Università degli Studi di Perugia

Dipartimento di Specialità Medico-chirurgiche

e Sanità Pubblica

Cancerogenesi, mutagenesi ambientale e epidemiologia molecolare

Prof. Silvano Monarca

Indice

GENERALITA’

• Valutazione dei rischi cancerogeni per composti singoli

• Mutagenicità e cancerogenicità

• Miscele complesse ambientali

• Monitoraggio ambientale dei rischi mutageno/cancerogeni

• Applicazioni

• Epidemiologia molecolare

• Monitoraggio biologico dei rischi cancerogeni

• Considerazioni finali

Valutazione dei rischi cancerogeni per composti singoli

Rischio & pericolo

Rischio = Esposizione X Pericolo

PERICOLO (hazard): Presenza di un qualsiasi agente biologico, chimico o fisico che può nuocere alla salute RISCHIO (risk) : Stima della probabilità che un rischio si verifichi

Relazione dose-risposta

GESTIONE DEL RISCHIO E DEFINIZIONE STANDARD DI QUALITA’

VALUTAZIONE DEL RISCHIO

Valutazione e gestione del rischio cancerogeno per l’uomo

da esposizione a singoli composti chimici

Identificazione del pericolo (valutazione qualitativa)

Valutazione esposizione

MONITORAGGIO AMBIENTALE

MONIT. BIOLOGICO

Studi epidemiologici

test di mutagenesi a breve termine

Studi sperimentali su animali

COMUNICAZIONE DEL RISCHIO

STIMA DEL RISCHIO (valutazione quantitativa)

Valutazione della cancerogenicità e della genotossicità di inquinanti ambientali

6

+++

++

cancerogenicità

genotossicità

+++++

A

B1

B2 C

Classificazione cancerogenicità (EPA)

www.epa.gov

Classificazione cancerogenicità (IARC) www.iarc.fr

1 2A 2B

Cellulanormale

Cellulainiziata

Periodo di latenza

~1 giorno ~12.775 giorni(~35 anni)

Lesionepreneoplastica

Tumoremaligno

Cancroclinico

Radiazioni

Espansioneclonaleselettiva

Mutazionegenica

Mutazionegenica

Esposizione

Compostichimici

PromozioneIniziazione

Virus

PROCESSO DELLA CANCEROGENESI

•Attivazione di proto-oncogeni •Disattivazione di onco-soppressori •Inattivazione di geni anti-metastasi

ESTRAPOLAZIONEALLE BASSE DOSIDI ESPOSIZIONE

ESTRAPOLAZIONE DI CURVE DOSE-RISPOSTA

CANCEROGENI GENOTOSSIC

I

DATI SPERIMENTALIED EPIDEMIOLOGICI

DOSE SOGLIA

DOSE

RIS

PO

STA

NON CANCEROGENI

Agenti terapeutici e diagnostici cancerogeni

Mutagenesi, genotossicità e cancro

Mutageni e Mutagenesi ambientale

• Mutageni fisici: • Ricerche sull’effetto mutageno dei raggi X:

Muller, 1927 • Mutageni chimici: • Gas mostarda in Drosophila: Auerbach, 1946

La mutagenesi ambientale puo’ essere definita come la ricerca, l’identificazione e la caratterizzazione di agenti ambientali chimici e fisici capaci di produrre mutazioni in vari organismi animali e vegetali e nell’uomo.

I mutageni sono agenti capaci di aumentare la frequenza delle mutazioni

Genotossicità “Genotossicità” è un termine operativo più ampio e

comprende, oltre alle mutazioni, effetti diversi sul materiale genetico, quali:

• danni al DNA come rotture a singola o doppia elica

• addotti al DNA • sintesi non programmata del DNA (UDS,

unscheduled DNA synthesis) • scambi tra cromatidi fratelli (SCE, sister-

chromatid exchanges) • ricombinazione mitotica (crossing-over e

conversione genica).

I test di mutagenesi

• Il termine “mutagenesi” o “mutagenicità” si riferisce all’induzione di cambiamenti permanenti trasmissibili nella “quantità” o “struttura” del materiale genetico di cellule od organismi, a livello somatico o germinale. Questi cambiamenti possono avvenire:

• a livello genico (mutazioni geniche) • a livello cromosomico (mutazioni o

aberrazioni cromosomiche strutturali) • a livello genomico (mutazioni o aberrazioni

cromosomiche numeriche, quali aneuploidia e poliploidia).

Mutagenicità e genotossicità

• E’ importante per: • l’identificazione e la caratterizzazione della

pericolosità delle sostanze (hazard identification and characterization)

• la stima dei rischi cancerogeni (cancer risk assessment) in sistemi biologici o nell’uomo

• lo studio dei meccanismi di cancerogenesi • la estrapolazione da alte a basse dosi • la estrapolazione dei dati da animali all’uomo

Sistemi biologici utilizzati nei vari test di mutagenesi

Sito di attacco per i mutageni e per molti

cancerogeni

Interazioni con il DNA con agenti fisici o chimici

MUTAZIONI GENICHE

Puntiformi (sostituzione di uno o più coppie di nucleotidi) •Inserzioni e delezioni intrageniche

MUTAZIONI CROMOSOMICHE

•Delezioni (perdita di segmenti di cromosoma) •Inversioni (corredo genetico invariato) •Inserzioni e duplicazioni (acquisizione di materiale genetico) •Traslocazioni (acquisizione e/o perdita di materiale genetico)

MUTAZIONI GENOMICHE

•Monosomie (perdita di cromosomi interi) •Trisomie o polisomie (acquisizione di uno o pochi cromosomi in soprannumero) •Poliploidie (ripetizioni di un numero intero di genomi)

TEST DI AMES

• Test rapido di screening per la rilevazione di mutazioni puntiformi

• Batteri tester: ceppi di Salmonella typhimurium geneticamente

modificati (TA98 e TA100)

• L’azione dei mutageni sul DNA dei batteri determina un aumento

del numero di colonie retromutate

His -

His +

HIS G C

HIS A T

Retromutazione

Agente mutageno

.

• • • • • • • • •

• • • •

•

• • •

• • • • • •

•

Colonie batteriche

retromutate

Dosi crescenti del campioneNumero crescente di revertenti

Salmonella typhimurium Ceppo: TA98, TA100, ...(Coltura "over-night")

(a) (b) (c)

Campioni da saggiare.(A) (b) (c) Matrici ambiental.

