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Università degli Studi di Perugia
Dipartimento di Specialità Medico-chirurgiche
e Sanità Pubblica
Cancerogenesi, mutagenesi ambientale e epidemiologia molecolare
Prof. Silvano Monarca
Indice
GENERALITA’
• Valutazione dei rischi cancerogeni per composti singoli
• Mutagenicità e cancerogenicità
• Miscele complesse ambientali
• Monitoraggio ambientale dei rischi mutageno/cancerogeni
• Applicazioni
• Epidemiologia molecolare
• Monitoraggio biologico dei rischi cancerogeni
• Considerazioni finali
Valutazione dei rischi cancerogeni per composti singoli
Rischio & pericolo
Rischio = Esposizione X Pericolo
PERICOLO (hazard): Presenza di un qualsiasi agente biologico, chimico o fisico che può nuocere alla salute RISCHIO (risk) : Stima della probabilità che un rischio si verifichi
Relazione dose-risposta
GESTIONE DEL RISCHIO E DEFINIZIONE STANDARD DI QUALITA’
VALUTAZIONE DEL RISCHIO
Valutazione e gestione del rischio cancerogeno per l’uomo
da esposizione a singoli composti chimici
Identificazione del pericolo (valutazione qualitativa)
Valutazione esposizione
MONITORAGGIO AMBIENTALE
MONIT. BIOLOGICO
Studi epidemiologici
test di mutagenesi a breve termine
Studi sperimentali su animali
COMUNICAZIONE DEL RISCHIO
STIMA DEL RISCHIO (valutazione quantitativa)
Valutazione della cancerogenicità e della genotossicità di inquinanti ambientali
6
+++
++
cancerogenicità
genotossicità
+++++
A
B1
B2 C
Classificazione cancerogenicità (EPA)
www.epa.gov
Classificazione cancerogenicità (IARC) www.iarc.fr
1 2A 2B
Cellulanormale
Cellulainiziata
Periodo di latenza
~1 giorno ~12.775 giorni(~35 anni)
Lesionepreneoplastica
Tumoremaligno
Cancroclinico
Radiazioni
Espansioneclonaleselettiva
Mutazionegenica
Mutazionegenica
Esposizione
Compostichimici
PromozioneIniziazione
Virus
PROCESSO DELLA CANCEROGENESI
•Attivazione di proto-oncogeni •Disattivazione di onco-soppressori •Inattivazione di geni anti-metastasi
ESTRAPOLAZIONEALLE BASSE DOSIDI ESPOSIZIONE
ESTRAPOLAZIONE DI CURVE DOSE-RISPOSTA
CANCEROGENI GENOTOSSIC
I
DATI SPERIMENTALIED EPIDEMIOLOGICI
DOSE SOGLIA
DOSE
RIS
PO
STA
NON CANCEROGENI
Agenti terapeutici e diagnostici cancerogeni
Mutagenesi, genotossicità e cancro
Mutageni e Mutagenesi ambientale
• Mutageni fisici: • Ricerche sull’effetto mutageno dei raggi X:
Muller, 1927 • Mutageni chimici: • Gas mostarda in Drosophila: Auerbach, 1946
La mutagenesi ambientale puo’ essere definita come la ricerca, l’identificazione e la caratterizzazione di agenti ambientali chimici e fisici capaci di produrre mutazioni in vari organismi animali e vegetali e nell’uomo.
I mutageni sono agenti capaci di aumentare la frequenza delle mutazioni
Genotossicità “Genotossicità” è un termine operativo più ampio e
comprende, oltre alle mutazioni, effetti diversi sul materiale genetico, quali:
• danni al DNA come rotture a singola o doppia elica
• addotti al DNA • sintesi non programmata del DNA (UDS,
unscheduled DNA synthesis) • scambi tra cromatidi fratelli (SCE, sister-
chromatid exchanges) • ricombinazione mitotica (crossing-over e
conversione genica).
I test di mutagenesi
• Il termine “mutagenesi” o “mutagenicità” si riferisce all’induzione di cambiamenti permanenti trasmissibili nella “quantità” o “struttura” del materiale genetico di cellule od organismi, a livello somatico o germinale. Questi cambiamenti possono avvenire:
• a livello genico (mutazioni geniche) • a livello cromosomico (mutazioni o
aberrazioni cromosomiche strutturali) • a livello genomico (mutazioni o aberrazioni
cromosomiche numeriche, quali aneuploidia e poliploidia).
Mutagenicità e genotossicità
• E’ importante per: • l’identificazione e la caratterizzazione della
pericolosità delle sostanze (hazard identification and characterization)
• la stima dei rischi cancerogeni (cancer risk assessment) in sistemi biologici o nell’uomo
• lo studio dei meccanismi di cancerogenesi • la estrapolazione da alte a basse dosi • la estrapolazione dei dati da animali all’uomo
Sistemi biologici utilizzati nei vari test di mutagenesi
Sito di attacco per i mutageni e per molti
cancerogeni
Interazioni con il DNA con agenti fisici o chimici
MUTAZIONI GENICHE
Puntiformi (sostituzione di uno o più coppie di nucleotidi) •Inserzioni e delezioni intrageniche
MUTAZIONI CROMOSOMICHE
•Delezioni (perdita di segmenti di cromosoma) •Inversioni (corredo genetico invariato) •Inserzioni e duplicazioni (acquisizione di materiale genetico) •Traslocazioni (acquisizione e/o perdita di materiale genetico)
MUTAZIONI GENOMICHE
•Monosomie (perdita di cromosomi interi) •Trisomie o polisomie (acquisizione di uno o pochi cromosomi in soprannumero) •Poliploidie (ripetizioni di un numero intero di genomi)
TEST DI AMES
• Test rapido di screening per la rilevazione di mutazioni puntiformi
• Batteri tester: ceppi di Salmonella typhimurium geneticamente
modificati (TA98 e TA100)
• L’azione dei mutageni sul DNA dei batteri determina un aumento
del numero di colonie retromutate
His -
His +
HIS G C
HIS A T
Retromutazione
Agente mutageno
.
• • • • • • • • •
• • • •
•
• • •
• • • • • •
•
Colonie batteriche
retromutate
Dosi crescenti del campioneNumero crescente di revertenti
Salmonella typhimurium Ceppo: TA98, TA100, ...(Coltura "over-night")
(a) (b) (c)
Campioni da saggiare.(A) (b) (c) Matrici ambiental.
