FISIOLOGIA DELLA

EMOPOIESI

EMOPOIESIdefinizione

L’insieme dei processi che regolano il

mantenimento del numero fisiologico

di cellule circolanti del sangue in

condizioni di omeostasi e intervengono

come compenso in situazioni di

perdita/distruzione, o per rispondere

adeguatamente ad un aumento della

richiesta da parte dell’organismo

EMOPOIESImeccanismi di regolazione

CELLULARE: Presenza di cellule con diverse

potenzialità proliferative e

maturative

INTERCELLULARE: Interazione delle cellule

emopoietiche con elementi

cellulari e proteine dello stroma

ESOGENO:

Cell nonautonomous

Fattori di crescita (citochine) ed

altre molecole non citochiniche

(es. ormoni) che hanno la

proprietà sia di stimolare che di

inibire, a diversi livelli,

l’emopoiesi

ENDOGENO:

Cell autonomous

Molecole di regolazione

intracellulare, come le cascate

dei secondi messaggeri ed i

fattori di trascrizione nucleari.

SCF/cKitproteine della matrice/

recettori

citochine

prodotte

distalmente

cellule dello stroma

osteoblasti Notch/Jagged

HSC

CLP CMP

maturazione

stimolatorie

inibenti

sinusoidi midollari

citochine

prodotte

in loco

IL TURNOVER DELLE CELLULE DEL SANGUE

ERITROCITI GRANULOCITI

NEUTROFILI

PIASTRINE

5 x 106 / l 3.6x 103 / l 2 x 105 / l

5 x 1012 / L 3.6x 109 / L 2 x 1011 / L

25 x1012 / PERSONA 18 x 109 / PERSONA 2 x 1011 / PERSONA

120 GIORNI 12 ORE ~ 10 GIORNI

2 x 1011 / DIE 0.36 x 1011 / DIE 1 x 1011 / DIE

200.000.000.000 36.000.000.000 100.000.000.000

IL-7Ra- c-mpl+

LT-HSC

CLP

ST-HSC

Pro-T Pre-T

Pro-B Pre-B

MPP

B/Mf

NK

IL-7Ra+ c-mpl-

CMP

GMP

CFU-M

CFU-G

Epo-R-

Epo-R+

MEPCFU-Meg

BFU-E CFU-E

DC

DC

CELLULE

STAMINALI PROGENITORI PRECURSORIELEMENTI

MATURI

NUMERO DI CELLULE

SPECIALIZZAZIONE FUNZIONALE

PLASTICITA’ FUNZIONALE

ATTIVITA’ MITOTICA

differenziazione

apoptosi

espansione

differenziazione/

automantenimento

quiescenza

HSC

SELF-RENEWAL DIFFERENTIATION

The capacity to

reproduce themselves

The capacity to

generate terminally-differentiated

specialized cells

…..

“Stemness”

genesON OF

Tumor

suppressor

genes

OFF ON

Differentiation

genesOFF ON

CELLULA STAMINALE

EMOPOIETICAmarkers

c-kit

CD34

Thy1

Non espresse

CD10

CD14

CD15

CD16

CD19

CD20

CD38

Fenotipo staminale

CELLULE CD34+

• 1-2% nel midollo

• 0.05% nel sangue periferico

• 0.3-0.5% nel sangue cordonale

• 0.5-3% nel sangue periferico mobilizzato

• >> in condizioni patologiche (IM)

• LTR dopo terapia mieloablativa

• Proteina transmembrana

• Funzione non nota (adesione?)