Sostanze pure;Matrici biologiche;

Sistema di attivazionemetabolica ("S9-mix")

Agar-molle(2 ml)

Terreno minimo:-Glucosio- Sali minerali

37°C per 48 h

Dosi scalari100 µl

500 µl

TEST DEI MICRONUCLEI

• I micronuclei (MN), sono piccoli nuclei addizionali che si possono ritrovare nel

citoplasma di cellule in interfase, come risultato di danni genetici:

– disfunzioni del fuso mitotico (cromosomi interi che non vengono

incorporati nei nuclei principali delle cellule figlie);

– azione di agenti clastogeni (condensazione di frammenti cromosomici

acentrici).

Frammenti di cromosomi

Cromosoma intero

Agenti clastogeni

Agenti aneuploidizzanti

Monitoraggio ambientale: test in vitro su cellule umane Monitoraggio biologico: test su cellule umane prelevate da individui esposti (linfociti, cellule nasali e buccali)

Micronuclei

The results from the present study provide preliminary evidence that MN frequency in PBL is a predictive biomarker of cancer risk within a population of healthy subjects.

The current wide-spread use of the MN assay provides a valuable opportunity to apply this assay in the planning and validation of cancer surveillance and prevention programs.

Il test dei micronuclei nei linfociti è predittivo del rischio di cancro

Ames test + test dei micronuclei sufficienti per rilevare cancerogeni

Almost all of the 962 rodent carcinogens and in vivo genotoxins were

detected by an in vitro battery comprising Ames + MN in vitro.

Test della cometa

La metodica della microgel-elettroforesi su singole cellule (test della

“cometa”) consente una valutazione quantitativa del danno primario al DNA, conseguente ad un eventuale insulto genotossico, in maniera rapida e sensibile. I frammenti di DNA, il cui numero dipende dall’entità del danno,

risultano in grado di penetrare nelle maglie del gel e migrare verso l’anodo, dando origine a formazioni simili a “comete” la cui lunghezza della “coda” è direttamente proporzionale all’entità del danno.

[A]

Vetrino da microscopio pretrattato con NMA 1%

Strato di gel LMA 0,7% con incluse le cellule

Cellula inclusa nel gel di agarosio

Membrana cellulare

Citoplasma

Nucleo

Membrana nucleare

[B]

[C]

[D]

Lisi delle membrane

cellulari e nucleari

Idrolisi alcalina delle

proteine e dell’RNA;

“denaturazione” del DNA

Migrazione elettroforetica

dei frammenti di DNA

nelle maglie del gel

_ +

Lisi delle membrane [B] Denaturazione del DNA [C] Elettroforesi alcalina [D]

DANNO AL DNA: COMET TEST

Inclusione [A]

Osservazione al microscopio a fluorescenza e schermata al computer del danno al DNA

Head Length 21.97Tail % int ensity 18.53Tail Moment 3.16

Tail Length 47.60Total Area 639.36

Total Intensity 476477.11

Head % intensity 81.47Mean Grey Level 69.98

1 cell scored Image is f rozenx50 (Olio immersione)

Measure

Edi t

Live

Frozen

Dele te

DNA danneggiato

Danno al DNA

Correlazione tra alterazioni al DNA cellulare, mutazioni, tumori ed altre patologie croniche

Alterazioni al DNA

In cellule riproduttive

Mutazioni

Malformazioni congenite Malattie genetiche

In cellule non riproduttive

Morte cellulare Tumori Invecchiamento, malattie cardiache ecc.

Esempi di correlazioni tra mutagenesi e cancerogenesi

Cancerogeno Ames test

Aberrazioni o micronuclei in midollo osseo di topo

Composti organici

Aflatossine + +

4-Amminobifenile + +

Analgesici a base di fenacetina

+ +

Azatiopirina + +

Benzene - +

Benzidina + +

Betel miscelato a tabacco

+ +

1,4-Butanediolo dimetansulfonato (Myleran)

+ +

Ciclofosfamide + +

Clorambucile + +

Clornafazina + +

Tempi di esecuzione e costi TEST Tempi di

esecuzione

Costi

($,sett, 1983)

Cancerogenesi a lungo termine

2-3 anni 500.000

Test di Ames 2 giorni 900

Test citogenetici in vitro

30 ore 6500

Micronuclei in vitro 20-25 ore 4.400

Micronuclei in vivo

-

15.000

Relazione dose-risposta

GESTIONE DEL RISCHIO E DEFINIZIONE STANDARD DI QUALITA’

VALUTAZIONE DEL RISCHIO

Valutazione e gestione del rischio cancerogeno per l’uomo da esposizione a singoli composti chimici

Identificazione del pericolo (valutazione qualitativa)

Valutazione esposizione

MONITORAGGIO AMBIENTALE

MONIT. BIOLOGICO

Studi epidemiologici

test di mutagenesi a breve termine

Studi sperimentali su animali

COMUNICAZIONE DEL RISCHIO

STIMA DEL RISCHIO (valutazione quantitativa)

Valutazione dei rischi

Relazione dose-risposta

GESTIONE DEL RISCHIO E DEFINIZIONE STANDARD DI QUALITA’

VALUTAZIONE DEL RISCHIO

Valutazione e gestione del rischio cancerogeno per l’uomo da esposizione a singoli composti chimici

Identificazione del pericolo (valutazione qualitativa)

Valutazione esposizione

MONITORAGGIO AMBIENTALE

MONIT. BIOLOGICO

Studi epidemiologici

test di mutagenesi a breve termine

Studi sperimentali su animali

COMUNICAZIONE DEL RISCHIO

STIMA DEL RISCHIO (valutazione quantitativa)

http://www.epa.gov/iris/index.html

EPA’s Integrated Risk Information System (IRIS) is a database that contains the Agency’s science and science policy positions on chronic human health effects that could result from exposure to environment contaminants.

Stime dei rischi

By-products RfD

(mg/kg/die)

Canc.