Sostanze pure;Matrici biologiche;
Sistema di attivazionemetabolica ("S9-mix")
Agar-molle(2 ml)
Terreno minimo:-Glucosio- Sali minerali
37°C per 48 h
Dosi scalari100 µl
500 µl
TEST DEI MICRONUCLEI
• I micronuclei (MN), sono piccoli nuclei addizionali che si possono ritrovare nel
citoplasma di cellule in interfase, come risultato di danni genetici:
– disfunzioni del fuso mitotico (cromosomi interi che non vengono
incorporati nei nuclei principali delle cellule figlie);
– azione di agenti clastogeni (condensazione di frammenti cromosomici
acentrici).
Frammenti di cromosomi
Cromosoma intero
Agenti clastogeni
Agenti aneuploidizzanti
Monitoraggio ambientale: test in vitro su cellule umane Monitoraggio biologico: test su cellule umane prelevate da individui esposti (linfociti, cellule nasali e buccali)
Micronuclei
The results from the present study provide preliminary evidence that MN frequency in PBL is a predictive biomarker of cancer risk within a population of healthy subjects.
The current wide-spread use of the MN assay provides a valuable opportunity to apply this assay in the planning and validation of cancer surveillance and prevention programs.
Il test dei micronuclei nei linfociti è predittivo del rischio di cancro
Ames test + test dei micronuclei sufficienti per rilevare cancerogeni
Almost all of the 962 rodent carcinogens and in vivo genotoxins were
detected by an in vitro battery comprising Ames + MN in vitro.
Test della cometa
La metodica della microgel-elettroforesi su singole cellule (test della
“cometa”) consente una valutazione quantitativa del danno primario al DNA, conseguente ad un eventuale insulto genotossico, in maniera rapida e sensibile. I frammenti di DNA, il cui numero dipende dall’entità del danno,
risultano in grado di penetrare nelle maglie del gel e migrare verso l’anodo, dando origine a formazioni simili a “comete” la cui lunghezza della “coda” è direttamente proporzionale all’entità del danno.
[A]
Vetrino da microscopio pretrattato con NMA 1%
Strato di gel LMA 0,7% con incluse le cellule
Cellula inclusa nel gel di agarosio
Membrana cellulare
Citoplasma
Nucleo
Membrana nucleare
[B]
[C]
[D]
Lisi delle membrane
cellulari e nucleari
Idrolisi alcalina delle
proteine e dell’RNA;
“denaturazione” del DNA
Migrazione elettroforetica
dei frammenti di DNA
nelle maglie del gel
_ +
Lisi delle membrane [B] Denaturazione del DNA [C] Elettroforesi alcalina [D]
DANNO AL DNA: COMET TEST
Inclusione [A]
Osservazione al microscopio a fluorescenza e schermata al computer del danno al DNA
Head Length 21.97Tail % int ensity 18.53Tail Moment 3.16
Tail Length 47.60Total Area 639.36
Total Intensity 476477.11
Head % intensity 81.47Mean Grey Level 69.98
1 cell scored Image is f rozenx50 (Olio immersione)
Measure
Edi t
Live
Frozen
Dele te
DNA danneggiato
Danno al DNA
Correlazione tra alterazioni al DNA cellulare, mutazioni, tumori ed altre patologie croniche
Alterazioni al DNA
In cellule riproduttive
Mutazioni
Malformazioni congenite Malattie genetiche
In cellule non riproduttive
Morte cellulare Tumori Invecchiamento, malattie cardiache ecc.
Esempi di correlazioni tra mutagenesi e cancerogenesi
Cancerogeno Ames test
Aberrazioni o micronuclei in midollo osseo di topo
Composti organici
Aflatossine + +
4-Amminobifenile + +
Analgesici a base di fenacetina
+ +
Azatiopirina + +
Benzene - +
Benzidina + +
Betel miscelato a tabacco
+ +
1,4-Butanediolo dimetansulfonato (Myleran)
+ +
Ciclofosfamide + +
Clorambucile + +
Clornafazina + +
Tempi di esecuzione e costi TEST Tempi di
esecuzione
Costi
($,sett, 1983)
Cancerogenesi a lungo termine
2-3 anni 500.000
Test di Ames 2 giorni 900
Test citogenetici in vitro
30 ore 6500
Micronuclei in vitro 20-25 ore 4.400
Micronuclei in vivo
-
15.000
Relazione dose-risposta
GESTIONE DEL RISCHIO E DEFINIZIONE STANDARD DI QUALITA’
VALUTAZIONE DEL RISCHIO
Valutazione e gestione del rischio cancerogeno per l’uomo da esposizione a singoli composti chimici
Identificazione del pericolo (valutazione qualitativa)
Valutazione esposizione
MONITORAGGIO AMBIENTALE
MONIT. BIOLOGICO
Studi epidemiologici
test di mutagenesi a breve termine
Studi sperimentali su animali
COMUNICAZIONE DEL RISCHIO
STIMA DEL RISCHIO (valutazione quantitativa)
Valutazione dei rischi
Relazione dose-risposta
GESTIONE DEL RISCHIO E DEFINIZIONE STANDARD DI QUALITA’
VALUTAZIONE DEL RISCHIO
Valutazione e gestione del rischio cancerogeno per l’uomo da esposizione a singoli composti chimici
Identificazione del pericolo (valutazione qualitativa)
Valutazione esposizione
MONITORAGGIO AMBIENTALE
MONIT. BIOLOGICO
Studi epidemiologici
test di mutagenesi a breve termine
Studi sperimentali su animali
COMUNICAZIONE DEL RISCHIO
STIMA DEL RISCHIO (valutazione quantitativa)
http://www.epa.gov/iris/index.html
EPA’s Integrated Risk Information System (IRIS) is a database that contains the Agency’s science and science policy positions on chronic human health effects that could result from exposure to environment contaminants.
Stime dei rischi
By-products RfD
(mg/kg/die)
Canc.
