UNIVERSITÀ CATTOLICAUNIVERSITÀ CATTOLICAFACOLTA DI MEDICINA E CHIRURGIA FACOLTA DI MEDICINA E CHIRURGIA

“SCUOLA DI SPECIALIZZAZIONE IN FISICA “SCUOLA DI SPECIALIZZAZIONE IN FISICA SANITARIA”SANITARIA”

  

Formazione e rivelazione di Formazione e rivelazione di aberrazioni cromosomicheaberrazioni cromosomiche

Alberto Panese

Interazione Radiazioni Interazione Radiazioni Ionizzanti con la MateriaIonizzanti con la Materia

• Eccitazioni• Ionizzazioni• Energia media dissipata per evento di ionizzazione

34 eV• Energia necessaria per rompere un legame

molecolare

2 - 5 eV

Effetti CellulariEffetti Cellulari

Induzione di aberrazioni cromosomiche e cromatidiche

Inattivazione o morte riproduttiva (necrosi, apoptosi)

Induzioni di mutazioni geniche

Trasformazione oncogenica “in vitro”

DNA, DNA, Principali Bersaglio delle Principali Bersaglio delle Radiazioni IonizzantiRadiazioni Ionizzanti

Recentemente è stata rivolta particolare attenzione non solo

al DNA come molecola, ma all’intera struttura

funzionale che lo contiene

Numerose evidenze mostrano che l’intera struttura possa

influenzare sia la produzione di lesioni sia

la loro riparazione

Doppia elica

Struttura nucleosomica

Cromosoma

Struttura CromosomicaStruttura Cromosomica

Raggi γ

DNA ~ 2 nm diameter

Istone

nucleosoma

1 MeV

Particelle α

10 nm

Ioni Carbonio-

3 MeV

1 MeV

0,3 MeV

Protoni

Fibra di Cromatina~25 nm diametro

..

1 MeV

Interazione tra Struttura della Interazione tra Struttura della Cromatina e Struttura di TracciaCromatina e Struttura di Traccia

Probabilità di lesioni al DNA e loro distribuzione spaziale

Lesioni al DNA Sulla Singola e Lesioni al DNA Sulla Singola e Sulla Doppia CatenaSulla Doppia Catena

Le lesioni sulla singola catena del DNA sono normalmente

riparate in modo efficace dal sistema e non sono

considerate critiche nell’inattivazione delle cellule

Al contrario, rotture sulle due eliche complementari del DNA

risultano più difficili da riparare e sono considerate quindi le

lesioni critiche del DNA

La mancata riparazione corretta delle doppie rotture del

DNA è causa potenziale di morte cellulare o aberrazioni

cromosomiche e mutazioni in generale

Il Ciclo CellulareIl Ciclo Cellulare

Le cicline sono proteine essenziali per la

progressione della cellula attraverso le diverse fasi

del ciclo cellulare

La transizione da una fase all’altra avviene solo in presenza dell’attività

enzimatica di una determinata cdk che attiva

la ciclina specifica necessaria per la

transizione

In interfase ciascun cromosoma si è duplicato e

la cellula possiede una quantità doppia di DNA

L’interfase o Fase G2L’interfase o Fase G2

La divisione cellulare o mitosi avviene in quattro fasi.

1. PROFASE

2. METAFASE

3. ANAFASE

4. TELOFASE

La Mitosi o Fase MLa Mitosi o Fase M

PROFASE

La membrana nucleare inizia a disfarsi e si spiralizzano

METAFASE

I cromosomi si dispongono al centro della cellula su un piano orizzontale

Profase e MetafaseProfase e Metafase

ANAFASE

La cellula si allunga, i cromosomi

si separano e si portano agli

estremi della cellula dove

incominciano a riformarsi i due

nuclei

TELOFASE

Intorno ad ogni nucleo si forma la membrana, il citoplasma si suddivide attorno ai due nuclei e la cellula si divide completamente in due cellule figlie attorno alle quali si completa la membrana cellulare

Anafase e TelofaseAnafase e Telofase

Metodi di rilevazione delle Metodi di rilevazione delle Aberrazioni CromosomicheAberrazioni Cromosomiche

Analisi mitotica dopo “colorazione standard”

Tecnica di collegamento

Incorporazione di BrDU (bromodeoxyridine)

durante il ciclo cellulare

Incorporazione di BrDU durante diversi cicli

Analisi mitotica dopoAnalisi mitotica dopo “colorazione standard” “colorazione standard”