EPA

Genotox

OSF

( g/kg/die)

Unit Risk*

(1 g/l)

Cloroformio 0,01 B2 -

Bromodiclorometano 0,02 B2 + 62 1,8 x 10-6

Bromoformio 0,02 B2 + 7,9 2,3 x 10-7

Dibromoclorometano 0,02 C + 84 2,4 x 10-6

Acido dicloroacetico ? B2 - ? ?

Idrato di cloralio 0,1 C + ? ?

Formaldeide 0,2 B1 + ? ?

Bromato 0,004 B2 + 700 2 x 10-5

Stima dei rischi cancerogeni per assunzione orale

http://www.epa.gov/iris/index.html

*il rischio per un individuo di 70 chili che beve ogni giorno per tutta la vita un litro di acqua contenente 1 g/l di sostanza

Stima dei rischi per inalazione di 1 μg/m3 (Inhalation Unit Risks per μg/m3 )

Relazione dose-risposta

GESTIONE DEL RISCHIO E DEFINIZIONE STANDARD DI QUALITA’

VALUTAZIONE DEL RISCHIO

Valutazione e gestione del rischio cancerogeno per l’uomo da esposizione a singoli composti chimici

Identificazione del pericolo (valutazione qualitativa)

Valutazione esposizione

MONITORAGGIO AMBIENTALE

MONIT. BIOLOGICO

Studi epidemiologici

test di mutagenesi a breve termine

Studi sperimentali su animali

COMUNICAZIONE DEL RISCHIO

STIMA DEL RISCHIO (valutazione quantitativa)

Accettabilità del rischio

EPA: rischio di 10-4-10-6

OMS: rischio di 10-5

Sostanza Class.

EPA

Unit

Risk

(per 1 µg/L)

USA

(µg/L)

OMS

(µg/L)

UE

(µg/L)

Benzene A 4,4.10-7 5 10 1

B(a)P B2 1,6.10-6

2,1.10-4

0,2 0,7 0,01

Cloruro di vinile A 2,1.10-5

4,2.10-5

2 5 0,5

1,2-Dicloroetano B2 2,6.10-6 5 - 3

Diclorometano B2 2,1.10-7 5 20 .

Contaminanti idrici cancerogeni: Standard e rischi

Sostanze organiche e inorganiche registrate

dal CAS (Chemical Abstracts Service)

http://www.cas.org/cgi-bin/cas/regreport.pl

Count: 39,563,328 organic and inorganic substances

(Date: April 30, 2010)

•

Sostanze organiche e inorganiche registrate

dal CAS (Chemical Abstracts Service)

http://www.cas.org/cgi-bin/cas/regreport.pl

Count: 63,717,828 organic and inorganic substances

(Date: April 30 2012)

•

Dati disponibili sulla tossicità di composti chimici ad elevata produzione in Europa

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Cancerogenicità

Genotossicità "in vivo"

Tossicità cutanea acuta

Tossicità cronica

Genotossicità/mutagenicità

Tossicità orale acuta

%•Accumulo nell’organismo:????

•Effetto cocktail: X1+X2 +…..Xn = ????

•Interazioni: X1+X2 +…..Alcol, Farmaci, Fumo = ????

Test di mutagenesi a breve termine

• Test di mutazione genica (batteri, lieviti, miceti, insetti, cellule di

mammifero, ecc.) • Test di mutazioni cromosomiche (mammiferi, insetti, piante, cellule di

mammifero, lieviti, miceti, ecc.) • Test di danno e riparazione del DNA (cellule di mammifero, lieviti, miceti,

mammiferi)

Applicazioni dei test di mutagenesi per lo studio dei singoli composti

• FARMACI

• PESTICIDI

• ADDITTIVI ALIMENTARI

• SINGOLI INQUINANTI

GUIDANCE FOR INDUSTRY S2B Genotoxicity

A Standard Battery for Genotoxicity Testing of Pharmaceuticals

International Committee for Harmonization http://www.fda.gov/cder/guidance/1856fnl.pdf

MUTAGENICITY TESTING REQUIREMENTS FOR BIOCIDES

Proposal EU, 2003 1. In vitro gene mutation study in bacteria 2. In vitro cytogenicity study in mammalian cells 3. In vitro gene mutation assay in mammalian cells 4. If positive in 1., 2. or 3., then an in vivo mutagenicity study will be required (bone marrow assay for chromosomal damage or a micronucleus test) 5. If negative in 4. but positive in vitro tests then undertake a second in-vivo study to examine whether mutagenicity or evidence of DNA damage can be demonstrated in tissue other than bone marrow 6. If positive in 4. then a test to assess possible germ cell effects may be required

PROPOSAL FOR RECOMMENDED MUTAGENICITY / GENOTOXICITY TESTS FOR THE SAFETY TESTING OF COSMETIC INGREDIENTS AND FOOD ADDITIVES

2003

http://europa.eu.int/comm/health/ph_risk/committees/sccp/documents/out253_en.pdf

La nuova legge europea REACH

www.steptoe.com/assets/attachments/Borissova_-_New_EU_Chemicals_Legislation.pdf

REACH è l’acronimo di Registrazione, Valutazione, Autorizzazione e Restrizione delle sostanze chimiche. Il Regolamento REACH è entrato in vigore il 1° giugno 2007 e ha l’obiettivo di razionalizzare e migliorare il precedente quadro legislativo in materia di sostanze chimiche dell'Unione europea (UE).

Schema generale per il monitoraggio dell’esposizione umana a sostanze mutageno/cancerogene

Determinazione degli

inquinanti

nell'ambiente

AMBIENTALE

Dose

interna

Dose

biologica

efficace

Induzione

enzimatica

Effetti biologici

precoci

Esposizione Effetto

Suscettibilità

genetica

individuale

Dosaggio di

biomarcatori

BIOLOGICO

MONITORAGGIO

Test di mutagenesi e genotossicità

Genotossici nell’ambiente di lavoro

Esempi di lavorazioni che comportano l’esposizione a sostanze cancerogene

Sedi o tipi di tumori

Asfaltatura Erogazione, deposito, trasporto carburanti Fusione ferro-acciaio Industria galvanica Lavorazione cuoio Lavorazione legno Lavori in miniera e gallerie Produzione della gomma Produzione di alluminio

Lavorazione Agenti cancerogeni

IPA, bitume, catrame Benzene, benzina IPA, cromati (VI) Cromati (VI), nebbie e vapori ac. inorg. Forti Polveri di cuoio Polveri di legno Silice, IPA, radon AA, IPA IPA, olii minerali