EPA
Genotox
OSF
( g/kg/die)
Unit Risk*
(1 g/l)
Cloroformio 0,01 B2 -
Bromodiclorometano 0,02 B2 + 62 1,8 x 10-6
Bromoformio 0,02 B2 + 7,9 2,3 x 10-7
Dibromoclorometano 0,02 C + 84 2,4 x 10-6
Acido dicloroacetico ? B2 - ? ?
Idrato di cloralio 0,1 C + ? ?
Formaldeide 0,2 B1 + ? ?
Bromato 0,004 B2 + 700 2 x 10-5
Stima dei rischi cancerogeni per assunzione orale
http://www.epa.gov/iris/index.html
*il rischio per un individuo di 70 chili che beve ogni giorno per tutta la vita un litro di acqua contenente 1 g/l di sostanza
Stima dei rischi per inalazione di 1 μg/m3 (Inhalation Unit Risks per μg/m3 )
Relazione dose-risposta
GESTIONE DEL RISCHIO E DEFINIZIONE STANDARD DI QUALITA’
VALUTAZIONE DEL RISCHIO
Valutazione e gestione del rischio cancerogeno per l’uomo da esposizione a singoli composti chimici
Identificazione del pericolo (valutazione qualitativa)
Valutazione esposizione
MONITORAGGIO AMBIENTALE
MONIT. BIOLOGICO
Studi epidemiologici
test di mutagenesi a breve termine
Studi sperimentali su animali
COMUNICAZIONE DEL RISCHIO
STIMA DEL RISCHIO (valutazione quantitativa)
Accettabilità del rischio
EPA: rischio di 10-4-10-6
OMS: rischio di 10-5
Sostanza Class.
EPA
Unit
Risk
(per 1 µg/L)
USA
(µg/L)
OMS
(µg/L)
UE
(µg/L)
Benzene A 4,4.10-7 5 10 1
B(a)P B2 1,6.10-6
2,1.10-4
0,2 0,7 0,01
Cloruro di vinile A 2,1.10-5
4,2.10-5
2 5 0,5
1,2-Dicloroetano B2 2,6.10-6 5 - 3
Diclorometano B2 2,1.10-7 5 20 .
Contaminanti idrici cancerogeni: Standard e rischi
Sostanze organiche e inorganiche registrate
dal CAS (Chemical Abstracts Service)
http://www.cas.org/cgi-bin/cas/regreport.pl
Count: 39,563,328 organic and inorganic substances
(Date: April 30, 2010)
•
Sostanze organiche e inorganiche registrate
dal CAS (Chemical Abstracts Service)
http://www.cas.org/cgi-bin/cas/regreport.pl
Count: 63,717,828 organic and inorganic substances
(Date: April 30 2012)
•
Dati disponibili sulla tossicità di composti chimici ad elevata produzione in Europa
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Cancerogenicità
Genotossicità "in vivo"
Tossicità cutanea acuta
Tossicità cronica
Genotossicità/mutagenicità
Tossicità orale acuta
%•Accumulo nell’organismo:????
•Effetto cocktail: X1+X2 +…..Xn = ????
•Interazioni: X1+X2 +…..Alcol, Farmaci, Fumo = ????
Test di mutagenesi a breve termine
• Test di mutazione genica (batteri, lieviti, miceti, insetti, cellule di
mammifero, ecc.) • Test di mutazioni cromosomiche (mammiferi, insetti, piante, cellule di
mammifero, lieviti, miceti, ecc.) • Test di danno e riparazione del DNA (cellule di mammifero, lieviti, miceti,
mammiferi)
Applicazioni dei test di mutagenesi per lo studio dei singoli composti
• FARMACI
• PESTICIDI
• ADDITTIVI ALIMENTARI
• SINGOLI INQUINANTI
GUIDANCE FOR INDUSTRY S2B Genotoxicity
A Standard Battery for Genotoxicity Testing of Pharmaceuticals
International Committee for Harmonization http://www.fda.gov/cder/guidance/1856fnl.pdf
MUTAGENICITY TESTING REQUIREMENTS FOR BIOCIDES
Proposal EU, 2003 1. In vitro gene mutation study in bacteria 2. In vitro cytogenicity study in mammalian cells 3. In vitro gene mutation assay in mammalian cells 4. If positive in 1., 2. or 3., then an in vivo mutagenicity study will be required (bone marrow assay for chromosomal damage or a micronucleus test) 5. If negative in 4. but positive in vitro tests then undertake a second in-vivo study to examine whether mutagenicity or evidence of DNA damage can be demonstrated in tissue other than bone marrow 6. If positive in 4. then a test to assess possible germ cell effects may be required
PROPOSAL FOR RECOMMENDED MUTAGENICITY / GENOTOXICITY TESTS FOR THE SAFETY TESTING OF COSMETIC INGREDIENTS AND FOOD ADDITIVES
2003
http://europa.eu.int/comm/health/ph_risk/committees/sccp/documents/out253_en.pdf
La nuova legge europea REACH
www.steptoe.com/assets/attachments/Borissova_-_New_EU_Chemicals_Legislation.pdf
REACH è l’acronimo di Registrazione, Valutazione, Autorizzazione e Restrizione delle sostanze chimiche. Il Regolamento REACH è entrato in vigore il 1° giugno 2007 e ha l’obiettivo di razionalizzare e migliorare il precedente quadro legislativo in materia di sostanze chimiche dell'Unione europea (UE).
