A = T: 2 legami H

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Il modelloIl modello

prefigurava genialmente una modalità diprefigurava genialmente una modalità di

replicazione semiconservativa che verràreplicazione semiconservativa che verrà

poi sperimentalmente dimostrata da poi sperimentalmente dimostrata da

Meselson e Stahl nel 1958Meselson e Stahl nel 1958

Ogni filamento dell’elica funziona Ogni filamento dell’elica funziona

da stampo per la sintesi di un nuovo filamento, sfruttando la da stampo per la sintesi di un nuovo filamento, sfruttando la

complementarietà delle basi complementarietà delle basi

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1010

Modelli di replicazione del DNAModelli di replicazione del DNA

Alla fine del processo di sintesi potremmo ottenere:

due molecole di DNA ciascuna costituita a un filamento di nuova sintesi e da un filamento originario (semiconservativa)

una molecola di DNA costituita da due filamenti parentali e l’altra da due filamenti di nuova sintesi (conservativa)

due molecole di DNA costituite entrambe da un’alternanza di filamenti nuovi e parentali (dispersiva)

Filamento parentaleFilamento nuovo

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1111

La replicazione del DNA è semiconservativa:La replicazione del DNA è semiconservativa:

ciascuno dei due filamenti parentali serve da stampociascuno dei due filamenti parentali serve da stampo

per la sintesi di un nuovo filamento e le due nuove doppie per la sintesi di un nuovo filamento e le due nuove doppie

eliche sono costituite da ognuna da un filamento vecchio eliche sono costituite da ognuna da un filamento vecchio

e da un filamento nuovoe da un filamento nuovo

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DNADNA polimerasipolimerasi

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1313

nucleotide (nucleoside trifosfato): nucleotide (nucleoside trifosfato):

elemento costitutivo (monomero) degli acidi nucleicielemento costitutivo (monomero) degli acidi nucleici

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1414

La DNA polimerasi allunga il filamento nascente aggiungendo un

nucleoside trifosfato (nucleotide) all’estremità 3’OH

5’

3’

5’

3’

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1515

La DNA polimerasi allunga il filamento nascente aggiungendo un

nucleoside trifosfato all’estremità 3’OH

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Entrambi i filamenti servono da stampo per la sintesi di nuovi

filamenti, quindi la sintesi procede sui due filamenti stampo in

direzione opposta 5’ 3’

3’5’5’

5’

3’

3’Direzione di sintesi

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Replicazione del DNA 1Replicazione del DNA 1 In corrispondenza delle origini di replicazione l’elicasi svolge i In corrispondenza delle origini di replicazione l’elicasi svolge i

filamenti parentali della doppia elica rompendo i legami H tra le basi filamenti parentali della doppia elica rompendo i legami H tra le basi e generando due filamenti singolie generando due filamenti singoli

Le ssbp (single strand binding proteins) legano il singolo filamento e Le ssbp (single strand binding proteins) legano il singolo filamento e lo stabilizzanolo stabilizzano

helicase

Denaturazione del DNA

Origin of replication

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Replicazione del DNA 2Replicazione del DNA 2 La primasi (RNA polimerasi-DNA dipendente) sintetizza un breve La primasi (RNA polimerasi-DNA dipendente) sintetizza un breve

innesco (primer) a RNA (le DNA pol non sono in grado di iniziare innesco (primer) a RNA (le DNA pol non sono in grado di iniziare ex novo la sintesi, ma solo di allungare un 3’ preesistente)ex novo la sintesi, ma solo di allungare un 3’ preesistente)

La DNA polimerasi III estende l’innesco a RNA sintetizzando DNALa DNA polimerasi III estende l’innesco a RNA sintetizzando DNA

helicase

innesco

3’

helicase

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2020

La DNA polimerasi procede, sul filamento leading, nella stessa La DNA polimerasi procede, sul filamento leading, nella stessa direzione di avanzamento della elicasi e quindi in maniera continua …direzione di avanzamento della elicasi e quindi in maniera continua …Ma cosa succede sul filamento complementare?Ma cosa succede sul filamento complementare?

