Chip a DNA: un esempio pratico Alessia Stell Laboratorio A. Maggi 9 Novembre 2010.
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Chip a
DNA: un
esempio
pratico
Alessia StellLaboratorio A. Maggi9 Novembre 2010
Cosa sono
Come si producono
Microarray e Tiling Arrays
Quali utilizzi hanno
Chip a DNA
• I chip a DNA sono costituiti da un array di microscopiche aree, ciascuna contenente 107 sonde identiche di 20-50 pb, covalentemente fissate al supporto (vetro, plastica, silicio o beads di polistirene)
• Sfruttano una tecnica di ibridazione inversa: le probe sono fissate al supporto (in una posizione nota), mentre i frammenti di DNA da analizzare (target) sono marcati con biotina o con marker fluorescenti e ibridizzati alle sonde
• Il DNA target, legato alla sonda, può essere identificato utilizzando uno scanner, capace di rivelare il segnale emesso
Cosa sono i chip a DNA
• I chip a DNA sono costituiti da un array di microscopiche aree, ciascuna contenente 107 sonde identiche di 20-50 pb, covalentemente fissate al supporto (vetro, plastica, silicio o beads di polistirene)
• Sfruttano una tecnica di ibridazione inversa: le probe sono fissate al supporto (in una posizione nota), mentre i frammenti di DNA da analizzare (target) sono marcati con biotina o con marker fluorescenti e ibridizzati alle sonde
• Il DNA target, legato alla sonda, può essere identificato utilizzando uno scanner, capace di rivelare il segnale emesso
Cosa sono i chip a DNA
• I chip a DNA sono costituiti da un array di microscopiche aree, ciascuna contenente 107 sonde identiche di 20-50 pb, covalentemente fissate al supporto (vetro, plastica, silicio o beads di polistirene)
• Sfruttano una tecnica di ibridazione inversa: le probe sono fissate al supporto (in una posizione nota), mentre i frammenti di DNA da analizzare (target) sono marcati con biotina o con marker fluorescenti e ibridizzati alle sonde
• Il DNA target, legato alla sonda, può essere identificato utilizzando uno scanner, capace di rivelare il segnale emesso
Cosa sono i chip a DNA
• FOTOLITOGRAFIA (in situ):Fasci di luce e maschere fotolitografiche sono utilizzati per produrre le sonde direttamente sul supporto;
• SPOTTED MICROARRAYS:Le sonde sono sintetizzate prima della loro deposizione sull’array, e solo successivamente “spottati” sul supporto.
Come si producono
Microarray e Tiling array
• MICROARRAY DI ESPRESSIONE: le sonde utilizzate rappresentano porzioni di trascritti noti
Gene 1 Gene 2
• TILING ARRAYS: coprono l’intero genoma o porzioni definite di genoma (tutti i promotori, solo alcuni cromosomi…)
Gene 1 Gene 2
Quali utilizzi hanno
• MICROARRAY DI ESPRESSIONE: utilizzati quasi esclusivamente per l’analisi dei livelli di espressione di trascritti noti, confrontata in diverse condizioni (es. controllo-trattamento, cellula sana-cellula tumorale etc.)