Schema generale per il monitoraggio dell’esposizione umana a sostanze mutageno/cancerogene
Determinazione degli
inquinanti
nell'ambiente
AMBIENTALE
Dose
interna
Dose
biologica
efficace
Induzione
enzimatica
Effetti biologici
precoci
Esposizione Effetto
Suscettibilità
genetica
individuale
Dosaggio di
biomarcatori
BIOLOGICO
MONITORAGGIO
Test di mutagenesi e genotossicità
Genotossici nell’ambiente di lavoro
Esempi di lavorazioni che comportano l’esposizione a sostanze cancerogene
Sedi o tipi di tumori
Asfaltatura Erogazione, deposito, trasporto carburanti Fusione ferro-acciaio Industria galvanica Lavorazione cuoio Lavorazione legno Lavori in miniera e gallerie Produzione della gomma Produzione di alluminio
Lavorazione Agenti cancerogeni
IPA, bitume, catrame Benzene, benzina IPA, cromati (VI) Cromati (VI), nebbie e vapori ac. inorg. Forti Polveri di cuoio Polveri di legno Silice, IPA, radon AA, IPA IPA, olii minerali
Polmoni, vie respiratorie, cute Leucemie Cute e polmoni Polmoni, laringe Cavità nasali Cavità nasali Polmoni e cute Vie urinarie, leucemie, cute, polmone Cute, polmone, tratto gastro-int
Sostanze potenzialmente cancerogene nell’acqua potabile (conc. massime
riscontrate)
Cloruro di vinile
3.4 Benzopirene
Dieldrin
HCH
Bis (2 cloro etil) etere
Clordano
3.4 Benzofluorantene
CTC
Penta cloro bifenile
PCB, Tetra cloro bifenile
Tri cloro bifenile
Benzofenone
Eptacloro
Cloroformio
Tri cloro etilene
Aldrin
Nitriti (precursori delle nitrosamine)
Atrazina
Endrin
Esaclorobenzene
Esaclorobutadiene
Esacloroetano
Di cloro 1.4 fenolo
Bromo dicloro metano
Bromoformio
Clorobenzene
Dibromo cloro metano
Dicloro 1,2 etano
Tetra cloro etano
10
0.005
8
0.02
0.42
0.1
0.444
10.10
3
1
0.01
366
0.5
0.1
30
5.1
0.08
0.19
0.19
4.4
0.5
116
92
5.6
100
6
0.11
Composti particolati Attività
Idrocarburi policiclici aromatici (IPA) C, M
Nitro-IPA C, M
Metalli pesanti (Cd, Cr, Ni, As, Pb) C, M
Amianto C
Fumi di diesel C,M
Perossiacetilnitrato (PAN) M
Composti volatili o gassosi
1,3 butadiene C, M
Benzene C, M
Formaldeide C, M
Acetaldeide M
Solventi clorurati C, M
Cloruro di vinile C, M
Biossido di azoto (NO2) M
Composti cancerogeni (C) e mutageni (M) presenti nella
fase particolata e nella fase gassosa dell’aria urbana
Difficoltà nella valutazione dei rischi
per esposizione a miscele complesse • Le conoscenze sulla cancerogenicità e la genotossicità dei
composti singoli sono ancora scarse
• L’uomo è esposto nell’ambiente a miscele molto complesse di composti chimici
• Non sono stati studiati i fenomeni di sinergismo tra composti diversi
• Le indagini chimico-analitiche ambientali sono importanti ma mostrano limitazioni e non ci danno un quadro approfondito della composizione delle miscele complesse ambientali
• Si avverte la necessità di test biotossicologici rapidi che possano fornire informazioni sulla attività biologiche delle miscele complesse in toto
Le matrici ambientali contengono spesso migliaia di inquinanti organici e inorganici, dei quali solo una piccola % è stata identificata mediante indagini chimico-analitiche: alcuni di questi sono cancerogeni e genotossici.
64
IPA Metalli pesanti
PAN
NO3-
SO4=
Test di genotossicità: -rapidi - poco costosi -correlati con la cancerogenesi -Analisi in toto e In situ
Test di cancerogenicità in vivo: -costosi - lunghi
Studi su miscele complesse
?
THM
xenobiota
Accumulo
Escrezione Biotrasformazione
Esposizione a miscele complesse ambientali
Dose esterna - quantità di xenobiotici presenti nell'ambiente che possono venire a contatto con l'organismo (monitoraggio ambientale) Dose interna - quantità totale di un composto chimico assorbita dall'organismo in un dato periodo di tempo (monitoraggio biologico)
Schema generale per il monitoraggio dell’esposizione
umana a miscele di inquinanti mutageno/cancerogeni
Determinazione degli
inquinanti
nell'ambiente
AMBIENTALE
Dose
interna
Dose
biologica
efficace
Induzione
enzimatica
Effetti biologici
precoci
Esposizione Effetto
Suscettibilità
genetica
individuale
Dosaggio di
biomarcatori
BIOLOGICO
MONITORAGGIO
Metodi analitici
Test di mutagenesi (miscele complesse)
MONITORAGGIO DI MISCELE AMBIENTALI COMPLESSE
ACQUA
Potabile, superficiale, reflua, minerale
ARIA -Aria urbana, emissioni di veicoli,
industrie, inceneritori
- Aria indoor
SUOLO Suoli contaminati da industrie, pesticidi
CIBI
Cessione di contenitori di plastica, contaminanti ambientali, pesticidi
Mutation Res Mutagenesis Environ. & Molecular Mutagenesis
POLVERI AEREE E SALUTE
Emissioni mobili Emissioni fisse
ESPOSIZIONE UMANA
GLOBALE
Polveri atmosferiche primarie
Polveri atmosferiche secondarie
REAZIONI CHIMICHE
Polveri
occupazionali Fumo di
tabacco
Polveri indoor
Fattori genetici e ambientali
EFFETTI TOSSICI 68
INQUINANTI nelle POLVERI
ATTIVITA’
Idrocarburi policiclici aromatici (IPA)
Nitro-IPA
Nitro-benzantrone
Metalli pesanti (Cd, Cr, Ni, As, Pb)
Amianto
Fumi di diesel
Perossiacetilnitrato (PAN)
C, G
C, G
C, G
C, M
C
C, G
G
INQUINANTI GASSOSI O VOLATILI ATTIVITA’
1,3-Butadiene
Benzene
Formaldeide
Acetaldeide
Solventi clorurati
Cloruro di vinile
Biossido di azoto (NO2)
C, G
C, G
C, G
G
C, G
C, G
G
Cancerogeni e genotossici aerei
69
• Le polveri urbane prelevate in numerose città in tutto il mondo sono quasi sempre mutagene e genotossiche, specie in inverno
• In futuro sarà necessario studiare anche gli inquinanti volatili e semi-volatili
70
Campionatore ad alto volume per PM-10
Ricerche sulle polveri urbane
frazionate
71
< 0,5 m
0,5-0,95 m
0,95-1,5 m
1,5-3 m
3-7,2 m
7,2-10 m
FRAZIONI
DEL
PM-10
72
0
20
40
60
80
100
Frazioni del PM10 raccolte in 3 campionamenti dell’aria
di Brescia
1° campionamento
2° campionamento
3° campionamento
73
0
2
4
6
8
10
12,4
2,5
1,1 1,31,2
0,9 1,11,6
1,11 1
3,8
7,4
9,6
1,4 2 2,7
MUTAGENICITÀ DEL PARTICOLATO URBANO
MEDIANTE TEST SU SALMONELLA
Mutagenicità
< 0.5 m
0.5-10 m Particolato non
frazionato
74
Mutagenicità (revertenti/m3)
79,2%(7.6)
20,8%(2.0)
0
50
100
< 0.5 µm 0.5-10 µm
%
Benzo(a)pirene (ng/m3)
92,3 %(1,8)
7,7 %(0,15)
0
50
100
< 0.5 µm 0.5-10 µm
%
Mutagenicità e benzo(a)pirene nel PM10
dell’aria di Brescia
75
Tossicità delle polveri fini e ultrafini
• Si comportano come i gas: – Penetrano dall’esterno in casa
– Penetrano in profondità nei polmoni
- Possono entrare nella circolazione e spostarsi
dal polmone ad altri organi - Possono iniziare danni ossidativi
• Mostrano una superficie molto ampia
• Adsorbono composti tossici (prodotti di combustione, metalli, ecc.)
