Chip a DNA: un esempio pratico Alessia Stell Laboratorio A. Maggi 9 Novembre 2010.

Chip a

DNA: un

esempio

pratico

Alessia StellLaboratorio A. Maggi9 Novembre 2010

Cosa sono

Come si producono

Microarray e Tiling Arrays

Quali utilizzi hanno

Chip a DNA

• I chip a DNA sono costituiti da un array di microscopiche aree, ciascuna contenente 107 sonde identiche di 20-50 pb, covalentemente fissate al supporto (vetro, plastica, silicio o beads di polistirene)

• Sfruttano una tecnica di ibridazione inversa: le probe sono fissate al supporto (in una posizione nota), mentre i frammenti di DNA da analizzare (target) sono marcati con biotina o con marker fluorescenti e ibridizzati alle sonde

• Il DNA target, legato alla sonda, può essere identificato utilizzando uno scanner, capace di rivelare il segnale emesso

Cosa sono i chip a DNA

• FOTOLITOGRAFIA (in situ):Fasci di luce e maschere fotolitografiche sono utilizzati per produrre le sonde direttamente sul supporto;

• SPOTTED MICROARRAYS:Le sonde sono sintetizzate prima della loro deposizione sull’array, e solo successivamente “spottati” sul supporto.

Come si producono

Microarray e Tiling array

• MICROARRAY DI ESPRESSIONE: le sonde utilizzate rappresentano porzioni di trascritti noti

Gene 1 Gene 2

• TILING ARRAYS: coprono l’intero genoma o porzioni definite di genoma (tutti i promotori, solo alcuni cromosomi…)

Gene 1 Gene 2

Quali utilizzi hanno

• MICROARRAY DI ESPRESSIONE: utilizzati quasi esclusivamente per l’analisi dei livelli di espressione di trascritti noti, confrontata in diverse condizioni (es. controllo-trattamento, cellula sana-cellula tumorale etc.)

Gene 1 Gene 2

• TILING ARRAYS: Utilizzati per• analisi unbiased dell’espressione genica (geni non noti e miRNA);• ChIP-on-chip (chromatin immunoprecipitation on a chip)• Array CGH (comparative genomic hybridization): tecnica usata in diagnostica per l’individuazione di copy number variations e anomalie del DNA

Gene 1 Gene 2

da dove siamo partiti

dove volevamo arrivare

quali tecnologie abbiamo usato

I gruppi sperimentali

Il mio

esperimento

• Gli estrogeni sono i principali ormoni sessuali nella donna ed influenzano la fisiologia femminile sotto vari aspetti

• Gli estrogeni permeano nelle cellule e legano il loro specifico recettore, una proteina intracellulare che , una volta attivata, è in grado di dimerizzare e attivare la trascrizione di specifici geni

Da dove siamo partiti

Cervello

Sistema Riproduttivo

Sistema Cardiovascolare

Cervello

Sistema Riproduttivo

Sistema Cardiovascolare

• Il modello animale utilizzato nel nostro laboratorio per lo studio dell’attivazione del recettore degli estrogeni in vivo è il modello ERE-Luc

Estrogen Receptor Responsive Element

Luciferasi

Estrogen Receptor Responsive Element

LuciferasiFotoni

Luciferina+ ATP

• Con questo modello abbiamo osservato l’attività del recettore degli estrogeni in condizioni fisiologiche nell’animale femmina ciclante, e ci siamo focalizzati sullo studio del ruolo del recettore degli estrogeni nel fegato

40 pg/ml

80 pg/ml

10 pg/ml

1500 pg/ml

CONDIZIONE FISIOLOGICA OVARIECTOMIA + induzione con ESTRADIOLO

40 pg/ml

80 pg/ml

10 pg/ml

1500 pg/ml

40 pg/ml

80 pg/ml

10 pg/ml

1500 pg/ml

40 pg/ml

80 pg/ml

10 pg/ml

1500 pg/ml

dove volevamo arrivare

Femmine adulte ciclanti

Gravide

> 22 mesi (menopausa)

Prepuberi

quali tecnologie abbiamo usato

Tiling Arrays

Analisi delle regioni di binding sulla cromatina di ERalfa nelle due diverse condizioni

Dove si localizza ERalfa?La sua localizzazione è influenzata dagli

estrogeni circolanti?

Microarray di espressione

Analisi delle differenze di espressione genica nelle due diverse condizioni

I livelli di estrogeni circolanti influenzano l’espressione genica? Quali sono i geni

differenzialmente espressi?

40 pg/ml

80 pg/ml

10 pg/ml

1500 pg/ml

40 pg/ml

80 pg/ml

10 pg/ml

1500 pg/ml

I gruppi sperimentali

40 pg/ml

80 pg/ml

10 pg/ml

1500 pg/ml

40 pg/ml

80 pg/ml

10 pg/ml

1500 pg/ml

METESTRO

Bassi livelli di estrogeno circolante

PROESTRO

Alti livelli di estrogeno circolante

Workflow

Output

Analisi dei Dati

Risultati

Microarray

Workflow

Congelamento

Estrazione RNA

RetrotrascrizioneMic

Marcatura Ibridazione

Output

Quasi 40.000 trascritti conosciuti

Output

I dati grezzi vengono raccolti in un file: File CELE normalizzati: file RMA

… e analizzati grazie all’aiuto del team di bioinformatici

Output

Met > Pro

Met < Pro

Lista dei geni individuati

Analisi dei dati

Come otteniamo informazioni da questa lista di geni?