• 105-120 kD

• Altamente glicosilata

• 3 epitopi diversi (mAb di tre classi)

• Varianti molecolari

IN VIVO IN VITRO

CFU-GEMM

CFU-GM

CFU-Mk

CFU-G

CFU-M

BFU-E CFU-E

16-14 gg 14 gg 7 gg

SISTEMI DI ASSAY DELLE CELLULE

STAMINALI E DEI PROGENITORI:

CELLULE STAMINALI:

in vivo: animali subletalmente irradiati, NOD/SCID,

pazienti sottoposti a trapianto allogenico

in vitro: ?? Colture long-term

PROGENITORI COMMISSIONATI:

in vitro: CFU

SIDE POPULATION:

In vitro: trasportatori della famiglia ABCaltamente espressi nella membrana

dei progenitori immaturi estrudono il

colorante Heochst

• La capacità proliferativa e differenziativa delle

CD34+Lin- da PB è inferiore rispetto a BM

• Il # di cellule necessario per la ricostituzione

emopoietica in trapianti xenogenici da PB è

superiore rispetto a BM

• La long-term repopulation ability in trapianti

secondari e terziari delle cellule da PB è inferiore

rispetto a BM

• Non vi è evidenza di senescenza patologica delle

cellule staminali (lunghezza telomerica) in riceventi

di BM vs PB

• L’aggiunta di SCF a G-CSF incrementa il numero di

cellule LTR in topi

CELLULE CD34+

MODELLI DI STRUTTURA DEL

SISTEMA EMOPOIETICO

STOCASTICO I processi di proliferazione e turnover e

differenziamento delle HSC sono guidati da

fenomeni probabilistici

DETERMINISTICO

Potenziale predeterminato: fenomeno

programmato a priori a livello genetico

Controllo Extracellulare: effetto induttivo del

microambiente midollare e dal particolare milieu

citochinico in cui le cellule si vengono a trovare

OSTEOBLASTI

NICCHIA OSTEOBLASTICA

LT-HSCs

I processi di automantenimento e differenziazione

delle HSC richiedono uno specifico microambiente,

formato da elementi cellulari e molecole, noto come la

“nicchia” emopoietica

Ligands in stem cell

niche

Receptors in

HSCs Function

N-Cad N-Cad Cell adhesion

VCAM Integrin Cell adhesion

Ang-1 Tie-2 Stem cell maintenance

Jagged1 NotchPositive regulator of self-

renewal

Wnt3a FrizzledPositive regulator of self-

renewal

Ca2+ CAR Stem cell homing

Some of the important molecules within the HSC

niche and their corresponding receptors on HSCs

Avecilla ST, 2004

NICCHIA VASCOLARE

Stem cell niche Circulation

STEM CELL CIRCULATION

Extrinsic Intrinsic

REGOLAZIONE INTRINSECA

• egr-1 transcription factor gene (Early

Growth Response Factor-1) gene is highly

expressed by HSC and strongly repressed

during HSC mobilization. It functions by

restricting HSC entry into the cell cycle and

limiting HSC migration through a CXCR4-

SDF-1 independent mechanism. It seems to

act predominantly through a transcriptional

repression mechanism

REGOLAZIONE ESTRINSECA

Osteoblastic niche

Cycloph

G-CSF

Proliferation

Chemokine

circulation

SDF1

REGOLAZIONE DELL’EMOPOIESI

• Controllo esogena

• Controllo endogena

Fattori di crescita(CSF)

Interleuchine

citochine

Fattori Trascrizionali

Meccanismi epigenetici

IL-6

IL-11

SCF

LIF

FL...

GM-CSF

G-CSF

TPO

EPO

IL-2

IL-7, -4

IL-7

IL-3

SCF

CITOCHINESORGENTE

CELLULAREBERSAGLIO CELLULARE FUNZIONE

IL-4Linfociti T,

Mastociti

Linfociti T e B, Progenitori

emopoietici precoci

Stimola la proliferazione dei linfociti B, lo sviluppo di

cellule TH2, lo switch isotipico verso la classe IgE e

promuove la crescita dei mastociti

IL-5Linfociti T,

MastocitiEosinofili Stimola la proliferazione e l’attivazione degli eosinofili

IGF-1 Fegato Progenitori eritroidiInduce la formazione di CFU-E; possiede un effetto

anti-apoptotico.