• Sono associati a morte prematura, malattie respiratorie, malattie cardiovascolari e cancro
76
(Sorensen et al., 2003, Mutation Research 544 (2-3))
Meccanismi cellulari della tossicità delle polveri ultra-fini
77 Ischemia CANCRO
• Le polveri urbane prelevate in numerose città in tutto il mondo sono quasi sempre mutagene e genotossiche, specie in inverno
• In futuro sarà necessario studiare anche gli inquinanti volatili e semi-volatili 78
Monitoraggio dei mutageni volatili con le piante:
il Tradescantia/micronuclei test
Ibrido di Tradescantia 79
Esposizione in situ
Inquinanti aerei
volatili, gas,
nanoparticelle (?)
Tetrade
normale
Tradescantia clone #4430 Tetrade con
Micronuclei
Esposizione in situ di piante
80
81
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
Galleria PG Galleria BS
controllo
1 ore
24 ore
Mutageni volatili in 2 gallerie con differente traffico
Test di genotossicità su piante esposte all’aria di Perugia
TEST DELLA COMETA SU TABACCO Danno primario al DNA
Alterazioni citogenetiche
TEST DEL MICRONUCLEO su TRADESCANTIA
82
83
POLVERI AEREE E SALUTE
Emissioni mobili Emissioni fisse
ESPOSIZIONE UMANA
GLOBALE
Polveri atmosferiche primarie
Polveri atmosferiche secondarie
REAZIONI CHIMICHE
Polveri
occupazionali Fumo di
tabacco
Polveri indoor
Fattori genetici e ambientali
EFFETTI TOSSICI 84
LE POLVERI INDOOR
85
FUMO PASSIVO vs FUMO ATTIVO:
Le polveri sono più fini e più mutagene
Le polveri sono
Parametro Fumo attivo Fumo passivo
Durata prod. fumo/sig 20 sec. 550 sec.
Tabacco bruciato 347 sec. 411 mg
Temperatura max 900°C 600°C
pH 5,8-6,1 6,9-8
Diametro particelle µm 0,1-1,0 0,01-0,1
No. Particelle 1x 1012 3,5x1012
Mutagenicità +++ +++++
Cancerogeni +++ +++++ 86
Un “nuovo” rischio:
il fumo di “terza mano”
• CHE COS’E’: Composti chimici presenti nel fumo che rimangono anche quando la sigaretta viene spenta e che reagiscono per formare nuovi cancerogeni (es. nitrosamine).
• Il fumo rimane intrappolato nei capelli, su pelle, abiti, tappeti, mobili, pareti e giocattoli.
www.lung.ca/protect-protegez/tobacco-tabagisme/second-secondaire/thirdhand-tertiaire_e.php 87
Fumo di terza mano e i bambini
• Il fumo di terza mano è presente anche nella polvere di casa che i bambini ingoiano quando mettono le mani in bocca: ne ingoiano 20 volte di più degli adulti.
MUTAGENICITA’ DELLE EMISSIONI
DI FORNELLI A GAS METANO
89
Fornello vecchio
90
X 4 volte
X 2 volte
Fornello nuovo
RISULTATI • Mutagenicità delle emissioni gassose
delle cucine:
•Molto elevata nella cucina vecchia
•Elevata nella cucina nuova
• Presenza di polveri fini (<0.5 m) e
tracce di IPA cancerogeni
• Mutagenicità delle polveri fini ++ 91
Fonti di mutageni nelle acque potabili
Acque superficiali
Acqua sotterranea
Disinfezione Rete idrica
•Disinfettanti •Sostanze naturali
Cessione da serbatoi e condotte
•Scarichi industriali • Rifiuti liquidi •Rifiuti solidi
•Sostanze naturali •Pesticidi •Rifiuti industriali •Rifiuti solidi
By-products che si formano durante la
clorazione
- 1974: scoperta del
cloroformio nelle
acque clorate
Ch
imic
a an
alit
ica
Mu
tage
nes
i
Studio della mutagenicità nelle acque potabili V
olatili
No
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latili
DISINFETTANTE + PRECURSORI (NOM, Br-, ecc.)
BY-PRODUCTS (mutageni/cancerogeni)
Cancro
E’ stata dimostrata una correlazione tra mutagenicità dell’acqua potabile clorata e mortalità per cancro (Ijsselmuiden et al., 1992; Koivusalo et al., 1994-1995; Schenck et al., 1998; Tao et al, 1999)
Mutagenicità
Tipo di acqua Tipo di trattamento Prima del
trattamento
Dopo il
trattamento
Lago Trasimeno NaClO +
Fiume Arno NaClO +
Lago di Como NaClO ++ +++
Lago di Como O3 ++
Lago di Garda NaClO + ++
Lago di Garda O3 + ClO2 +
Fiume Ohio (USA) GAC ++
Effetti dei trattamenti di acque superficiali sulla presenza di sostanze mutagene
Cessione da bottiglie in
Polietilentereftalato (PET)
mutageno
Cessione di mutageni dal PET nelle acque
minerali
Tempo stoccaggio/Luce
Acqua testata mutagena
(litri/piastra)
1 mese /luce 2 (++)
1 mese/buio 4 (+)
3 mesi/luce-buio -
Test di Ames
RISULTATI • Aumento di micronuclei in Tradescantia solo in acqua
minerale naturale stoccata per 2 mesi.