Polmoni, vie respiratorie, cute Leucemie Cute e polmoni Polmoni, laringe Cavità nasali Cavità nasali Polmoni e cute Vie urinarie, leucemie, cute, polmone Cute, polmone, tratto gastro-int

Sostanze potenzialmente cancerogene nell’acqua potabile (conc. massime

riscontrate)

Cloruro di vinile

3.4 Benzopirene

Dieldrin

HCH

Bis (2 cloro etil) etere

Clordano

3.4 Benzofluorantene

CTC

Penta cloro bifenile

PCB, Tetra cloro bifenile

Tri cloro bifenile

Benzofenone

Eptacloro

Cloroformio

Tri cloro etilene

Aldrin

Nitriti (precursori delle nitrosamine)

Atrazina

Endrin

Esaclorobenzene

Esaclorobutadiene

Esacloroetano

Di cloro 1.4 fenolo

Bromo dicloro metano

Bromoformio

Clorobenzene

Dibromo cloro metano

Dicloro 1,2 etano

Tetra cloro etano

10

0.005

8

0.02

0.42

0.1

0.444

10.10

3

1

0.01

366

0.5

0.1

30

5.1

0.08

0.19

0.19

4.4

0.5

116

92

5.6

100

6

0.11

Composti particolati Attività

Idrocarburi policiclici aromatici (IPA) C, M

Nitro-IPA C, M

Metalli pesanti (Cd, Cr, Ni, As, Pb) C, M

Amianto C

Fumi di diesel C,M

Perossiacetilnitrato (PAN) M

Composti volatili o gassosi

1,3 butadiene C, M

Benzene C, M

Formaldeide C, M

Acetaldeide M

Solventi clorurati C, M

Cloruro di vinile C, M

Biossido di azoto (NO2) M

Composti cancerogeni (C) e mutageni (M) presenti nella

fase particolata e nella fase gassosa dell’aria urbana

Difficoltà nella valutazione dei rischi

per esposizione a miscele complesse • Le conoscenze sulla cancerogenicità e la genotossicità dei

composti singoli sono ancora scarse

• L’uomo è esposto nell’ambiente a miscele molto complesse di composti chimici

• Non sono stati studiati i fenomeni di sinergismo tra composti diversi

• Le indagini chimico-analitiche ambientali sono importanti ma mostrano limitazioni e non ci danno un quadro approfondito della composizione delle miscele complesse ambientali

• Si avverte la necessità di test biotossicologici rapidi che possano fornire informazioni sulla attività biologiche delle miscele complesse in toto

Le matrici ambientali contengono spesso migliaia di inquinanti organici e inorganici, dei quali solo una piccola % è stata identificata mediante indagini chimico-analitiche: alcuni di questi sono cancerogeni e genotossici.

64

IPA Metalli pesanti

PAN

NO3-

SO4=

Test di genotossicità: -rapidi - poco costosi -correlati con la cancerogenesi -Analisi in toto e In situ

Test di cancerogenicità in vivo: -costosi - lunghi

Studi su miscele complesse

?

THM

xenobiota

Accumulo

Escrezione Biotrasformazione

Esposizione a miscele complesse ambientali

Dose esterna - quantità di xenobiotici presenti nell'ambiente che possono venire a contatto con l'organismo (monitoraggio ambientale) Dose interna - quantità totale di un composto chimico assorbita dall'organismo in un dato periodo di tempo (monitoraggio biologico)

Schema generale per il monitoraggio dell’esposizione

umana a miscele di inquinanti mutageno/cancerogeni

Determinazione degli

inquinanti

nell'ambiente

AMBIENTALE

Dose

interna

Dose

biologica

efficace

Induzione

enzimatica

Effetti biologici

precoci

Esposizione Effetto

Suscettibilità

genetica

individuale

Dosaggio di

biomarcatori

BIOLOGICO

MONITORAGGIO

Metodi analitici

Test di mutagenesi (miscele complesse)

MONITORAGGIO DI MISCELE AMBIENTALI COMPLESSE

ACQUA

Potabile, superficiale, reflua, minerale

ARIA -Aria urbana, emissioni di veicoli,

industrie, inceneritori

- Aria indoor

SUOLO Suoli contaminati da industrie, pesticidi

CIBI

Cessione di contenitori di plastica, contaminanti ambientali, pesticidi

Mutation Res Mutagenesis Environ. & Molecular Mutagenesis

POLVERI AEREE E SALUTE

Emissioni mobili Emissioni fisse

ESPOSIZIONE UMANA

GLOBALE

Polveri atmosferiche primarie

Polveri atmosferiche secondarie

REAZIONI CHIMICHE

Polveri

occupazionali Fumo di

tabacco

Polveri indoor

Fattori genetici e ambientali

EFFETTI TOSSICI 68

INQUINANTI nelle POLVERI

ATTIVITA’

Idrocarburi policiclici aromatici (IPA)

Nitro-IPA

Nitro-benzantrone

Metalli pesanti (Cd, Cr, Ni, As, Pb)

Amianto

Fumi di diesel

Perossiacetilnitrato (PAN)

C, G

C, G

C, G

C, M

C

C, G

G

INQUINANTI GASSOSI O VOLATILI ATTIVITA’

1,3-Butadiene

Benzene

Formaldeide

Acetaldeide

Solventi clorurati

Cloruro di vinile

Biossido di azoto (NO2)

C, G

C, G

C, G

G

C, G

C, G

G

Cancerogeni e genotossici aerei

69

• Le polveri urbane prelevate in numerose città in tutto il mondo sono quasi sempre mutagene e genotossiche, specie in inverno

• In futuro sarà necessario studiare anche gli inquinanti volatili e semi-volatili

70

Campionatore ad alto volume per PM-10

Ricerche sulle polveri urbane

frazionate

71

< 0,5 m

0,5-0,95 m

0,95-1,5 m

1,5-3 m

3-7,2 m

7,2-10 m

FRAZIONI

DEL

PM-10

72

0

20

40

60

80

100

Frazioni del PM10 raccolte in 3 campionamenti dell’aria

di Brescia

1° campionamento

2° campionamento

3° campionamento

73

0

2

4

6

8

10

12,4

2,5

1,1 1,31,2

0,9 1,11,6

1,11 1

3,8

7,4

9,6

1,4 2 2,7

MUTAGENICITÀ DEL PARTICOLATO URBANO

MEDIANTE TEST SU SALMONELLA

Mutagenicità

< 0.5 m

0.5-10 m Particolato non

frazionato

74

Mutagenicità (revertenti/m3)