GM-CSF

Cellule stromali

Linfociti T,

Mastociti

Progenitori emopoietici,

Precursori della linea

granulocitaria e monocitaria

Stimola l’emopoiesi precoce, la proliferazione e

l’attività di monociti, granulociti e mastociti

G-CSF

Cellule stromali,

Macrofagi,

Monociti

Progenitori granulocitari,

Granulociti maturi

Stimola l’emopoiesi precoce, la proliferazione e

l’attività dei granulociti.

M-CSF

Cellule stromali,

Macrofagi,

Monociti

Progenitori monocitari, Monociti Stimola la proliferazione e l’attività dei monociti

Eritropoietina Reni, Fegato Progenitori e Precursori eritroidi Fattore di regolazione della eritropoiesi

Trombopoietina Fegato, ReniCellula staminale, Megacariociti,

Progenitori eritroidi

Fattore di regolazione della megacariocitopoiesi;

attivo sulle cellule staminali; interviene in alcune fasi

della eritropoiesi; stimola l’adesione dei progenitori

emopoietici alla fibronectina

CONTROLLO ESOGENOCITOCHINE

SORGENTE

CELLULAREBERSAGLIO CELLULARE FUNZIONE

IL-3 Linfociti T Progenitori emopoietici precoci

Fattore di crescita multipotente che stimola la

crescita dei progenitori emopoietici precoci e

induce l’espressione di M-CSF dai macrofagi

IL-6

Fibroblasti,

Linfociti T,

Macrofagi,

Epatociti,

Cellule

somatiche

Linfociti T, Megacariociti

Stimola la sintesi delle proteine di fase acuta negli

epatociti; induce il differenziamento del linfocita B

verso la plasmacellula; stimola la

megacariocitopoiesi; ha un’azione sinergica con

IL-3, IL-4, IL-1 e IL-2

IL-7Cellule

stromaliProgenitori linfoidi precoci Stimola la proliferazione dei precursori linfoidi

IL-11

Fibroblasti,

cellule

stromali

Megacariociti, Progenitori

eritroidi, Linfociti B

Interviene durante la megacariocitopoiesi e nelle

fasi terminali dell’eritropoiesi .

SCF

(kit

ligand)

Cellule

stromali,

Fibroblasti,

Epatociti

Mastociti, Progenitori

pluripotenti, Progenitori

mieloidi, eritroidi e linfoidi

Fattore di crescita delle cellule staminali

pluripotenti; interviene sinergicamente con IL-3,

GM-CSF e Epo nelle fasi terminali dell’emopoiesi;

stimola la proliferazione, il diffenziamento e la

chemiotassi dei mastociti

Flt-3LFibroblasti

stromali

Cellule staminali e progenitori

emopoietici

Fattore di crescita delle cellule staminali e dei

progenitori emopoietici

LIFCellule

stromali

Progenitori emopoietici

multipotenti

Riduce la capacità proliferativa; induce il

differenziamento dei progenitori emopoietici;

stimola la piastrinopoiesi

• Il differenziamento di linea si spiega in

maniera convincente con il profilo di

espressione di fattori di trascrizione critici

per le diverse linee

• I FT critici agiscono in maniera coordinata,

contesto-dipendente, e interattiva

• Molti di questi FT sono stati scoperti per il

loro coinvolgimento in traslocazioni

cromosomiche in pazienti con leucemia

CONTROLLO ENDOGENO

Geni del “differenziamento”

La specificità di azione dello stesso FT in linee diverse

può essere spiegato con 2 meccanismi diversi:

1. La presenza di co-fattori linea-specifici

es. FOG-1 e GATA1. FOG-1 presenta regioni diverse in grado di

influenzare il differenziamento verso le diverse filiere

emopoietiche .

2. La presenza di differenti livelli di espressione del FT.

Es. GATA1 in cui il differenziamento megacariocitario richiede

livelli di espressione più elevati rispetto a quello eritrocitario .

Es. PI.1 in cui elevati livelli indirizzano verso la differenziazione

macrofacica, livelli intermedi verso quella granulocitaria e livelli

minimi verso il differenziamento B-linfocitario.

