Replicazione del DNAReplicazione del DNA

• la replicazione del DNA viene effettuata da ENZIMI: DNA-polimerasi (catalizza la formazione del legame fosfodiestere)

• ogni filamento fa da stampo (enzima diretto dallo stampo)

• le DNA-polimerasi possono allungare la catena solo aggiungendo nuovi nucleotidi al gruppo -OH 3’ libero della catena

• molte DNA-polimerasi hanno attività nucleasica per correggere gli errori

Forcelle di replicazione e appaiamento delle basi

ReplicazioneReplicazione

ReplicazioneReplicazione stampo

replicaAggiunta di un nucleotide e formazione del legame fosfodiestere 3’-5’

Primer di RNA con gruppo 3’-OH libero

replicazione DNA

idrolisi di (PPi) favorisce la polimerizzazione

Le polimerasi allungano il filamento solo in direzione 5’ 3’

Avanzamento della forcella di replicazione: catena leader

i frammenti sono poi legati dall’enzima DNA-ligasi

catena ritardataReplicazione semidiscontinua

Mutazioni puntiformi, ricombinazioni e trasposizioni sono alla base dell’evoluzione biologica

Varie proteine concorrono a determinare l’attività di replicazione, dicorrezione e riparazione

Frammento della DNA-polimerasi di E.coli

dominio polimerasico: catalizza la formazione del legane fosfodiesteredomino esonucleasico: idrolizza i legami con basi

errate

Mutazioni puntiformi, ricombinazioni e trasposizioni sono alla base dell’evoluzione biologica

INTERAZIONI DNA-PROTEINE

• Impacchettamento del DNA (istoni)• Regolazione della replicazione ed espressione (repressori e attivatori specifici, riparatori etc) • Metilazione e taglio di DNA estraneo

Ex. EcoRI Endonucleasi di restrizione riconosce un segmento autocomplementare (palindromo): TCGCGAATTCGGCG

ruolo delle scanalature!

Sequenziamento e manipolazione

Endonucleasi di restrizione di tipo II nei batteri, un utile strumento di laboratorio: forbici molecolari

•Tecnologia del DNA ricombinante: si basa sull’enzimologia degli acidi nucleici e sulla capacità di appaiamento delle basi

Riconoscimento di sequenze specifiche del DNA duplex

Mappe di restrizione: ricostruzione delle sequenze

Digestione di un’ipotetica sequenzadi DNA mediante endonucleasi direstrizione. Determinazione delledimensioni dei frammenti e posizionamento dei siti bersaglio

Mappe di restrizione

ddNTP (Di-deossi-nucleoside Trifosfato)

Sequenziamento a terminazione di catena1. Separazione dei due filamenti (eventuale frammentazione con endonucleasi)2. DNA polimerasi I di E.coli + 2’-3’ dideossi nucleotidi

Interruzione controllatadella replicazione

primer+marcatori fluorescentirendono possibile il sequenziamentoautomatico

4 miscele di reazione:

Sanger Dideoxy Method of DNA Sequencing

Automated DNA Sequencing

PCR: reazione a catena della polimerasi. Amplificazione del DNA

(95°C)

(Presenti un grande eccesso)

Riscaldamento a 72°C per l’azione ottimaledella polimerasi Taq termostabiel

La PCR è una tecnica estremamente sensibile

(è possibile amplificare una singola molecola di DNA da caratterizzare e/o manipolare e/o un singolo gene)

•utile per la diagnostica medica (identificazone di virus e batteri) e malattie genetiche

•per la medicina forense (paternità, violenza carnale, omicidi..)

•per gli studi di evoluzione molecolare (DNA stabile, recuperato anche di specie estinte)

Il dogma centrale della Biologia Molecolare

trascrizione

traduzione

Sintesi proteica

DNA

mRNA

Proteina

ribosoma

TrascrizioneTrascrizionemRNA: viene sintetizzato con sintesi diretta dal DNA, dalla RNA-polimerasi

promotori della trascrizione:sequenze di DNA che dirigono la RNA-polimerasi verso i siti della trascrizione

negli eucarioti i geni sonomosaici di introni e esoni

Efficacia dei promotori eproteine regolatrici regolanola frequenza di trascrizione