79,2%(7.6)

20,8%(2.0)

0

50

100

< 0.5 µm 0.5-10 µm

%

Benzo(a)pirene (ng/m3)

92,3 %(1,8)

7,7 %(0,15)

0

50

100

< 0.5 µm 0.5-10 µm

%

Mutagenicità e benzo(a)pirene nel PM10

dell’aria di Brescia

75

Tossicità delle polveri fini e ultrafini

• Si comportano come i gas: – Penetrano dall’esterno in casa

– Penetrano in profondità nei polmoni

- Possono entrare nella circolazione e spostarsi

dal polmone ad altri organi - Possono iniziare danni ossidativi

• Mostrano una superficie molto ampia

• Adsorbono composti tossici (prodotti di combustione, metalli, ecc.)

• Sono associati a morte prematura, malattie respiratorie, malattie cardiovascolari e cancro

76

(Sorensen et al., 2003, Mutation Research 544 (2-3))

Meccanismi cellulari della tossicità delle polveri ultra-fini

77 Ischemia CANCRO

• Le polveri urbane prelevate in numerose città in tutto il mondo sono quasi sempre mutagene e genotossiche, specie in inverno

• In futuro sarà necessario studiare anche gli inquinanti volatili e semi-volatili 78

Monitoraggio dei mutageni volatili con le piante:

il Tradescantia/micronuclei test

Ibrido di Tradescantia 79

Esposizione in situ

Inquinanti aerei

volatili, gas,

nanoparticelle (?)

Tetrade

normale

Tradescantia clone #4430 Tetrade con

Micronuclei

Esposizione in situ di piante

80

81

0.00

0.00

0.00

0.00

0.00

0.00

0.00

0.00

Galleria PG Galleria BS

controllo

1 ore

24 ore

Mutageni volatili in 2 gallerie con differente traffico

Test di genotossicità su piante esposte all’aria di Perugia

TEST DELLA COMETA SU TABACCO Danno primario al DNA

Alterazioni citogenetiche

TEST DEL MICRONUCLEO su TRADESCANTIA

82

83

POLVERI AEREE E SALUTE

Emissioni mobili Emissioni fisse

ESPOSIZIONE UMANA

GLOBALE

Polveri atmosferiche primarie

Polveri atmosferiche secondarie

REAZIONI CHIMICHE

Polveri

occupazionali Fumo di

tabacco

Polveri indoor

Fattori genetici e ambientali

EFFETTI TOSSICI 84

LE POLVERI INDOOR

85

FUMO PASSIVO vs FUMO ATTIVO:

Le polveri sono più fini e più mutagene

Le polveri sono

Parametro Fumo attivo Fumo passivo

Durata prod. fumo/sig 20 sec. 550 sec.

Tabacco bruciato 347 sec. 411 mg

Temperatura max 900°C 600°C

pH 5,8-6,1 6,9-8

Diametro particelle µm 0,1-1,0 0,01-0,1

No. Particelle 1x 1012 3,5x1012

Mutagenicità +++ +++++

Cancerogeni +++ +++++ 86

Un “nuovo” rischio:

il fumo di “terza mano”

• CHE COS’E’: Composti chimici presenti nel fumo che rimangono anche quando la sigaretta viene spenta e che reagiscono per formare nuovi cancerogeni (es. nitrosamine).

• Il fumo rimane intrappolato nei capelli, su pelle, abiti, tappeti, mobili, pareti e giocattoli.

www.lung.ca/protect-protegez/tobacco-tabagisme/second-secondaire/thirdhand-tertiaire_e.php 87

Fumo di terza mano e i bambini

• Il fumo di terza mano è presente anche nella polvere di casa che i bambini ingoiano quando mettono le mani in bocca: ne ingoiano 20 volte di più degli adulti.

MUTAGENICITA’ DELLE EMISSIONI

DI FORNELLI A GAS METANO

89

Fornello vecchio

90

X 4 volte

X 2 volte

Fornello nuovo

RISULTATI • Mutagenicità delle emissioni gassose

delle cucine:

•Molto elevata nella cucina vecchia

•Elevata nella cucina nuova

• Presenza di polveri fini (<0.5 m) e

tracce di IPA cancerogeni

• Mutagenicità delle polveri fini ++ 91

Fonti di mutageni nelle acque potabili

Acque superficiali

Acqua sotterranea

Disinfezione Rete idrica

•Disinfettanti •Sostanze naturali

Cessione da serbatoi e condotte

•Scarichi industriali • Rifiuti liquidi •Rifiuti solidi

•Sostanze naturali •Pesticidi •Rifiuti industriali •Rifiuti solidi

By-products che si formano durante la

clorazione

- 1974: scoperta del

cloroformio nelle

acque clorate

Ch

imic

a an

alit

ica

Mu

tage

nes

i

Studio della mutagenicità nelle acque potabili V

olatili

No

n vo

latili

DISINFETTANTE + PRECURSORI (NOM, Br-, ecc.)

BY-PRODUCTS (mutageni/cancerogeni)

Cancro

E’ stata dimostrata una correlazione tra mutagenicità dell’acqua potabile clorata e mortalità per cancro (Ijsselmuiden et al., 1992; Koivusalo et al., 1994-1995; Schenck et al., 1998; Tao et al, 1999)

Mutagenicità

Tipo di acqua Tipo di trattamento Prima del

trattamento

Dopo il

trattamento

Lago Trasimeno NaClO +

Fiume Arno NaClO +

Lago di Como NaClO ++ +++

Lago di Como O3 ++

Lago di Garda NaClO + ++

Lago di Garda O3 + ClO2 +

Fiume Ohio (USA) GAC ++

Effetti dei trattamenti di acque superficiali sulla presenza di sostanze mutagene

Cessione da bottiglie in

Polietilentereftalato (PET)

mutageno

Cessione di mutageni dal PET nelle acque

minerali

Tempo stoccaggio/Luce

Acqua testata mutagena

(litri/piastra)

1 mese /luce 2 (++)

1 mese/buio 4 (+)

3 mesi/luce-buio -

Test di Ames

RISULTATI • Aumento di micronuclei in Tradescantia solo in acqua

minerale naturale stoccata per 2 mesi.