Gene 1 Gene 2
• TILING ARRAYS: Utilizzati per• analisi unbiased dell’espressione genica (geni non noti e miRNA);• ChIP-on-chip (chromatin immunoprecipitation on a chip)• Array CGH (comparative genomic hybridization): tecnica usata in diagnostica per l’individuazione di copy number variations e anomalie del DNA
Gene 1 Gene 2
da dove siamo partiti
dove volevamo arrivare
quali tecnologie abbiamo usato
I gruppi sperimentali
Il mio
esperimento
• Gli estrogeni sono i principali ormoni sessuali nella donna ed influenzano la fisiologia femminile sotto vari aspetti
• Gli estrogeni permeano nelle cellule e legano il loro specifico recettore, una proteina intracellulare che , una volta attivata, è in grado di dimerizzare e attivare la trascrizione di specifici geni
Da dove siamo partiti
Osso
Cervello
Sistema Riproduttivo
Sistema Cardiovascolare
Osso
Cervello
Sistema Riproduttivo
Sistema Cardiovascolare
• Il modello animale utilizzato nel nostro laboratorio per lo studio dell’attivazione del recettore degli estrogeni in vivo è il modello ERE-Luc
Da dove siamo partiti
Estrogen Receptor Responsive Element
Luciferasi
Estrogen Receptor Responsive Element
LuciferasiFotoni
Luciferina+ ATP
• Con questo modello abbiamo osservato l’attività del recettore degli estrogeni in condizioni fisiologiche nell’animale femmina ciclante, e ci siamo focalizzati sullo studio del ruolo del recettore degli estrogeni nel fegato
Da dove siamo partiti
40 pg/ml
80 pg/ml
10 pg/ml
1500 pg/ml
CONDIZIONE FISIOLOGICA OVARIECTOMIA + induzione con ESTRADIOLO
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CONDIZIONE FISIOLOGICA OVARIECTOMIA + induzione con ESTRADIOLO
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CONDIZIONE FISIOLOGICA OVARIECTOMIA + induzione con ESTRADIOLO
40 pg/ml
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1500 pg/ml
CONDIZIONE FISIOLOGICA OVARIECTOMIA + induzione con ESTRADIOLO
dove volevamo arrivare
Femmine adulte ciclanti
Gravide
> 22 mesi (menopausa)
Prepuberi
quali tecnologie abbiamo usato
Tiling Arrays
Analisi delle regioni di binding sulla cromatina di ERalfa nelle due diverse condizioni
Dove si localizza ERalfa?La sua localizzazione è influenzata dagli
estrogeni circolanti?
Microarray di espressione
Analisi delle differenze di espressione genica nelle due diverse condizioni
I livelli di estrogeni circolanti influenzano l’espressione genica? Quali sono i geni
differenzialmente espressi?
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1500 pg/ml
CONDIZIONE FISIOLOGICA OVARIECTOMIA + induzione con ESTRADIOLO
40 pg/ml
80 pg/ml
10 pg/ml
1500 pg/ml
CONDIZIONE FISIOLOGICA OVARIECTOMIA + induzione con ESTRADIOLO
I gruppi sperimentali
40 pg/ml
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10 pg/ml
1500 pg/ml
CONDIZIONE FISIOLOGICA OVARIECTOMIA + induzione con ESTRADIOLO
40 pg/ml
80 pg/ml
10 pg/ml
1500 pg/ml
CONDIZIONE FISIOLOGICA OVARIECTOMIA + induzione con ESTRADIOLO
METESTRO
Bassi livelli di estrogeno circolante
PROESTRO
Alti livelli di estrogeno circolante
Workflow
Output
Analisi dei Dati
Risultati
Microarray
Workflow
Congelamento
Estrazione RNA
RetrotrascrizioneMic
roarr
ays
Marcatura Ibridazione
Output
Quasi 40.000 trascritti conosciuti
Output
I dati grezzi vengono raccolti in un file: File CELE normalizzati: file RMA
… e analizzati grazie all’aiuto del team di bioinformatici
Output
Met > Pro
Met < Pro
Met
Pro
Live
llo E
2
Lista dei geni individuati
Analisi dei dati
Come otteniamo informazioni da questa lista di geni?
Analizzandoli uno ad uno…. … o utilizzando specifici software che consentono di ottenere in
modo semplice informazioni sulla funzione dei geni identificati
CATEGORIE DI GENE ONTOLOGY
• GENE ONTOLOGY: può essere considerato una specie di enciclopedia che raccoglie tutte le informazioni disponibili sui geni noti, attraverso delle definizioni e delle parole chiave condivise.