helicase

Leading strand

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2121

primase

3’5’ helicase

Il filamento ritardato (lagging strand) viene sintetizzato in maniera Il filamento ritardato (lagging strand) viene sintetizzato in maniera discontinua, attraverso la sintesi di una serie di frammenti (fr. di discontinua, attraverso la sintesi di una serie di frammenti (fr. di Okazaki)Okazaki)

5’

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2222

Replicazione del DNA 3Replicazione del DNA 3 Rimozione del primer a RNA e “gap filling” da parte della Rimozione del primer a RNA e “gap filling” da parte della

DNA pol IDNA pol I Saldatura dei frammenti (ligasi)Saldatura dei frammenti (ligasi)

5’ helicase

ligase

helicase5’

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2323

La direzione di sintesi della DNA pol. è sempre 5’3’ uno dei due nuovi filamenti è sintetizzato in maniera discontinua, i frammenti vengono poi saldati

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La DNA polimerasi III è costituita da 10 diversi polipeptidi. La DNA polimerasi III è costituita da 10 diversi polipeptidi. Complessivamente l’enzima ha una struttura dimerica, che contiene Complessivamente l’enzima ha una struttura dimerica, che contiene due copie di ciascuna subunità e due siti cataliticidue copie di ciascuna subunità e due siti catalitici

La DNA polimerasi III agisce come un dimero a livello della forca La DNA polimerasi III agisce come un dimero a livello della forca replicativareplicativa

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topoisomerasitopoisomerasi

LeLe Topoisomerasi Topoisomerasi hanno il compito di hanno il compito di rilassarerilassare (eliminare) le tensioni (eliminare) le tensioni che si creano nella doppia elica del DNA in seguito ai processi cellulari che si creano nella doppia elica del DNA in seguito ai processi cellulari che implichino un cambiamento di topologia del DNA (trascrizione, che implichino un cambiamento di topologia del DNA (trascrizione, replicazione del DNA) replicazione del DNA)

La separazione dei filamenti di una struttura elicoidale genera dei La separazione dei filamenti di una struttura elicoidale genera dei superavvolgimentisuperavvolgimenti

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Replicazione del DNA circolareReplicazione del DNA circolare

Direzione di replicazione bidirezionale a partire da ORI

ORI è sequenza ricca in A-TNei procarioti l’origine di replicazione è singola

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3030

Le lunghe molecole di DNA lineare dei cromosomi eucarioti hanno Le lunghe molecole di DNA lineare dei cromosomi eucarioti hanno origini di replicazioni multipleorigini di replicazioni multiple

Direzione di replicazione bidirezionale a partire da ORImultiple

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Le lunghe molecole di DNA lineare dei cromosomi eucarioti hanno Le lunghe molecole di DNA lineare dei cromosomi eucarioti hanno origini di replicazioni multipleorigini di replicazioni multiple

Le DNA polimerasi eucariotiche hanno una velocità di incorporazioneLe DNA polimerasi eucariotiche hanno una velocità di incorporazionedi 75 nucleotidi al secondodi 75 nucleotidi al secondo

La lunghezza media di un cromosoma umano è 1.4 x 10La lunghezza media di un cromosoma umano è 1.4 x 108 8 bpbp(3.2 x 10(3.2 x 1099 bp genoma aploide/ 23 cromosomi) bp genoma aploide/ 23 cromosomi)

Se ci fosse una singola ORI, per duplicare un singolo cromosomaSe ci fosse una singola ORI, per duplicare un singolo cromosomamedio occorrerebbero più di 10 giornimedio occorrerebbero più di 10 giorni

In realtà la fase S dura circa 8 oreIn realtà la fase S dura circa 8 ore

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Il cromosoma batterico ha un’unica ORIIl cromosoma batterico ha un’unica ORI

Il genoma di E. coli è lungo 4.6x10 Il genoma di E. coli è lungo 4.6x10 66 bp bp

La velocità dellla Pol III arriva fino a 1000 nt/ secLa velocità dellla Pol III arriva fino a 1000 nt/ sec

Per replicare il cromosoma occorrono:Per replicare il cromosoma occorrono:

4.6x10 4.6x10 66 bp bp = 70 min c.a = 70 min c.a1000nt/sec1000nt/sec

su ogni lato della forca replicativasu ogni lato della forca replicativa

quindi 35 min c.aquindi 35 min c.a

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3333

Alla DNA polimerasi è associata un’attività esonucleasica che Alla DNA polimerasi è associata un’attività esonucleasica che

consente la “correzione di bozze”= rimozione di nucleotidi erraticonsente la “correzione di bozze”= rimozione di nucleotidi errati

(tasso di errore durante la sintesi (tasso di errore durante la sintesi 11xx1010-4-4 nt; dopo correzione nt; dopo correzione 1x101x10-10 -10 nt).nt).