• Danno al DNA su leucociti in molti campioni di acqua (0,5 litri/test).

• Acqua di sorgente sempre negativa; aumento danno al DNA nell’acqua distribuita (tubature?)

• Analisi chimiche (GC/MS) hanno mostrato la presenza di un plasticizzante il di(2-ethylhexyl)phthalate, cancerogeno

epatico, interferente endocrino,

dopo 9 mesi di stoccaggio.

DEHP

Considerazioni finali

• Il monitoraggio ambientale di inquinanti mutageni è di particolare importanza per la prevenzione dei rischi cancerogeni, soprattutto per studiare miscele ambientali complesse a cui sono esposti milioni di persone quotidianamente

PROSPETTIVE • Sviluppo di modelli di monitoraggio ambientale

attraverso metodologie di studio integrate: analisi chimiche, ecotossicologiche e genotossicologiche

• Sviluppo di nuovi biomarker per il monitoraggio biologico di individui esposti

EPIDEMIOLOGIA MOLECOLARE

Epidemiologia classica • Limiti degli studi di epidemiologia classica:

– si limitano a studiare il nesso causale tra una determinata esposizione e l’insorgenza di una malattia,

– spesso la stima dell’esposizione è affidata alle risposte di un questionario (ed è quindi difficile verificarne la veridicità)

– i risultati ottenuti non tengono conto della interazione tra esposizione a genotossici e suscettibilità genetica dell’ospite

Esposizione

esternacancroEsposizione

esternacancro

Cosa è l’epidemiologia molecolare

Perera e Weinstein (1982) hanno suggerito di valutare end-points alternativi (dosabili con tecniche di biologia molecolare) al dato clinico in

grado di fornire informazioni sul livello di esposizione, sull'effetto biologico e sulla suscettibilità individuale dei soggetti esposti a presunti

agenti genotossici

L'impostazione di uno studio di epidemiologia molecolare non è dissimile da quella di uno studio di epidemiologia analitica, i due approcci variano solo

in relazione agli end-points ricercati

Epidemiologia tradizionale

Epidemiologia molecolare

Diagnosi di malattia Biomarcatori End-points

APPROCCIO MOLECOLARE: APPLICAZIONI NELL’EPIDEMIOLOGIA

DELLE MALATTIE INFETTIVE

Sorveglianza epidemiologica - controllo delle malattie emergenti e ri-emergenti • Caratterizzazione, Rilevamento, Diagnosi • Sorveglianza di eventi epidemici • Sorveglianza al fine di valutare i programmi di intervento

Epidemiologia molecolare • Ricerca delle origini • Studio dell’ecologia dell’agente infettivo • Studio delle vie di trasmissione e dell’interazione ospite/agente

L’epidemiologia molecolare L’epidemiologia molecolare è un nuovo campo dell’epidemiologia che studia

la comparsa di alterazioni molecolari, subcellulari e cellulari che si verificano prima dell’insorgere di una patologia

Il principale campo d’azione dell’epidemiologia molecolare sono le MALATTIE CRONICO-DEGENERATIVE ed in particolare

le MALATTIE NEOPLASTICHE

Il controllo dei TUMORI è reso difficile dalla loro natura MULTIFATTORIALE, con l’evoluzione verso la malattia condizionata da

esposizioni multiple e ripetute a fattori di rischio e con una PATOGENESI tipicamente MULTISTADI

La PATOLOGIA TUMORALE MANIFESTA è rappresentabile come la parte emersa, visibile di un iceberg

La parte visibile dell’iceberg è

l’oggetto di studio

dell’EPIDEMIOLOGIA

TRADIZIONALE (morbosità o

mortalità per determinate

malattie)

La parte invisibile è oggetto di

studio della EPIDEMIOLOGIA

MOLECOLARE

Fenomeno “iceberg”

Cosa è l’epidemiologia molecolare

L'epidemiologia analitica tradizionale si propone di stabilire eventuali associazioni tra esposizione a fattori di rischio ed insorgenza di patologie

Le indagini di epidemiologia tradizionale: non consentono di indagare all'interno della "scatola nera” non permettono di caratterizzare le popolazioni in base alle variazioni interindividuali di suscettibilità ai composti genotossici

ESPOSIZIONE:Idrocarburi policiclici aromatici(es. fumo di tabaccoinquinamento atmosferico, etc.)

MALATTIA:Carcinoma polmonare

(Meccanismo d’azione?)

Progressione verso la malattia

xenobiota

Accumulo

Escrezione Biotrasformazione

Esposizione a xenobiotici

Dose esterna - quantità di xenobiotici presenti nell'ambiente che possono venire a contatto con l'organismo (monitoraggio ambientale) Dose interna - quantità totale di un composto chimico assorbita dall'organismo in un dato periodo di tempo (monitoraggio biologico)

Xenobiotico

Metabolita intermedio

Escrezione

Metabolita solubile in acqua

Può essere una specie

reattiva

Può accumularsi nei

tessuti

Fase I

attivazione

Fase II

Coniugazione

Biotrasformazione

Non-polare

Polare

Solu

bili

ty in w

ate

r

Doseinterna

Dosebiologicaefficace

Esposiz. Manifestaz.clinica

Effettibiologiciprecoci

Alteraz.strutturafunzione

Progressione verso la malattia

Markers di esposizione

Markers disuscettibilità individuale

Markers clinici

ESPOSIZIONE MALATTIA

Classificazione di biomarcatori

1) biomarcatori di esposizione 2) biomarcatori di effetto 3) biomarcatori di suscettibilità genetica individuale

Evento (biochimico, molecolare, genetico, immunologico o fisiologico) misurabile in un sistema biologico, che possa essere considerato come

parte di un continuum tra un evento iniziale (generalmente un'esposizione a genotossici) ed il risultante stato patologico (es.

neoplasia)

