DNA Replication. DNA Replication II Replicazione e ricombinazione del DNA La replicazione...
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DNA ReplicationDNA Replication
DNA Replication IIDNA Replication II
Replicazione e ricombinazione del DNAReplicazione e ricombinazione del DNA
La replicazione semiconservativaLa replicazione semiconservativaTre modelli proposti per la replicazione del DNA
La replicazione è semiconservativa: ogni frammento di DNA serve da stampo per la sintesi di una nuova molecola di DNA
Esperimento di Meselson Esperimento di Meselson e Stahle Stahl
- centrifugazione in gradiente di densità all’equilibrio per distinguere DNA contenenete 14N pesante e DNA 15N più leggero
DEFINIZIONI e TERMINOLOGIA:DEFINIZIONI e TERMINOLOGIA:
Replicone= unità di replicazione con propria origine di replicazione. Origine di replicazione=zona specifica del cromosoma dove le doppia elica si denatura in singoli filamenti, esponendo le basi per la sintesi di nuove eliche.Bolla di replicazione:regione del cromosoma dove il DNA è a singole elica e dal quale la replicazione procede in modo bidirezionale.
Le modalità di replicazioneLe modalità di replicazione1. La replicazione teta1. La replicazione teta
Comune in E.Coli e in altri organismi con DNA circolare
2. La replicazione a circolo rotante2. La replicazione a circolo rotante
Comune in alcuni virus e nel fattore F di E.coli
3. La replicazione lineare negli 3. La replicazione lineare negli eucariotieucarioti
Requisiti per la replicazione:-stampo di DNA a singolo filamento-substrati da assemblare nel filamento di neoformazione-enzimi e altre proteine che “leggono” lo stampo e assemblano i substrati
La direzione della replicazioneLa direzione della replicazione
La sintesi del DNA è La sintesi del DNA è continua su un filamento continua su un filamento di DNA stampo e di DNA stampo e discontinua sull’altrodiscontinua sull’altro
Modello tetaModello teta
Modello circolo rotanteModello circolo rotante
Replicazione lineareReplicazione lineare
La replicazione del La replicazione del DNA battericoDNA batterico
- L’INIZIO- L’INIZIOIn E.coli la replicazione ha inizio quando le proteine iniziatrici si legano a oriC, l’origine di replicazione, provocando lo svolgimento di un breve tratto di DNA.
- LO SVOLGIMENTO- LO SVOLGIMENTOLa DNA elicasi svolge il DNA legandosi al filamento ritardato che funge da stampo a livello di ogni forcella di replicazione e muovendosi in direzione 5’ 3’ lungo il filamento.
-GLI INNESCHI e L’ALLUNGAMENTOGLI INNESCHI e L’ALLUNGAMENTOLa primasi sintetizza brevi tratti nucleotidici di RNA, fornendo un gruppo 3’-OH a cui la DNA polimerasi può aggiungere nucleotidi di DNA.
DNA Polymerase III DNA Polymerase III The "real" polymerase in E. coli
• At least 10 different subunits • "Core" enzyme has three subunits - , ,
and • Alpha subunit is polymerase • Epsilon subunit is 3'-exonuclease • Theta function is unknown • The beta subunit dimer forms a ring
around DNA • Enormous processivity - 5 million bases!
DNA Polymerase I DNA Polymerase I Replication occurs 5' to 3'
• Nucleotides are added at the 3'-end of the strand • Pol I catalyzes about 20 cycles of polymerization before
the new strand dissociates from template • 20 cycles constitutes moderate "processivity" • Pol I from E. coli is 928 aa (109 kD) monomer • In addition to 5'-3' polymerase, it also has 3'-5'
exonuclease and 5'-3' exonuclease activities
- La DNA LIGASI- La DNA LIGASILa DNA ligasi chiude l’interruzione lasciata dalla DNA polimerasi I nello scheletro di zucchero-fosfato dopo che quest’ultima ha aggiunto il nucleotide finale.
- LA FORCELLA DI - LA FORCELLA DI REPLICAZIONEREPLICAZIONE
Modello di replicazione del DNA in E.coli:
le due unità della DNA pol III sono connesse e il filamento ritardato che funge da stampo forma un anello tale che la replicazione possa avere luogo sui due filamenti di DNA antiparalleli.