Con questo sistema vengono corretti gli errori di appaiamento commessiCon questo sistema vengono corretti gli errori di appaiamento commessi

dalla DNA pol mentre la replicazione è in corsodalla DNA pol mentre la replicazione è in corso

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Nel genoma umano (aploide) ci sono c.a. 3 x10Nel genoma umano (aploide) ci sono c.a. 3 x1099 nt nt

di questi solo 6 x 10di questi solo 6 x 107 7 nt (il 2%) sono sequenze codificanti (esoniche)nt (il 2%) sono sequenze codificanti (esoniche)

Se non ci fosse correzione di bozzeSe non ci fosse correzione di bozze (tasso di errore durante la sintesi (tasso di errore durante la sintesi 1x101x10--4 nt):4 nt):6000 mutazioni cadrebbero in sequenze codificanti a ogni 6000 mutazioni cadrebbero in sequenze codificanti a ogni replicazione del DNAreplicazione del DNA

Dopo correzione di bozzeDopo correzione di bozze ( (1x101x10-10-10 nt ): nt ):0.006 mutazioni cadono in sequenze codificanti a ogni replicazione 0.006 mutazioni cadono in sequenze codificanti a ogni replicazione del DNA (1 mutazione ogni 166 replicazioni)del DNA (1 mutazione ogni 166 replicazioni)

Sono comunque maggiori di quelle osservate in una cellula, perché Sono comunque maggiori di quelle osservate in una cellula, perché intervengono dei processi di riparazione del DNAintervengono dei processi di riparazione del DNA

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RIPARAZIONE DEI DISAPPAIAMENTI (mismatch repair)RIPARAZIONE DEI DISAPPAIAMENTI (mismatch repair)

provvede ad effettuare una scansione del DNA provvede ad effettuare una scansione del DNA dopo la dopo la replicazione replicazione alla ricerca di appaiamenti erratialla ricerca di appaiamenti errati

Il sistema di riparazione èIl sistema di riparazione èin grado di riconoscere ein grado di riconoscere eriparare il filamento di riparare il filamento di nuova sintesinuova sintesi

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Un errore non corretto viene poi perpetuato nei cicli di replicazioneUn errore non corretto viene poi perpetuato nei cicli di replicazionesuccessivisuccessivi

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Difetti nel “mismatch repair”Difetti nel “mismatch repair”

Mutazioni nei geni che codificano per gli enzimi coinvolti Mutazioni nei geni che codificano per gli enzimi coinvolti

nel mismatch repair sono associate al cancro.nel mismatch repair sono associate al cancro.

La cellula non riesce a riparare le mutazioni che si La cellula non riesce a riparare le mutazioni che si

accumulano in tutto il genoma e che, quando colpiscono accumulano in tutto il genoma e che, quando colpiscono

geni che regolano la proliferazione cellulare, inducono la geni che regolano la proliferazione cellulare, inducono la

trasformazione cancerosa (es: cancro del colon non trasformazione cancerosa (es: cancro del colon non

poliposico ereditario HNPCC, autosomica dominante)poliposico ereditario HNPCC, autosomica dominante)

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CromosomiCromosomi

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3939

CromatinaCromatina

All’interno del nucleo della cellula eucariotica si trova la cromatina (DNA genomico + proteine)

La cromatina appare organizzata in entità separate (cromosomi) quando la cellula è in mitosi

interfase tarda profase inizio anafase

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4040

centromero

= telomeri

Ciascun cromosoma prima della mitosi è costituito da due cromatidi fratelli, tenuti insieme dal centromero

braccio p

braccio q

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4141

TelomeriTelomeri Sequenze ripetute all’estremità dei Sequenze ripetute all’estremità dei

cromosomi cromosomi costituiti da alcune migliaia di costituiti da alcune migliaia di

ripetizioni di sequenze brevi ripetizioni di sequenze brevi nell’uomo: (TTAGGG)nnell’uomo: (TTAGGG)n Proteggono il cromosoma dalla Proteggono il cromosoma dalla

degradazione ad opera di nucleasi degradazione ad opera di nucleasi ed impediscono che le estremità dei ed impediscono che le estremità dei cromosomi si saldino tra di lorocromosomi si saldino tra di loro

