Le anomalie cromosomiche criptiche

Laura Pilo

Anomalie cromosomiche criptiche

Le anomalie cromosomiche criptiche sono alterazioni cromosomiche non evidenziabili con un esame del cariotipo eseguito con tecniche di citogenetica tradizionale (un cariotipo ad alta risoluzione ha una risoluzione massima di 5-10 Mb).

CostituzionaliSindromi da microdelezione, riarrangiamenti criptici subtelomerici…

Acquisite Sindrome mielodisplastica 5q-,

cromosoma Philadelphia, t(12;21)( p13;q22)Sarcoma di Ewing…

Anomalie cromosomiche criptiche

Dupliconi o regioni LCR (Low Copy Repeat)

• Blocchi di poche sequenze ripeturte (LCR) con omologia reciproca elevata (94-99%)

• Grandezza 200-400 kb• Interspersi in tutto il genoma (10%) in siti specifici (regioni

subtelomeriche e pericentromeriche)• Spesso duplicati inella medesima regione cromosomica a distanza

di 1,5-3Mb (causa di errori di ricombinazione al crossing-over meiotico)

• Ricombinazione omologa non allelica causa di: delezioni, duplicazioni, inversioni, traslocazioni e cromosomi marcatori.

Riarrangiamenti subtelomerici e ritardo mentale

Chromosome abnormalitiesare found in 4–28% of individuals with mental retardation (Curry CJ,1997).

The subtelomeric regions are gene-rich and are often involved in chromosomal rearrangements (Saccone S,1992).

Delezione terminale del braccio lungo (q13)

75% dei soggetti ha una delezione semplice25% delezione causata da una traslocazione sbilanciatao altri riarrangiamenti strutturali, come un cromosoma 22 ad anello (r22). La taglia della porzione deleta è variabile (da 100 Kb a oltre 9Mb).

La frequenza della malattia non è nota poichè si tratta di una condizione sottodiagnosticata a causa dell’aspecificità del fenotipo clinico, sovrapponibile ad altre sindromi, e della difficoltà di evidenziare la delezione 22q13.3 con le indagini citogenetiche di routine.

Caratterizzata da ipotonia neonatale, crescita normale o accelerata, assenza o grave compromissione del linguaggio, ritardo globale dello sviluppo, lievi dismorfismi facciali

SINDROME DA DELEZIONE 22q13.3 sindrome Phelan-McDermid

PRINCIPALI SINDROMI DA PRINCIPALI SINDROMI DA MICRODELEZIONEMICRODELEZIONE

SINDROME LOCALIZZAZION

E CROMOSOMICA

GENE SOGGETTI CON

MICRODELEZIONE

DiGeorge/Velocardiofa

cciale 22q11.2

TBX1 9o%

Williams/Beuren 7q11.23

ELN

LIMK1

CYLN2

96%

Smith-Magenis 17p11.2 RAI1 95%

Miller-Dieker 17p13.3 LIS1 >90%

Prader Willi 15q11.13 SNRPN 80%

Angelman 15q11 UBE3A 70%

La delezione 22q11.2 è associataalla sindrome di DiGeorge/ Velocardiofacial

1:5000 neonati (Burn and Goodship 1996) ~95% delezione 3Mb~ 5% delezione 1,5Mb(Carlson et al.1997)

Both deletions were found to occur as a result of nonallelic homologous recombination (NAHR) (Stankiewicz et al.2002)

22q11.2 (gene Tuple1)

Controllo22q13 (geneARSA)

• Analisi citogenetica convenzionale -Analisi solo su metafase -Indice mitotico -Morfologia dei cromosomi -Limite di risoluzione: 4-5Mb

• Fish (Fluorescence in situ hybridization) -Analisi su nuclei interfasici -Caratterizzazione di riarrangiamenti strutturali -Caratterizzazione di marcatori cromosomici sovrannumerari -Individuazione di riarrangiamenti criptici -Diagnosi di aneuploidie su nuclei in interfase

Limite di risoluzione: preparati convenzionali (1Mb), fino ad 1Kb nei preparati estesi di fibre cromosomiche.

Non fornisce informazioni sull’intero corredo cromosomico ma solo su uno specifico quesito diagnostico.

Array-CGH

In array CGH arrays of genomic BAC,P1,cosmid or cDNA clones are used for hybridization instead of metaphase chromosomes in conventional CGHtechnique.

Array-CGH• Le variazioni nel numero di copie di DNA vengono così evidenziate

analizzando le differenze nell’intensità di fluorecenza dei pattern di ibridizzazione di entrambi i DNA.

• La risoluzione è determinata dalla distanza tra cloni consecutivi sull’array e dalla loro dimensione.