Analizzandoli uno ad uno…. … o utilizzando specifici software che consentono di ottenere in

modo semplice informazioni sulla funzione dei geni identificati

CATEGORIE DI GENE ONTOLOGY

• GENE ONTOLOGY: può essere considerato una specie di enciclopedia che raccoglie tutte le informazioni disponibili sui geni noti, attraverso delle definizioni e delle parole chiave condivise.

• E’ suddiviso in 3 categorie:• Processi biologici • Funzioni molecolari • Componenti cellulari

Un prodotto genico ha una o più funzioni cellulari, può essere coinvolto in diversi processi biologici e infine potrebbe essere associato a diversi compartimenti cellulari.

http://www.geneontology.org/

http://www.geneontology.org/GO.tools.browsers.shtml

http://david.abcc.ncifcrf.gov/home.jsp

Analisi dei dati

Risultati

Met > Pro

Met < Pro

REGOLAZIONE della TRASCRIZIONE dell’mRNA(pVal=4.80 e-2)ILM

BIOSINTESI DEI LIPIDI e COLESTEROLO(pVal=5.10 e-6)ABCDEF

DETOXIFICATION(pVal=1.20 e-4)GH

Risultati

Ciclo Krebs

Biosintesi degli acidi grassi Biosintesi del colesterolo

Workflow e messa a punto

Output

Analisi dei dati

Risultati

ChiPOnchip

Workflow e messa a punto

Sonicazione

Crosslinking

Immunopre-cipitazione DNA

Binding RegionsDNA

Binding Regions

Crosslinking inversoPurificazione DNA

LM-AmplificationFrammentazione

Marcatura Ibridazione

Output

Cutoff

1. Rilevazione del segnale relativo alle sequenze Chipped, e posizionamento sul DNA

2. Definizione dei picchi relativi alle regioni di binding tramite specifico algoritmo

3. Normalizzazione e analisi dei picchi che superano il limite di cutoff

Output

Chr 10

23476246 23477332

BED file

Analisi dei dati

http://cistrome.dfci.harvard.edu/ap/

Analizzandoli uno ad uno…. … chiedendo l’aiuto dei bioinformatici che hanno creato di sicuro qualche software che ti sarà

d’aiuto

Analisi dei dati

Chr 10> > > >

• Dove si localizzano (cromosomi)

• Dove si localizzano rispetto a geni noti

• Quali sequenze legano

• Quali sono i geni che si trovano nelle vicinanze?

• http://genome.ucsc.edu/

Risultati

553 siti di binding

444 siti di binding

Risultati

Proestro Metestro

Geni che presentano un sito di binding a METESTRO nell’intorno di 20kb

Metabolismo dei lipidi e del colesterolo (pVal=1.30 e-3)Reagolazione dell’attività riproduttiva (pVal=1.40 e-3)

Geni che presentano un sito di binding a PROESTRO nell’intorno di 20kb

Regolazione dell’espressione genica (pVal=8.50 e-5)Regolazione dell’attività riproduttiva (pVal=3.90 e-4)

Significato biologico

Real time PCR

Esperimenti sull’animale

vengono

utilizzati i

dati ottenuti

nei due

esperimenti?

Real Time PCR

P E M D0

4 ****** ***

P E M D0

ELOVL6

P E M D0

P E M D0.0

2.5 ***

P E M D0.0

2.5***

Fatty acid biosynthetic pathway Cholesterol biosynthetic pathway

• I geni epatici coinvolti nel metabolismo degli acidi grassi e del colesterolo mostrano un andamento regolare durante il ciclo regolato dalla fluttuazione di estrogeni circolanti

Real Time PCR• I geni epatici coinvolti nel metabolismo lipidico e del colesterolo appaiono sregolati durante le diverse fasi fisiologiche della vita di una donna

P E M D

prepuber

pregnan

P E M D

prepuber

pregnan

******

ELOVL6

P E M D

prepuber

pregnan

P E M D

prepuber

pregnan

2.5 ****

P E M D

prepuber

pregnan

P E M D

prepuber

pregnan

P E M D

prepuber

pregnan

P E M D

prepuber

pregnan

******

ELOVL6

P E M D

prepuber

pregnan

P E M D

prepuber

pregnan

2.5 ****

P E M D

prepuber

pregnan

P E M D

prepuber

pregnan

P E M D

prepuber

pregnan

P E M D

prepuber

pregnan

******

ELOVL6

P E M D

prepuber

pregnan

P E M D

prepuber

pregnan

2.5 ****

P E M D

prepuber

pregnan

P E M D

prepuber

pregnan

Successivi esperimenti sull’animale

Femmine adulte ciclanti

Gravide

> 22 mesi (menopausa)

Prepuberi

• Il livello di espressione dei geni epatici coinvolti nel metabolismo lipidico e del colesterolo appaiono sregolati durante le diverse fasi fisiologiche della vita di una donna

• Si modifica anche il contenuto di lipidi del sangue e del fegato?

• Qual è la conseguenza biologica?

• Come può essere ripristinato il profilo lipidico corretto?

alessia.stell@unimi.it

Grazie dell’

attenzione

Chip a DNA: un esempio pratico Alessia Stell Laboratorio A. Maggi 9 Novembre 2010.

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