• E’ suddiviso in 3 categorie:• Processi biologici • Funzioni molecolari • Componenti cellulari
Un prodotto genico ha una o più funzioni cellulari, può essere coinvolto in diversi processi biologici e infine potrebbe essere associato a diversi compartimenti cellulari.
http://www.geneontology.org/
http://www.geneontology.org/GO.tools.browsers.shtml
http://david.abcc.ncifcrf.gov/home.jsp
Analisi dei dati
Risultati
Met > Pro
Met < Pro
REGOLAZIONE della TRASCRIZIONE dell’mRNA(pVal=4.80 e-2)ILM
BIOSINTESI DEI LIPIDI e COLESTEROLO(pVal=5.10 e-6)ABCDEF
DETOXIFICATION(pVal=1.20 e-4)GH
16%
Risultati
Ciclo Krebs
B
X
J
C
D
….
TG
Biosintesi degli acidi grassi Biosintesi del colesterolo
Z
W
Y
E
F
Workflow e messa a punto
Output
Analisi dei dati
Risultati
ChiPOnchip
Workflow e messa a punto
Sonicazione
Ch
IP-c
hip
Crosslinking
500
100
Immunopre-cipitazione DNA
mRNA
Binding RegionsDNA
mRNA
Binding Regions
Y
Crosslinking inversoPurificazione DNA
LM-AmplificationFrammentazione
Marcatura Ibridazione
Output
Cutoff
1. Rilevazione del segnale relativo alle sequenze Chipped, e posizionamento sul DNA
2. Definizione dei picchi relativi alle regioni di binding tramite specifico algoritmo
3. Normalizzazione e analisi dei picchi che superano il limite di cutoff
Output
Chr 10
23476246 23477332
BED file
Analisi dei dati
http://cistrome.dfci.harvard.edu/ap/
Analizzandoli uno ad uno…. … chiedendo l’aiuto dei bioinformatici che hanno creato di sicuro qualche software che ti sarà
d’aiuto
Analisi dei dati
Chr 10> > > >
• Dove si localizzano (cromosomi)
• Dove si localizzano rispetto a geni noti
• Quali sequenze legano
• Quali sono i geni che si trovano nelle vicinanze?
• http://genome.ucsc.edu/
Risultati
553 siti di binding
444 siti di binding
15%
Risultati
18%
51%
27%
12%
58%
28%
Proestro Metestro
Geni che presentano un sito di binding a METESTRO nell’intorno di 20kb
Metabolismo dei lipidi e del colesterolo (pVal=1.30 e-3)Reagolazione dell’attività riproduttiva (pVal=1.40 e-3)
Geni che presentano un sito di binding a PROESTRO nell’intorno di 20kb
Regolazione dell’espressione genica (pVal=8.50 e-5)Regolazione dell’attività riproduttiva (pVal=3.90 e-4)
Significato biologico
Real time PCR
Esperimenti sull’animale
Come
vengono
utilizzati i
dati ottenuti
nei due
esperimenti?
Real Time PCR
FASN
P E M D0
1
2
3
4 ****** ***
ACLY
P E M D0
1
2
3
4***
* ***
MVD
P E M D0
1
2
3
4
5 ***
ELOVL6
P E M D0
1
2
3***
***
PMVK
P E M D0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5 ***
DHCR7
P E M D0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5***
***
***
Fatty acid biosynthetic pathway Cholesterol biosynthetic pathway
• I geni epatici coinvolti nel metabolismo degli acidi grassi e del colesterolo mostrano un andamento regolare durante il ciclo regolato dalla fluttuazione di estrogeni circolanti
Real Time PCR• I geni epatici coinvolti nel metabolismo lipidico e del colesterolo appaiono sregolati durante le diverse fasi fisiologiche della vita di una donna
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Successivi esperimenti sull’animale
Femmine adulte ciclanti
Gravide
> 22 mesi (menopausa)
Prepuberi
• Il livello di espressione dei geni epatici coinvolti nel metabolismo lipidico e del colesterolo appaiono sregolati durante le diverse fasi fisiologiche della vita di una donna
• Si modifica anche il contenuto di lipidi del sangue e del fegato?
• Qual è la conseguenza biologica?
• Come può essere ripristinato il profilo lipidico corretto?