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4242

TelomeriTelomeri Nelle cellule germinali e nelle cellule Nelle cellule germinali e nelle cellule

staminali la lunghezza dei telomeri staminali la lunghezza dei telomeri rimane costante ad ogni divisione rimane costante ad ogni divisione cellulare grazie all’attività della cellulare grazie all’attività della telomerasi telomerasi

Nelle cellule somatiche differenziate ad Nelle cellule somatiche differenziate ad ogni replicazione del DNA il telomero ogni replicazione del DNA il telomero subisce un accorciamentosubisce un accorciamento

La riduzione dei telomeri dopo n La riduzione dei telomeri dopo n divisioni provoca arresto della crescita divisioni provoca arresto della crescita cellulare e apoptosicellulare e apoptosi

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4343

Replicazione dell’estremità del Replicazione dell’estremità del cromosomacromosoma

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4444

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4545

CentromeroCentromero

È la regione del cromosoma in cui i È la regione del cromosoma in cui i

cromatidi fratelli sono uniticromatidi fratelli sono uniti

Sequenza ripetute, eterocromatinaSequenza ripetute, eterocromatina

In corrispondenza del centromero In corrispondenza del centromero

ci sono due cinetocori (uno per ci sono due cinetocori (uno per

cromatidio) che servono ad cromatidio) che servono ad

agganciare il cromosoma alle fibre agganciare il cromosoma alle fibre

del fusodel fuso

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4646

Lunghezza del DNA genomico Lunghezza del DNA genomico

Distanza tra due coppie di basi Distanza tra due coppie di basi 0.34nm0.34nm

3x103x1099 bp (numero di basi di un bp (numero di basi di un genoma aploide umano) x 0.34nm genoma aploide umano) x 0.34nm (distanza tra due coppie di basi) = (distanza tra due coppie di basi) = 1 metro1 metro (lunghezza di un genoma (lunghezza di un genoma umano aploide)umano aploide)

Deve essere compattato in un Deve essere compattato in un nucleo di pochi nucleo di pochi

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4747

NucleosomaNucleosoma L’unità fondamentale della cromatina è il nucleosoma: L’unità fondamentale della cromatina è il nucleosoma:

tratto di DNA (146bp) avvolto con c.a. due giri attorno a tratto di DNA (146bp) avvolto con c.a. due giri attorno a

un un corecore formato da un ottamero istonico formato da un ottamero istonico

Istoni: proteine cariche positivamente (arg, lys) che Istoni: proteine cariche positivamente (arg, lys) che

interagiscono coi gruppi fosfato del DNAinteragiscono coi gruppi fosfato del DNA

11 nm

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4848

(1.65 giri,146 pb)

Ottamero istoni: 2 molecole di H2A, H2B, H3 e H4Ottamero istoni: 2 molecole di H2A, H2B, H3 e H4

H3

H3

H4

H2A

H2B

H2A

H4

11 nm

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4949

Istone H1 e fibra da 30nmIstone H1 e fibra da 30nm

L’istone H1 (di giunzione) ha la funzione di compattare L’istone H1 (di giunzione) ha la funzione di compattare

ulteriormente i nucleosomiulteriormente i nucleosomi

Promuove la formazione della fibra solenoide da 30nmPromuove la formazione della fibra solenoide da 30nm

H1H1

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5050

Il cromosoma metafasico

presenta un alto grado di

compattazione della

cromatina

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5353

Eucromatina-eterocromatinaEucromatina-eterocromatina

Eterocromatina è più compatta Eterocromatina è più compatta e trascrizionalmente inattivae trascrizionalmente inattiva

Eucromatina interfasica trascrizionalmente attiva; si trova allo stato di Eucromatina interfasica trascrizionalmente attiva; si trova allo stato di cromatina distesa ed è accessibile agli enzimi della trascrizionecromatina distesa ed è accessibile agli enzimi della trascrizione