• Danno al DNA su leucociti in molti campioni di acqua (0,5 litri/test).
• Acqua di sorgente sempre negativa; aumento danno al DNA nell’acqua distribuita (tubature?)
• Analisi chimiche (GC/MS) hanno mostrato la presenza di un plasticizzante il di(2-ethylhexyl)phthalate, cancerogeno
epatico, interferente endocrino,
dopo 9 mesi di stoccaggio.
DEHP
Considerazioni finali
• Il monitoraggio ambientale di inquinanti mutageni è di particolare importanza per la prevenzione dei rischi cancerogeni, soprattutto per studiare miscele ambientali complesse a cui sono esposti milioni di persone quotidianamente
PROSPETTIVE • Sviluppo di modelli di monitoraggio ambientale
attraverso metodologie di studio integrate: analisi chimiche, ecotossicologiche e genotossicologiche
• Sviluppo di nuovi biomarker per il monitoraggio biologico di individui esposti
EPIDEMIOLOGIA MOLECOLARE
Epidemiologia classica • Limiti degli studi di epidemiologia classica:
– si limitano a studiare il nesso causale tra una determinata esposizione e l’insorgenza di una malattia,
– spesso la stima dell’esposizione è affidata alle risposte di un questionario (ed è quindi difficile verificarne la veridicità)
– i risultati ottenuti non tengono conto della interazione tra esposizione a genotossici e suscettibilità genetica dell’ospite
Esposizione
esternacancroEsposizione
esternacancro
Cosa è l’epidemiologia molecolare
Perera e Weinstein (1982) hanno suggerito di valutare end-points alternativi (dosabili con tecniche di biologia molecolare) al dato clinico in
grado di fornire informazioni sul livello di esposizione, sull'effetto biologico e sulla suscettibilità individuale dei soggetti esposti a presunti
agenti genotossici
L'impostazione di uno studio di epidemiologia molecolare non è dissimile da quella di uno studio di epidemiologia analitica, i due approcci variano solo
in relazione agli end-points ricercati
Epidemiologia tradizionale
Epidemiologia molecolare
Diagnosi di malattia Biomarcatori End-points
APPROCCIO MOLECOLARE: APPLICAZIONI NELL’EPIDEMIOLOGIA
DELLE MALATTIE INFETTIVE
Sorveglianza epidemiologica - controllo delle malattie emergenti e ri-emergenti • Caratterizzazione, Rilevamento, Diagnosi • Sorveglianza di eventi epidemici • Sorveglianza al fine di valutare i programmi di intervento
Epidemiologia molecolare • Ricerca delle origini • Studio dell’ecologia dell’agente infettivo • Studio delle vie di trasmissione e dell’interazione ospite/agente
L’epidemiologia molecolare L’epidemiologia molecolare è un nuovo campo dell’epidemiologia che studia
la comparsa di alterazioni molecolari, subcellulari e cellulari che si verificano prima dell’insorgere di una patologia
Il principale campo d’azione dell’epidemiologia molecolare sono le MALATTIE CRONICO-DEGENERATIVE ed in particolare
le MALATTIE NEOPLASTICHE
Il controllo dei TUMORI è reso difficile dalla loro natura MULTIFATTORIALE, con l’evoluzione verso la malattia condizionata da
esposizioni multiple e ripetute a fattori di rischio e con una PATOGENESI tipicamente MULTISTADI
La PATOLOGIA TUMORALE MANIFESTA è rappresentabile come la parte emersa, visibile di un iceberg
La parte visibile dell’iceberg è
l’oggetto di studio
dell’EPIDEMIOLOGIA
TRADIZIONALE (morbosità o
mortalità per determinate
malattie)
La parte invisibile è oggetto di
studio della EPIDEMIOLOGIA
MOLECOLARE
Fenomeno “iceberg”
Cosa è l’epidemiologia molecolare
L'epidemiologia analitica tradizionale si propone di stabilire eventuali associazioni tra esposizione a fattori di rischio ed insorgenza di patologie
Le indagini di epidemiologia tradizionale: non consentono di indagare all'interno della "scatola nera” non permettono di caratterizzare le popolazioni in base alle variazioni interindividuali di suscettibilità ai composti genotossici
ESPOSIZIONE:Idrocarburi policiclici aromatici(es. fumo di tabaccoinquinamento atmosferico, etc.)
MALATTIA:Carcinoma polmonare
(Meccanismo d’azione?)
Progressione verso la malattia
xenobiota
Accumulo
Escrezione Biotrasformazione
Esposizione a xenobiotici
Dose esterna - quantità di xenobiotici presenti nell'ambiente che possono venire a contatto con l'organismo (monitoraggio ambientale) Dose interna - quantità totale di un composto chimico assorbita dall'organismo in un dato periodo di tempo (monitoraggio biologico)
Xenobiotico
Metabolita intermedio
Escrezione
Metabolita solubile in acqua
Può essere una specie
reattiva
Può accumularsi nei
tessuti
Fase I
attivazione
Fase II
Coniugazione
Biotrasformazione
Non-polare
Polare
Solu
bili
ty in w
ate
r
Doseinterna
Dosebiologicaefficace
Esposiz. Manifestaz.clinica
Effettibiologiciprecoci
Alteraz.strutturafunzione
Progressione verso la malattia
Markers di esposizione
Markers disuscettibilità individuale
Markers clinici
ESPOSIZIONE MALATTIA
Classificazione di biomarcatori
1) biomarcatori di esposizione 2) biomarcatori di effetto 3) biomarcatori di suscettibilità genetica individuale
Evento (biochimico, molecolare, genetico, immunologico o fisiologico) misurabile in un sistema biologico, che possa essere considerato come
parte di un continuum tra un evento iniziale (generalmente un'esposizione a genotossici) ed il risultante stato patologico (es.