• Teoricamente, si possono costruire arrays che coprono qualsiasi regione di interesse con qualsiasi risoluzione.

L’incapacità di rilevare anomalie cromosomiche nei casi in cui non si abbia ne perdita ne guadagno di materiale genetico rappresenta una delle grosse limitazioni della tecnica.

Applicazione dell’Array-CGH• Diagnosi in ambito oncologico.• Diagnosi in ambito pediatrico e neonatologico, delle cause di ritardo mentale

e/o malformazioni.• Studio di malattie genetiche, congenite ed acquisite.

• I seguenti ambiti di applicazione, sebbene promettenti, sono invece ancora in fase di ricerca: ambito ginecologico (per diagnosi prenatale), ambito ematologico (per diagnosi e definizione della prognosi nelle leucemie).

• Si tratta di una metodica complessa che deve essere applicata soltanto a seguito di una rigorosa selezione dei casi, quando le metodiche di alta risoluzione e di FISH non hanno evidenziato alterazioni e solo dopo una valutazione genetica-dismorfologica per escludere sindromi genetiche che non comportano microalterazioni cromosomiche, ma alterazioni geniche. In ogni caso la valutazione se applicare o meno tale metodica è effettuata dal medico genetista, in collaborazione con i clinici pediatri, neonatologi, neuropsichiatri o altri.

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J Med Genet 2004;41:198–202The performance of CGH array for the detection of cryptic constitutional chromosome imbalancesJ Schoumans, B-M Anderlid, E Blennow, B T Teh, M Nordenskjo¨ld

Expert Rev Mol Diagn. 2005 May;5(3):421-9.Array-based comparative genomic hybridization in clinicaldiagnosis.Bejjani BA, Theisen AP, Ballif BC, Shaffer LG

Journal of Molecular Diagnostics, Vol. 8, No. 5, November 2006Application of Array-Based Comparative Genomic Hybridization to Clinical DiagnosticsBassem A. Bejjani and Lisa G. Shaffer

Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 2008. 9:71–86Clinical Utility of Contemporary Molecular CytogeneticsBassem A. Bejjani and Lisa G. Shaffer

CostituzionaliSindromi da microdelezione, riarrangiamenti criptici subtelomerici…

Acquisite Sindrome mielodisplastica 5q-,

cromosoma Philadelphia, t(12;21)( p13;q22),Sarcoma di Ewing…

Anomalie cromosomiche criptiche

Journal of the European Hematology Association, 2008; 93(7) 1001-1008

Fluorescence in situ hybridization improves the detection of 5q31 deletion in myelodysplastic syndromes without cytogenetic evidence of 5q-Mar Mallo, et al.

Casistica: n.716 pazienti637 cariotipo normale

79 del 5q

ACC Fish LSI 5q3138 positivi (5,96%)

79 del 5q

cariotipo normale 474 13 (9,2%)

no metafasi 54 11 (20,4%)

cariotipo abn chr5 11 9 (81,8%)

cariotipo abn 98 5 (5,1%)

637 Fish 5q31

(…) we consider that it is mandatory apply Fish of 5q31 to detect 5q deletion in cases with an abnormal karyotype involving chromosome 5 and in cases without metaphases or that are not evaluable.

Cromosoma Philadelphia• Nelle CML l’1% dei pazienti non presentano il cromosoma Ph a

causa di un riarrangiamento criptico.

• RT-PCR e FISH: rilevamento del gene di fusione BCR/ABL e di eventuali riarrangiamenti Ph varianti.

• Sonde BAC locus specifiche per identificare i punti di rottura e la sequenzialità degli eventi che hanno portato alla formazione dei derivatives.

• Scelta terapeutica e monitoraggio della remissione citogenetica dopo trattamento.

Molecular Cytogenetics 2008, 1:14FISH mapping of Philadelphia negative BCR/ABLI positive CMLAnna Virgili, et al.

1) Analisi del cariotipo di 9 pazienti +1 linea cellulare: Ph neg2) PCR positiva per il gene di fusione BCR/ABL13) Fish LSI BCR/ABL1 per la localizzazione del gene di fusione: 5 pazienti + linea cellulare in 22q11.2 3 pazienti in 9q34.1 1 paziente in 22p 4) FISH mapping con sonde BAC per determinare la localizzazione dei breakpoints.

Schematic representation of the multiple step rearrangement with chromosomes 9 in red and 22 in green. Red arrowheads show the breakpoints. The presence of both 9q34 sequences inserted on der(22) and 22q11.2 sequences inserted on der(9) (black arrows) can be explained by two consecutive translocations: an initial t(9;22)(q34;q11.2) followed by a second reciprocal translocation between the two products,with breakpoints distal to both BCR/ABL1 and ABL1/BCR fusion genes.