Bolla di trascrizione

(catena)N + nucleoside trifosfato ↔ (catena)N+1 + PPi

Traduzione e codice geneticoTraduzione e codice genetico

• la sequenza di basi del DNA codifica la sequenza di amminoacidi nella proteina

4 basi: A T C G20 amminoacidi

codoni

triplette di basi: 43= 64 combinazioni

• il codice genetico è: non sovrapposto senza punteggiatura degenerato

codice sovrapposto: UCCGGAAACUCCUUUaa1 aa3 aa5 aa7

aa2 aa4 aa6

codice punteggiato: UCCGGAAAACUCCUUU

aa1 aa2 aa3

mutazioni puntuali (una lettera ) produrrebbero la modifica di due residui

Delezioni di 4 lettere dovrebbero mantenere la fase di lettura

codice degenerato: un AA è codificato da più triplette

•le prime due lettere sono costanti

•alcuni codoni non codificano per AA:

segnali di inizio segnali di stop

•I segnali di inizio sono complessi •I codoni di stop sono letti dalle proteine “fattori di rilascio”

Sintesi proteica

I codoni che codificano per amminoacidi solo letti da tRNA

Ad ogni amminoacido corrisponde una molecola di tRNA che lo riconosce e lo utilizza secondo le istruzioni di mRNA

Sintesi “veloce”: 40AA/sec in E.Coli ed accurata: freq.errore 10-4

Aspetti generali della struttura tRNAAspetti generali della struttura tRNA struttura secondaria a trifogliostruttura secondaria a trifoglio

• tutti contengono 70-80 nucleotidi• alto contenuto di basi modificate

• struttura generale simile

7 bp appaiate nello stelo accettore

Y R pirimidine e purine * basi variabili

° basi con appaiamenti

insoliti

TψC sequenza comune

CCAsempre presente

complementare a un codone in mRNA

In sequenza e in lunghezza

tRNAPhe da lievito

La struttura terziariaLa struttura terziaria

• struttura compatta

• conformazione a L

• un braccio composto dallo stelo accettore e dallo stelo T

• un braccio composto dallo stelo D e dallo stelo dell’anticodone

• 42 basi su 76 sono in doppia elica

• 71 basi coinvolte in interazioni di impilamento

60Å

25Å anticodone

La struttura terziaria è conservatapiù della struttura primaria

La struttura terziaria è resa stabile da 9 interazioni

Il legame peptidico•La polimerizzazione di AA viene raggiunta per eliminazione di una molecola d’acqua tra il gruppo carbossilico di un AA e il gruppo amminico del successivo.

•Nelle cellule il legame viene creato nei ribosomi, catalizzato da enzimi.

La catena ha una direzione!!

L’idrolisi del legame peptidico è termodinamicamente favorita rispetto alla formazione del legame (condensazione ∆G0=+10kJmol-1)

I POLIPEPTIDI SONO MOLECOLE METASTABILI

La formazione del legame avviene con l’utilizzo di ATP, per azione di aminoacil-tRNA-sintetasi che attivano gli AA nel legame con tRNA

1. AA+ATP Amminoacil-AMP + PPi

2. Amminoacil-AMP +tRNA

+ AMPAmminoacil-tRNA tRNA

Il legame peptidico a partire dagli amminoacil-tRNA ètermodinamicamente favorito

Gli aminoacidi sono uniti al gruppo ossidrilico del ribosio in posizione 2’o 3’ dell’adenosina invariante 3’ terminale

• l’accoppiamento tra tRNA e aminoacido è realizzato dagli enzimi aminoacil-tRNA sintetasi• diverse specifiche aminoacil-tRNA sintetasi riconoscono i diversi aminoacidi

AA +ATP+tRNA amminoacil-tRNA+AMP+ PPi

attivazione

il corretto tRNA viene riconosciuto dall’enzima in zone specifiche, e diverse, del tRNA.

treonil-tRNA sintetasi

Due classi di tRNA sintetasi

• Riconoscono siti diversi in t RNA• Il braccio terminale CCA adotta diverse conformazioni• Le sintetasi di classe I legano l’AA in posizione 2’ quelle di calsse II in posizione 3’

I ribosomi sono le macchine molecolari che coordinano l’attività dei tRNA di mRNA e delle proteine e del rRNA che partecipano al processo di

sintesi proteicasono RIBONUCLEOPROTEINE

Sono composti di subunità. In una cellula batterica sono presenticirca 20000 ribosomi

A = amminoacilicoP = peptidicoE = exit (uscita)

Il legame peptidico si forma mediante attacco nucleofilico del gruppo NH2 nel sito successivo.∆G0 < 0

Si possono determinare i livelli di espressione genica in termini di quantità di mRNA corrispondente mediante l’utilizzo di:

DNA microarray o gene chip

Il principio su cui si basa la tecnicaè quello di ibridizzare il mRNA conoligonucleotidi complementari e di rivelarne la presenza e quantità mediante fluorescenza.

della mammella