neoplasia)
Un biomarcatore • non è un test diagnostico • è un indicatore di un'alterazione che potrebbe risultare completamente
reversibile o che potrebbe evolversi in manifestazione clinica • deve essere correlato all'end-point clinico • deve essere sensibile anche a basse dosi di esposizione • deve essere possibilmente specifico • non deve richiedere indagini invasive
Biomarcatore
Biomarcatori di esposizione
Permettono di valutare se un individuo è stato esposto a genotossici e di determinarne l'entità dell'esposizione
Suddivisi in: • biomarcatori di dose interna - stimano l'entità dell'esposizione ad un dato
composto misurando la concentrazione dello xenobiotico stesso e/o dei suoi metaboliti nei fluidi biologici (ad es. mutagenesi urinaria,tioeteri urinari, ecc.);
• biomarcatori di dose biologica efficace - valutano l'entità delle alterazioni reversibili causate dall'esposizione a genotossici (ad es. danno primario al DNA, addotti al DNA ed alle proteine, ecc.);
• biomarcatori di effetti biologici precoci - valutano alterazioni al genoma (aberrazioni cromosomiche, scambi tra cromatidi fratelli, micronuclei)
Misurazioni dose interna
q/tà assorbita
q/tà rilasciata nei tessuti
nelle cellule
nelle
macromolecole
nei siti
critici
Biomarcatori di esposizione
Incr
em
ent
o del le
gam
e t
ra
asso
rbim
ent
o ed e
ffett
i su
lla
salu
te
Relazione
con l’esposizione
este
rna
DOSE BIOLOGICA EFFICACE
Biomarcatori di esposizione - dose interna -
Aspecifici
Mutagenesi urinaria
Tioeteri urinari
Specifici
Esposizione Tecnica Biomarcatore
IPA HPLC 1-OH-pirene
Cromo VI Assorbimento atomico Cr urinario
Aflatossina B1 HPLC Metaboliti urinari AF(P)1 ecc
Fumo di tabacco Cotinina HPLC
Urine di fumatori
Biomarcatori di esposizione - dose biologica efficace -
Addotti al DNA: sono soggetti a riparo del danno
Addotti alle proteine: (emoglobina albumina) non sono soggetti al riparo
Comet test
Head Length 21.97Tail % intensity 18.53Tail Moment 3.16
Tail Length 47.60Total Area 639.36
Total Intensity 476477.11
Head % intensity 81.47Mean Grey Level 69.98
1 cell scored Image is frozenx50 (Olio immersione)
Measure
Edit
Live
Frozen
Delete
È un metodo rapido e sensibile per la valutazione quantitativa del danno primario al DNA inteso come rotture dirette dello scheletro fosfodiesterico o
lesioni della molecola convertibili in rotture, che interessino il singolo o il doppio filamento del DNA
(single- e double-strand breaks).
Campo al microscopio a fluorescenza e schermata rappresentativa ottenuta nella valutazione del danno al DNA con il sistema computerizzato di analisi di immagini
Biomarcatori di esposizione - effetti biologici precoci -
Aberrazioni cromosomiche: risultano dalla rottura e dal riarrangiamento dei cromosomi
SCE Micronuclei
Schema generale del metabolismo degli xenobiotici
Sostanza
esogena
Derivato
idrosolubile
Metabolita attivato
Fase I
funzionalizzazione Fase II
coniugazione
Fase II
coniugazione
Permettono di evidenziare se un singolo individuo è particolarmente sensibile all'azione di uno specifico xenobiotico o di una classe di
xenobiotici
Lo stesso livello espositivo a genotossici non è necessariamente correlato, nei singoli soggetti, con lo stesso grado di rischio, e ciò in relazione al
polimorfismo genetico di alcune attività enzimatiche di Fase I , di Fase II e di riparo del DNA
Attività enzimatiche di Fase I (Esempi) polimorfismi genetici del citocromo P450 aldeide deidrogenasi diidropirimidina deidrogenasi Attività enzimatiche di Fase II (Esempi) glutatione S-transferasi N-acetiltransferasi
Biomarcatori di suscettibilità
Biomarcatori di suscettibilità
I geni biomarcatori di suscettibilità possono essere:
• molto diffusi nella popolazione • scarsamente correlati all’evento clinico (penetranza bassa) • geni che codificano per la produzione di enzimi del metabolismo delle
sostanze cancerogene OPPURE • poco diffusi nella popolazione • altamente correlati all’evento clinico (penetranza elevata) • geni deputati al controllo del differenziamento, del ciclo cellulare e del
riparo del DNA
Biomarcatori di suscettibilità -PCR -
Lo studio dei loci genetici codificanti per attività enzimatiche di Fase I e di Fase II possono essere realizzati mediante PCR su qualsiasi tessuto biologico
senza esporre il soggetto ad alcuna indagine invasiva
Biomarcatori di suscettibilità
Polimorfismi del citocromo P450
I citocromo P450 sono enzimi codificati da geni della superfamiglia CYP che catalizzano l'inserzione di un atomo di ossigeno molecolare nel substrato Il sequenziamento del genoma umano ha rivelato la presenza di 58 geni diversi che codificano per i citocromo P450, ma solo le famiglie CYP1, CYP2 e CYP3 sono quelle maggiormente coinvolte nel metabolismo degli xenobiotici. CYP1A1, il cui prodotto genico è un enzima chiave nel metabolismo di numerosi cancerogeni aromatici, presenta il gene nella sua forma selvaggia (CYP1A1*1A) e 2 polimorfismi denominati CYP1A1*2A e CYP1A1*2C. In entrambi i casi la mutazione comporta un aumento dell'attività dell'enzima
Biomarcatori di suscettibilità
Polimorfismi delle GST
La famiglia delle GSTs è costituita da un gruppo di enzimi dimerici ad azione detossificante ( coniugazione di molecole elettrofile con il glutatione ridotto). Nel citosol umano sono state identificate 5 classi di GSTs Entro la classe µ esistono almeno 5 geni che codificano per altrettanti isoenzimi (GSTM1, M2, M3, M4, M5) ed il gene che codifica l'isoforma GSTM1 è polimorfico. Il gene polimorfico può presentarsi con completa delezione di un allele dando origine, in omozigosi, al genotipo nullo (GSTM1-nullo). Tale configurazione genica determina una diminuita produzione di glutatione-S-transferasi.