Questo metodo classico di Questo metodo classico di colorazione fa apparire i colorazione fa apparire i cromosomi come piccoli cromosomi come piccoli

segmenti colorati segmenti colorati uniformementeuniformemente

Questi possono essere Questi possono essere classificati in accordo con classificati in accordo con la loro dimensione e dalla la loro dimensione e dalla posizione del centromeroposizione del centromero

Tecnica di CollegamentoTecnica di Collegamento

““Colorando” i cromosomi Colorando” i cromosomi con un farmaco si con un farmaco si

possono distinguere possono distinguere bande più o meno bande più o meno

fluorescentifluorescenti

(Q-Banding)(Q-Banding)

Tecniche DinamicheTecniche Dinamiche

Il metodo originale include l’incorporazione Il metodo originale include l’incorporazione di un composto chimico trovato nel DNAdi un composto chimico trovato nel DNA

Attualmente viene impiegato la Attualmente viene impiegato la Bromodeoxyridina BrDU. Bromodeoxyridina BrDU.

Questa guida alla visualizzazione del difetto Questa guida alla visualizzazione del difetto nella condensazione del cromosoma e nella condensazione del cromosoma e

all’alterazione della strutturaall’alterazione della struttura

Tecniche DinamicheTecniche DinamicheIncorporazione di BrDU durante il Ciclo CellulareIncorporazione di BrDU durante il Ciclo Cellulare

Se il BrDu è inserito durante la seconda metà Se il BrDu è inserito durante la seconda metà della fase S, la distribuzione delle bande è della fase S, la distribuzione delle bande è quella dell’ R-Banding mentre le G-Banding quella dell’ R-Banding mentre le G-Banding

rimangono scurerimangono scure

R-Banding = Iniziale DuplicazioneR-Banding = Iniziale Duplicazione

Tecniche DinamicheTecniche DinamicheIncorporazione di BrDU durante Diversi Cicli CellulariIncorporazione di BrDU durante Diversi Cicli Cellulari

Se il BrDU è inserito durante due cicli Se il BrDU è inserito durante due cicli cellulari i cromosomi mostrano una cellulari i cromosomi mostrano una

fluorescenza cromatidica e una scurafluorescenza cromatidica e una scura

Luminosita del cromatide ha sostituito BrDu Luminosita del cromatide ha sostituito BrDu solo su un lato della molecola del DNAsolo su un lato della molecola del DNA

Questa differenza di colorazione sulle due Questa differenza di colorazione sulle due cromatidi sorelle dimostra scambi tra lorocromatidi sorelle dimostra scambi tra loro

Dicentrici

Anelli

Traslocazioni

Delezioni

Principali Aberrazioni Principali Aberrazioni Cromosomiche e Cromosomiche e

CromatidicheCromatidiche

Aberrazioni Aberrazioni CromosomicheCromosomiche

Se due cromosomi sono rotti

prima della replicazione, i

frammenti possono scambiarsi

e ricongiungersi

Si forma così una traslocazione

che dà luogo a cellule alterate

dopo la replicazione

Cromosomi in G1

Se si ricongiungono tra loro i

due frammenti più corti e i

due frammenti più lunghi, si

forma una unione illegittima

Cromosomi in G1

Aberrazioni CromosomicheAberrazioni Cromosomiche

Oppure, se i frammenti

rotti non sono

ricongiunti, essi non

sono inclusi nella

mitosi successiva

Cromosomi in G1

Aberrazioni CromosomicheAberrazioni Cromosomiche

L’ unione illegittima, dopo la

replicazione, dà luogo ad un

cromosoma dicentrico e ad

un frammento acentrico

Cromosomi in G1

Aberrazioni Aberrazioni CromosomicheCromosomiche

Il cromosoma dicentrico ha due centromeri

Il cromosoma acentrico è privo di centromero

Le aberrazioni con cromosomi dicentrici sono letali per la

cellula

Cromosomi in G1

Aberrazioni CromosomicheAberrazioni Cromosomiche

Due rotture, una su ciascun

braccio di un cromosoma,

può

portare alla formazione

di un anello

Le aberrazioni

cromosomiche ad anello

sono anche’esse letali per la

cellula

Cromosomi in G1

Aberrazioni CromosomicheAberrazioni Cromosomiche

Se avvengono due rotture,

ciascuna su una cromatide

sorella dello stesso cromosoma

dopo la replicazione, le due

estremità di esso possono

ricongiungersi e formare una

unione tra cromatidi sorelle

Cromosomi in G2

Aberrazioni CromosomicheAberrazioni Cromosomiche

Dose Risposta per Aberrazioni Dose Risposta per Aberrazioni CromosomicheCromosomiche