Antagonismo funzionale dei FT

CMP

MEP GMP

RBC MK GN Mo/MAc

PU.1

GATA-1

EKLF

Fli

Gfi-1

PU.1

Cell lineage reprogramming:

single-factor activity

GATA-1

Induction of megakaryocytic differentiation in primary human erythroblasts

Goldfarb AN, Am J Pathol 2001; 158:1191

Green: HbA

Red: GPIIb Purified GPA+ erythroblasts

+ HEL conditioned medium

+ Thrombopoietin

Day 2

Day 5

Day 0

PRIMITIVEEMBRYONIC

Yolk sacE7.5 to E11

DEFINITIVE

LiverE9.5

to newborn

ADULT

DISTINCT STAGES OF ERYTHROPOIESIS

DURING DEVELOPMENT

Shimizu R, 2001; Zang H, 2001

E 9.5

Bone MarrowE15

throughout life

E 12.5

PRIMITIVE EMBRYONIC DEFINITIVE

DEVELOPMENTAL BLOCK OF

ERYTHROPOIESIS

8.5 9 10-11 11.5 12.5

SCL LMO2

GATA-2

GATA-1

FOG1

16

EKLF

13.5

WT WTKO KO

c-Myb“bloodlessmice”

PRIMITIVE EMBRYONIC

DEFINITIVE

8.5 9 10-11 11.5 12.5 1613.5

Bcl-X

WT WTKO KO

EpoR

Stat5a

Jak2

Lyn

GRdim/dim

DEVELOPMENTAL BLOCK OF

ERYTHROPOIESIS

FL

SCF

IL-3

GM-CSF

Epo

Tpo

MplKitFlt3

Epo

GM-CSFRIL-3Rα

gp130

MplKit

Epo

GM-CSFRIL-3Rα

gp130

Mpl

Epogp130

Mpl

Epo

Stem cell BFU-E CFU-E Erythr

ERITROPOIESI

L’ eritrone

Costituisce l’ unità anatomo-funzionale dell’ eritropoiesi e comprende l’ intera popolazione cellulare che va dalle cellule staminali orientate in senso eritroide fino agli eritrociti circolanti . Si disstinguono :

• Progenitori eritroidi ( BFU-E, CFU-E ), non individuabili morfologicamente

• Precursori eritroidi, morfologicamente riconoscibili ( proeritroblasto, eritroblasto basofilo, eritroblasto policromatofilo, eritroblasto ortocromatico )

• Reticolociti

• Eritrociti

La più precoce cellula eritroide è chiamata BFU-E (burst forming unit

erythroid). Essa è in grado di dare origine, in terreno di coltura

semisolido (es. metilcellulosa), ad aggregati cellulari che dopo 14-16 giorni

di incubazione danno origine a macrocolonie (burst), di 30.000-40.000

cellule: eritroblasti (ortocromatici e policromatofili) ed eritrociti maturi ricchi

di emoglobina.

Un progenitore più maturo è il CFU-E (colony forming unit erythroid), che

genera in coltura dopo 7 giorni aggregati più piccoli di cellule

emoglobinizzate (8-65 cellule).

I “precursori” sono più maturi dei progenitori e sono identificabili senza essere

messi in coltura. Nella serie eritroide essi comprendono proeritroblasti,

eritroblasti basofili, policromatofili ed ortocromatici. Questi perdono il nucleo e

non contengono più DNA.

La “progenie” è invece rappresentata dai reticolociti che poi diventano

eritrociti.