Polimorfismi delle NAT (N-acetiltransferasi)
L’enzima trasferisce un gruppo acetilico ad arilammine ed idrazine
NAT1 - 19 differenti polimorfismi
NAT2 - 24 differenti polimorfismi
L’acetilazione detossifica:
NAT1 mutato - acetilatori rapidi
NAT2 mutato - acetilatori lenti (+ rischio)
Biomarcatori di suscettibilità
Polimorfismi e tumori alla vescica
Song et al., Carcinogenesis 22 : 11 - 16, 2001
Fumo e tumore al polmone
Effetti del metabolismo del CYP1A1
Studio caso-controllo - valori di OR -
Sigarette fumate/anno CYP1A1*1A Gene selvaggio
Non fumatori 3.2 1.0
Fumatori < 20 pacchetti/anno > 20 pacchetti/anno
3.6 11.4
2.6 4.2
Genotipi metabolici - sinergie sfavorevoli presenti nella
popolazione generale - • Un soggetto GSTM1 nullo possiede un RR di sviluppare cancro pari a 1.5
rispetto a soggetti GSTM1+
• Un soggetto con genotipo CYP1A1 mutato possiede un RR di sviluppare cancro compreso tra 1.2 e 1.9 rispetto a soggetti genotipo CYP1A1 selvaggio
•Un soggetto che presenta ambedue i polimorfismi sfavorevoli ha un RR di sviluppare cancro alla vescica pari a 6.8
SUGGERIRE ALLA POPOLAZIONE CORRETTI STILI DI VITA
MONITORAGGIO BIOLOGICI IN AMBIENTI DI LAVORO:
ESPOSIZIONE OCCUPAZIONALE A CAMPI MAGNETICI A BASSISSIMA FREQUENZA (50
HZ): EFFETTI CITOGENETICI IN SALDATORI
CAMPO MAGNETICO ELF: CANCEROGENICITA’
Gruppo 1 Cancerogeno accertato per l’uomo.
Vi è sufficiente evidenza di cancerogenicità nell’uomo in studi epidemiologici adeguati.
Gruppo 2A Probabile cancerogeno per l’uomo.
Evidenza limitata nell’uomo ed evidenza sufficiente negli animali da esperimento.
Gruppo 2B Possibile cancerogeno per l’uomo.
Evidenza limitata nell’uomo e evidenza non del tutto sufficiente negli animali da esperimento.
Gruppo 3 Non classificabile come cancerogeno per l’uomo
Tutto ciò che non rientra nei gruppi precedenti.
RISULTATI: TEST DEL MICRONUCLEO
• Valori medi della frequenza dei Micronuclei e dell’Indice Mitotico:
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1IM
esposti controlli
0
2
4
6
8
10
1
MN
/1000ce
ll b
inucl
eate
esposti controlli
Micronuclei Indice Mitotico
* *
RISULTATI: TEST DEL MICRONUCLEO
• Valori medi della frequenza dei Micronuclei e dell’Indice Mitotico per classi di età:
0
2
4
6
8
10
< 40 anni > 40 anni
MN
/1000cell b
inucle
ate
esposti controlli
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
< 40 anni > 40 anni
IM
esposti controlli
Micronuclei Indice Mitotico
ESPOSIZIONE OCCUPAZIONALE AD ANTIBLASTICI
PREPARAZIONE
MANIPOLAZIONE
EVENTI ACCIDENTALI
BONIFICA
SMALTIMENTO
SOMMINISTRAZIONE
SCOPO DELLA RICERCA
Biomarcatore
Esposiz. Dose
interna
Dose biologica efficace
Effetti biologici precoci
Suscett. genetica
individuale
Superfici Urine PBL PBL PBL
Farmaci Farmaci Danno al
DNA Alterazioni cromos.
Polimorf. genetici
CP 5-FU
CP 5-FU
Test della cometa
MN AC
GSTM1
Linee Guida
RISULTATI – MICRONUCLEI e ABERRAZIONI CROMOSOMICHE
Popolazione totale - Esposti vs. controlli:
aumento statisticamente significativo della frequenza di micronuclei e di aberrazioni cromosomiche nei soggetti professionalmente esposti a chemioterapici antiblastici
CONTROLS EXPOSED
0,00
2,00
4,00
6,00
MIC
RO
NU
CL
EI
P .0= 0 01
CONTROLS EXPOSED
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
%T
OTA
LA
BE
RR
AT
ION
S
P< 0.001
RISULTATI MN e AC Esposti (anzianità di mansione) - < 10 anni vs. > 10 anni:
effetti genotossici significativamente più elevati nei soggetti esposti con maggiore anzianità di mansione
<10 > 10
Years of exposure
2,00
4,00
6,00
8,00
MIC
RO
NU
CL
EI
(* )
<10 > 10
Years of exposure
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
%T
OTA
LA
BE
RR
AT
ION
S
(* )
DISCUSSIONE I risultati ottenuti suggeriscono:
le misure di protezione individuali e collettive adottate dagli operatori sanitari sono inadeguate per prevenire effetti biologici indesiderati di tipo genotossico;
le procedure chimico-analitiche previste dalle attuali Linee Guida per la valutazione dell’esposizione non restituiscono informazioni adeguate riguardo l’impatto dell’esposizione sulla salute dei lavoratori.
???
CONCLUSIONI generali L’uso di biomarker di epidemiologia molecolare può dare utili
informazioni su:
Etiologia dei tumori:
benzene, addotti e aberrazioni cromosomiche e leucemia
fumo di sigaretta e cancro polmonare
Valutazione dei rischi cancerogeni
Dal 1997 la IARC ha utilizzato prove meccanicistiche (bioindicatori animali o umani) per spostare la classificazione dei cancerogeni. Es. ossido di etilene e diossina da 2A a 1 (cancerogeno umano).
Valutazione di interventi preventivi
riduzione di livelli di inquinamento ambientale
interventi di chemioprevenzione
Il futuro della cancerogenesi professionale
Integrazione tra monitoraggio ambientale monitoraggio biologico
Integrazione immediata dei controlli tradizionali con bioindicatori predittivi (micronuclei, addotti, Comet test)
Integrazione futura dei bioindicatori attuali con nuovi biondicatori epigenetici e con nuove “omic technologies”:
- Proteomica
- Metabonomica
- Epigenomica