Un biomarcatore • non è un test diagnostico • è un indicatore di un'alterazione che potrebbe risultare completamente

reversibile o che potrebbe evolversi in manifestazione clinica • deve essere correlato all'end-point clinico • deve essere sensibile anche a basse dosi di esposizione • deve essere possibilmente specifico • non deve richiedere indagini invasive

Biomarcatore

Biomarcatori di esposizione

Permettono di valutare se un individuo è stato esposto a genotossici e di determinarne l'entità dell'esposizione

Suddivisi in: • biomarcatori di dose interna - stimano l'entità dell'esposizione ad un dato

composto misurando la concentrazione dello xenobiotico stesso e/o dei suoi metaboliti nei fluidi biologici (ad es. mutagenesi urinaria,tioeteri urinari, ecc.);

• biomarcatori di dose biologica efficace - valutano l'entità delle alterazioni reversibili causate dall'esposizione a genotossici (ad es. danno primario al DNA, addotti al DNA ed alle proteine, ecc.);

• biomarcatori di effetti biologici precoci - valutano alterazioni al genoma (aberrazioni cromosomiche, scambi tra cromatidi fratelli, micronuclei)

Misurazioni dose interna

q/tà assorbita

q/tà rilasciata nei tessuti

nelle cellule

nelle

macromolecole

nei siti

critici

Biomarcatori di esposizione

Incr

em

ent

o del le

gam

e t

ra

asso

rbim

ent

o ed e

ffett

i su

lla

salu

te

Relazione

con l’esposizione

este

rna

DOSE BIOLOGICA EFFICACE

Biomarcatori di esposizione - dose interna -

Aspecifici

Mutagenesi urinaria

Tioeteri urinari

Specifici

Esposizione Tecnica Biomarcatore

IPA HPLC 1-OH-pirene

Cromo VI Assorbimento atomico Cr urinario

Aflatossina B1 HPLC Metaboliti urinari AF(P)1 ecc

Fumo di tabacco Cotinina HPLC

Urine di fumatori

Biomarcatori di esposizione - dose biologica efficace -

Addotti al DNA: sono soggetti a riparo del danno

Addotti alle proteine: (emoglobina albumina) non sono soggetti al riparo

Comet test

Head Length 21.97Tail % intensity 18.53Tail Moment 3.16

Tail Length 47.60Total Area 639.36

Total Intensity 476477.11

Head % intensity 81.47Mean Grey Level 69.98

1 cell scored Image is frozenx50 (Olio immersione)

Measure

Edit

Live

Frozen

Delete

È un metodo rapido e sensibile per la valutazione quantitativa del danno primario al DNA inteso come rotture dirette dello scheletro fosfodiesterico o

lesioni della molecola convertibili in rotture, che interessino il singolo o il doppio filamento del DNA

(single- e double-strand breaks).

Campo al microscopio a fluorescenza e schermata rappresentativa ottenuta nella valutazione del danno al DNA con il sistema computerizzato di analisi di immagini

Biomarcatori di esposizione - effetti biologici precoci -

Aberrazioni cromosomiche: risultano dalla rottura e dal riarrangiamento dei cromosomi

SCE Micronuclei

Schema generale del metabolismo degli xenobiotici

Sostanza

esogena

Derivato

idrosolubile

Metabolita attivato

Fase I

funzionalizzazione Fase II

coniugazione

Fase II

coniugazione

Permettono di evidenziare se un singolo individuo è particolarmente sensibile all'azione di uno specifico xenobiotico o di una classe di

xenobiotici

Lo stesso livello espositivo a genotossici non è necessariamente correlato, nei singoli soggetti, con lo stesso grado di rischio, e ciò in relazione al

polimorfismo genetico di alcune attività enzimatiche di Fase I , di Fase II e di riparo del DNA

Attività enzimatiche di Fase I (Esempi) polimorfismi genetici del citocromo P450 aldeide deidrogenasi diidropirimidina deidrogenasi Attività enzimatiche di Fase II (Esempi) glutatione S-transferasi N-acetiltransferasi

Biomarcatori di suscettibilità

Biomarcatori di suscettibilità

I geni biomarcatori di suscettibilità possono essere:

• molto diffusi nella popolazione • scarsamente correlati all’evento clinico (penetranza bassa) • geni che codificano per la produzione di enzimi del metabolismo delle

sostanze cancerogene OPPURE • poco diffusi nella popolazione • altamente correlati all’evento clinico (penetranza elevata) • geni deputati al controllo del differenziamento, del ciclo cellulare e del

riparo del DNA

Biomarcatori di suscettibilità -PCR -

Lo studio dei loci genetici codificanti per attività enzimatiche di Fase I e di Fase II possono essere realizzati mediante PCR su qualsiasi tessuto biologico

senza esporre il soggetto ad alcuna indagine invasiva

Biomarcatori di suscettibilità

Polimorfismi del citocromo P450

I citocromo P450 sono enzimi codificati da geni della superfamiglia CYP che catalizzano l'inserzione di un atomo di ossigeno molecolare nel substrato Il sequenziamento del genoma umano ha rivelato la presenza di 58 geni diversi che codificano per i citocromo P450, ma solo le famiglie CYP1, CYP2 e CYP3 sono quelle maggiormente coinvolte nel metabolismo degli xenobiotici. CYP1A1, il cui prodotto genico è un enzima chiave nel metabolismo di numerosi cancerogeni aromatici, presenta il gene nella sua forma selvaggia (CYP1A1*1A) e 2 polimorfismi denominati CYP1A1*2A e CYP1A1*2C. In entrambi i casi la mutazione comporta un aumento dell'attività dell'enzima

Biomarcatori di suscettibilità

Polimorfismi delle GST

La famiglia delle GSTs è costituita da un gruppo di enzimi dimerici ad azione detossificante ( coniugazione di molecole elettrofile con il glutatione ridotto). Nel citosol umano sono state identificate 5 classi di GSTs Entro la classe µ esistono almeno 5 geni che codificano per altrettanti isoenzimi (GSTM1, M2, M3, M4, M5) ed il gene che codifica l'isoforma GSTM1 è polimorfico. Il gene polimorfico può presentarsi con completa delezione di un allele dando origine, in omozigosi, al genotipo nullo (GSTM1-nullo). Tale configurazione genica determina una diminuita produzione di glutatione-S-transferasi.