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5454

aa eucromatina: eucromatina:

frazione nucleare frazione nucleare trascrizionalmente trascrizionalmente attiva e a bassa densitàattiva e a bassa densità

sezione al microscopio elettronicosezione al microscopio elettronico

a

bbb eterocromatina: eterocromatina:

frazione frazione

trascrizionalmentetrascrizionalmente

inattiva ed inattiva ed elettrondensa elettrondensa

Eucromatina-eterocromatinaEucromatina-eterocromatina

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5555

Nelle femmine di mammifero uno dei due cromosomi X è Nelle femmine di mammifero uno dei due cromosomi X è inattivatoinattivatoIl cromosoma X inattivo è visibile nel nucleo interfasico di cellule Il cromosoma X inattivo è visibile nel nucleo interfasico di cellule ♀♀ come una masserella di cromatina condensata, addossata alla come una masserella di cromatina condensata, addossata alla membrana nuclearemembrana nucleare

Viene chiamata cromatina sessuale o Viene chiamata cromatina sessuale o corpo di Barrcorpo di Barr

Nuclei di cellule della mucosa orale Nuclei di cellule della mucosa orale di ♀di ♀ (sinistra) e (sinistra) e ♂♂ (destra) (destra)

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5656

CariotipoCariotipo

Il cariotipo di una cellula eucariota è dato dal numero e Il cariotipo di una cellula eucariota è dato dal numero e

dalla morfologia (posizione del centromero e dalla morfologia (posizione del centromero e

dimensioni) dei suoi cromosomi dimensioni) dei suoi cromosomi metafasicimetafasici

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5757

Il cariotipo umanoIl cariotipo umano

Nel 1955 Tjio e Levan (analizzando centinaia di metafasi in 5 tessuti Nel 1955 Tjio e Levan (analizzando centinaia di metafasi in 5 tessuti provenienti da 7 individui) dimostrano che il numero esatto di provenienti da 7 individui) dimostrano che il numero esatto di cromosomi umani è 46cromosomi umani è 46

Metafase dal primo rotolo fotografico in cui è stato identificato il numero esatto dei cromosomi umani (Tj io e Levan - 22 dicembre 1955)

Grazie alla cortesia del Prof . Marco Fraccaro

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5858

Cromosomi umaniCromosomi umani #1→ 22 sono uguali nel maschio e nella #1→ 22 sono uguali nel maschio e nella

femmina (autosomi)femmina (autosomi)

La 23La 23esimaesima coppia è quella dei cromosomi sessuali: coppia è quella dei cromosomi sessuali:

XXXX nella femmina nella femmina

(sesso omogametico)(sesso omogametico)

XYXY nel maschio nel maschio

(sesso eterogametico)(sesso eterogametico)

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Denaturazione e rinaturazione del DNADenaturazione e rinaturazione del DNA

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6060

Rinaturazione in presenza di una sondaRinaturazione in presenza di una sonda

La sonda è una sequenza di DNA complementare a una determinata sequenza La sonda è una sequenza di DNA complementare a una determinata sequenza di interesse, che viene marcata con radioattivo o con fluorocromidi interesse, che viene marcata con radioattivo o con fluorocromi

sonda

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6161

Ibridazione del cromosoma con sonde fluorescentiIbridazione del cromosoma con sonde fluorescenti

Cromosomi metafasici su vetrino;Cromosomi metafasici su vetrino; Denaturazione del DNA; Rinaturazione in Denaturazione del DNA; Rinaturazione in presenza di un eccesso di sonda fluorescente specifica per una determinata presenza di un eccesso di sonda fluorescente specifica per una determinata regione del cromosomaregione del cromosoma

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6363

…AATCCCAATCC

TTAGGG*sonda

telomero

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6464

Fluorescent In Situ Hybridization

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6565

Origine evolutiva del cromosoma 2 Origine evolutiva del cromosoma 2 umanoumano

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6666

Origine evolutiva del cromosoma 2 umano: Origine evolutiva del cromosoma 2 umano: fusione di cr 12 e cr 13 di pan trogloditesfusione di cr 12 e cr 13 di pan troglodites

Sequenze telomeriche Sequenze telomeriche