-LA FEDELTA’ DELLA REPLICAZIONE DEL DNALA FEDELTA’ DELLA REPLICAZIONE DEL DNA-selezione dei nucleotidi-correzione di bozze-riparazione dei malappaiamenti
Other Proteins That Assist DNA Other Proteins That Assist DNA ReplicationReplication
• Helicase, topoisomerase, single-strand binding protein
Table 16.1
La replicazione del DNA negli eucariotiLa replicazione del DNA negli eucarioti
Microfotografia elettronica di DNA eucariotico durante il processo della replicazione: il DNA neosintetizzato è già coperto da nucleosomi
Polimerasi nei ProcariotiPolimerasi nei ProcariotiI Procarioti possiedono cinque tipi di DNA Polimerasi:
•DNA Polimerasi I: implicata nella riparazione del DNA e nella rimozione degli inneschi dei frammenti di Okazaki. Possiede attività esonucleasica sia in direzione 5'->3', sia in direzione 3'->5' •DNA Polimerasi II: indotta da danni al DNA per riparazione incline all'errore (error-prone). Ha attività polimerasica 5'->3' ed esonucleasica 3'->5' •DNA Polimerasi III: l'enzima principale per la replicazione, con attività polimerasica 5'->3' ed esonucleasica (nella correzione di bozze, o proofreading) 3'->5'. Attiva sia nella sintesi del filamento leading, sia in quella dei frammenti di Okazaki. •DNA Polimerasi IV-V: anch'esse coinvolte nella riparazione incline all'errore
Polimerasi negli EucariotiPolimerasi negli Eucarioti
Le Polimerasi degli Eucarioti sono costituite invece da:
•DNA Polimerasi α: è una primasi (enzima che sintetizza i primer di RNA) e procede inoltre all'allungamento dei primer con alcune centinaia di deossiribonucleotidi.
•DNA Polimerasi δ: l'enzima principale della replicazione eucariotica. Sintetizza sia il filamento leading, sia il filamento lagging. Riempie inoltre le interruzioni tra i frammenti di Okazaki.
•DNA Polimerasi β: coinvolta nella riparazione del DNA
•DNA Polimerasi γ: replica il DNA mitocondriale
•DNA Polimerasi ε: stessa funzione della Polimerasi δ.
Prokaryotes Eukaryotes
5 polymerases (I, II, III, IV,V) 5 polymerases--I--excision repair, removal of RNA primers
--polymerization
II-repair repair
--mitochondrial
III-main enzyme main enzyme
IV,V-repair, special conditions --unknown
polymerases also exonucleases not all exonucleases
1 Origin of replication many origins
Okazaki fragments 1000-2000 nuc.Okazaki fragments 150-200 nuc.
no proteins on DNA histones
Tipo di organismo Nome scientifico Ripetizione telomerica (direzione 5' -> 3')
VertebratiHomo sapiens, Mus musculus, Xenopus laevis
TTAGGG
Funghi Neurospora crassa, Physarum, Didymium TTAGGG
Protisti Dictyostelium discoideum AG(1-8)
Kinetoplastea (protozoi) Trypanosoma, Crithidia TTAGGG
protozoi ciliati
Tetrahymena, Glaucoma TTGGGG
Paramecium TTGGG(T/G)
Oxytricha, Stylonychia, Euplotes TTTTGGGG
Apicomplexa Plasmodium TTAGGG(T/C)Piante superiori Arabidopsis thaliana TTTAGGGAlghe verdi Chlamydomonas TTTTAGGGInsetti Bombyx mori TTAGGAnellidi Ascaris lumbricoides TTAGGC
Lieviti a scissione binaria Schizosaccharomyces pombe TTAC(A)(C)G(1-8)
Lieviti gemmanti
Saccharomyces cerevisiaeTGTGGGTGTGGTG (da stampo RNA)o G(2-3)(TG)(1-6)T (sequenza consenso)
Candida glabrata GGGGTCTGGGTGCTG
Candida albicans GGTGTACGGATGTCTAACTTCTT
Candida tropicalisGGTGTA[C/A]GGATGTCACGATCATT
Candida maltosa GGTGTACGGATGCAGACTCGCTT
Candida guillermondii GGTGTAC
Candida pseudotropicalisGGTGTACGGATTTGATTAGTTATGT
Kluyveromyces lactisGGTGTACGGATTTGATTAGGTATGT
Modello di Holliday:rottura singolo filamentoModello di Holliday:rottura singolo filamento
Rot t
ura
dop
pio
fila
men
t oR
ot t
ura
dop
pio
fila
men
t o