Polimorfismi delle NAT (N-acetiltransferasi)

L’enzima trasferisce un gruppo acetilico ad arilammine ed idrazine

NAT1 - 19 differenti polimorfismi

NAT2 - 24 differenti polimorfismi

L’acetilazione detossifica:

NAT1 mutato - acetilatori rapidi

NAT2 mutato - acetilatori lenti (+ rischio)

Biomarcatori di suscettibilità

Polimorfismi e tumori alla vescica

Song et al., Carcinogenesis 22 : 11 - 16, 2001

Fumo e tumore al polmone

Effetti del metabolismo del CYP1A1

Studio caso-controllo - valori di OR -

Sigarette fumate/anno CYP1A1*1A Gene selvaggio

Non fumatori 3.2 1.0

Fumatori < 20 pacchetti/anno > 20 pacchetti/anno

3.6 11.4

2.6 4.2

Genotipi metabolici - sinergie sfavorevoli presenti nella

popolazione generale - • Un soggetto GSTM1 nullo possiede un RR di sviluppare cancro pari a 1.5

rispetto a soggetti GSTM1+

• Un soggetto con genotipo CYP1A1 mutato possiede un RR di sviluppare cancro compreso tra 1.2 e 1.9 rispetto a soggetti genotipo CYP1A1 selvaggio

•Un soggetto che presenta ambedue i polimorfismi sfavorevoli ha un RR di sviluppare cancro alla vescica pari a 6.8

SUGGERIRE ALLA POPOLAZIONE CORRETTI STILI DI VITA

MONITORAGGIO BIOLOGICI IN AMBIENTI DI LAVORO:

ESPOSIZIONE OCCUPAZIONALE A CAMPI MAGNETICI A BASSISSIMA FREQUENZA (50

HZ): EFFETTI CITOGENETICI IN SALDATORI

CAMPO MAGNETICO ELF: CANCEROGENICITA’

Gruppo 1 Cancerogeno accertato per l’uomo.

Vi è sufficiente evidenza di cancerogenicità nell’uomo in studi epidemiologici adeguati.

Gruppo 2A Probabile cancerogeno per l’uomo.

Evidenza limitata nell’uomo ed evidenza sufficiente negli animali da esperimento.

Gruppo 2B Possibile cancerogeno per l’uomo.

Evidenza limitata nell’uomo e evidenza non del tutto sufficiente negli animali da esperimento.

Gruppo 3 Non classificabile come cancerogeno per l’uomo

Tutto ciò che non rientra nei gruppi precedenti.

RISULTATI: TEST DEL MICRONUCLEO

• Valori medi della frequenza dei Micronuclei e dell’Indice Mitotico:

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1IM

esposti controlli

0

2

4

6

8

10

1

MN

/1000ce

ll b

inucl

eate

esposti controlli

Micronuclei Indice Mitotico

* *

RISULTATI: TEST DEL MICRONUCLEO

• Valori medi della frequenza dei Micronuclei e dell’Indice Mitotico per classi di età:

0

2

4

6

8

10

< 40 anni > 40 anni

MN

/1000cell b

inucle

ate

esposti controlli

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

< 40 anni > 40 anni

IM

esposti controlli

Micronuclei Indice Mitotico

ESPOSIZIONE OCCUPAZIONALE AD ANTIBLASTICI

PREPARAZIONE

MANIPOLAZIONE

EVENTI ACCIDENTALI

BONIFICA

SMALTIMENTO

SOMMINISTRAZIONE

SCOPO DELLA RICERCA

Biomarcatore

Esposiz. Dose

interna

Dose biologica efficace

Effetti biologici precoci

Suscett. genetica

individuale

Superfici Urine PBL PBL PBL

Farmaci Farmaci Danno al

DNA Alterazioni cromos.

Polimorf. genetici

CP 5-FU

CP 5-FU

Test della cometa

MN AC

GSTM1

Linee Guida

RISULTATI – MICRONUCLEI e ABERRAZIONI CROMOSOMICHE

Popolazione totale - Esposti vs. controlli:

aumento statisticamente significativo della frequenza di micronuclei e di aberrazioni cromosomiche nei soggetti professionalmente esposti a chemioterapici antiblastici

CONTROLS EXPOSED

0,00

2,00

4,00

6,00

MIC

RO

NU

CL

EI

P .0= 0 01

CONTROLS EXPOSED

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

0,40

%T

OTA

LA

BE

RR

AT

ION

S

P< 0.001

RISULTATI MN e AC Esposti (anzianità di mansione) - < 10 anni vs. > 10 anni:

effetti genotossici significativamente più elevati nei soggetti esposti con maggiore anzianità di mansione

<10 > 10

Years of exposure

2,00

4,00

6,00

8,00

MIC

RO

NU

CL

EI

(* )

<10 > 10

Years of exposure

0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

%T

OTA

LA

BE

RR

AT

ION

S

(* )

DISCUSSIONE I risultati ottenuti suggeriscono:

le misure di protezione individuali e collettive adottate dagli operatori sanitari sono inadeguate per prevenire effetti biologici indesiderati di tipo genotossico;

le procedure chimico-analitiche previste dalle attuali Linee Guida per la valutazione dell’esposizione non restituiscono informazioni adeguate riguardo l’impatto dell’esposizione sulla salute dei lavoratori.

???

CONCLUSIONI generali L’uso di biomarker di epidemiologia molecolare può dare utili

informazioni su:

Etiologia dei tumori:

benzene, addotti e aberrazioni cromosomiche e leucemia

fumo di sigaretta e cancro polmonare

Valutazione dei rischi cancerogeni

Dal 1997 la IARC ha utilizzato prove meccanicistiche (bioindicatori animali o umani) per spostare la classificazione dei cancerogeni. Es. ossido di etilene e diossina da 2A a 1 (cancerogeno umano).

Valutazione di interventi preventivi

riduzione di livelli di inquinamento ambientale

interventi di chemioprevenzione

Il futuro della cancerogenesi professionale

Integrazione tra monitoraggio ambientale monitoraggio biologico

Integrazione immediata dei controlli tradizionali con bioindicatori predittivi (micronuclei, addotti, Comet test)

Integrazione futura dei bioindicatori attuali con nuovi biondicatori epigenetici e con nuove “omic technologies”:

- Proteomica

- Metabonomica

- Epigenomica