ERITROPIESI

Tempo di produzione – 5 giorni

• Nucleo sempre più piccolo

• Cromatina sempre più aggregata

Il citoplasma cambia dal blu all’arancione

• diminuzione di RNA

• aumento in emoglobina

PROERITROBLASTOERITROBLASTO BASOFILO I ERITROBLASTO

BASOFILO II

ERITROBLASTO POLICROMATOFILO

I

ERITROBLASTO POLICROMATOFILO II

ERITROBLASTO ORTOCROMATICO

RETICOLOCITA

GLOBULI ROSSI

Fe

-O2

Fe

ERITROPOIETINAEPO

mRNA

Goldberg MA et al, 1988

SINTESI DELLA EPO•Cellule del sistema monocito-macrofagico intorno ai tubuli prossimali nella corticale del rene•Cellule renali peritubulari•Cellule epatiche

(epatociti e cellule di Ito)

•Progenitori eritroidi

ERITROPOIETINA

PERCHE’ NEL RENE? IL FLUSSO EMATICO RENALE E’ PARI AL 20%

DEL TOTALE E IL CONSUMO DI O2 NELLA CORTICALE DEL RENE E’

PRESSOCHE’ COSTANTE (PROPORZIONALE AL RIASSORBIMENTO DEL

Na). QUINDI NON VI SONO ELEMENTI LOCALI CHE MODIFICHINO LA

pO2. LA pO2 DIPENDE DALLA QUANTITA’ DI O2 TRASPORTATA DAGLI

ERITROCITI. LE CELLULE PERITUBULARI “SENTONO” LA pO2

ATTRAVERSO UN SISTEMA DI PROTEINE EMICHE LA CUI

CONFIGURAZIONE OSSI/DESOSSI REGOLA LA SINTESI DI UN FATTORE

DI TRASCRIZIONE (HYPOXIA INDUCIBLE FACTOR, HIF) CHE REGOLA LA

SINTESI DI EPO.

La visione “classica” del sistema eritropoietico

La visione “classica” del sistema eritropoietico

stimolo

sensoreprodotto

bersaglio

EpoEpo-R

effetto

JAK2 JAK2P

EPO

P

P P

P

P

P

JAK2 JAK2P

EPO

P

P P

STAT5STAT5

P

P P

P P

STA

T5

STA

T5

P

Transcription

PI-3 K RAS

LYN

MAP/ERK Kinase

JAK2 JAK2P

EPO

P

P P

P

P P

Transcription

STA

T5

STA

T5

P

X

EPO

STA

T5

STA

T5

P

SHP

1

SHP

1

P P

JAK2 JAK2P P

P

P P

JAK2 JAK2P P

P

P

R129C

SOCS

PIAS

Bcl-XLprom

immediate

delayed

Motoyama 1995; Merika 1985; Gregory 1999; Wagner 2000; Haughn 2003; Vannucchi 2002

APOPTOSISX

GATA-2prom PROLIFERATIONX

β-globinprom -globin

RIBOSOME

miRISC

Pre-microRNA

microRNA

Methylation

C

G

C

G

G

CC

G

C

G

Me Me

MeMe

C

G

Me

C

G

Me

C

G

MeMe

Transcriptionallyactive

H3H4

H2AH2B

Ac

K4

Ac

K4

K27K9

K27K9

K27K9

H3H4

H2AH2B

Transcriptionallyinactive

gene

Vannucchi AM et al, JCMM 2009

MECCANISMI di CONTROLLO EPIGENETICO

1

2

3

4

5

6

• Cell Development

• Metabolism

• Cell Proliferation

• Stress Response

• Angiogenesis

• Apopotosis

• Cell Dead

• Differentiation

miRNAs Functions:

CLP

CMP

MEP

Pro-T

Pro-B

HSC

T

B

miR-10a, miR-10b, miR-20,

miR-17, miR-126, miR-130a

miR-181a

miR-223 miR-142

miR-221 miR-222 miR-16

Chen ey al science 2004 , Fazi et a Cell 2005l Felli et al 2005, Garzon et al 2006, Bruchova et al 2007

microRNAs nell’EMOPOIESImiR-150 miR-146

miR-155

C/EBPb, BREBBP, JUN, MEIS1, PU.1

AGTR1, AGTR2, FOS

NFI-A

c-KIT, CREBBP, FOS,

ETS1, PPARg

PluripotentStem cells

MultipotentStem cell

CommittedPrecursors

Maturecells

miR-142, miR-16, miR-15