Università degli Studi di TorinoUniversità degli Studi di Torino

Corso di Laurea Specialistica Biotecnologie MedicheCorso di Laurea Specialistica Biotecnologie Mediche

Immunologia MolecolareImmunologia Molecolare

Genuardi ElisaGenuardi Elisa

Emoglobinuria Emoglobinuria Parossistica NotturnaParossistica Notturna

Emoglobinuria Emoglobinuria Parossistica NotturnaParossistica Notturna

22 novembre 200722 novembre 2007

L’Emoglobinuria Parossistica Notturna (PNH) è una rara L’Emoglobinuria Parossistica Notturna (PNH) è una rara patologia patologia acquisitaacquisita caratterizzata da un’espansione clonale non maligna di caratterizzata da un’espansione clonale non maligna di una o più una o più cellule staminali ematopoietichecellule staminali ematopoietiche, causata da mutazioni , causata da mutazioni

somatiche a livello del somatiche a livello del gene PIGAgene PIGA sul cromosoma Xp22 sul cromosoma Xp22

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……Un po’ di Storia…Un po’ di Storia…

1866: Sir William Gull descrisse il caso di un giovane paziente con 1866: Sir William Gull descrisse il caso di un giovane paziente con “ematinuria”“ematinuria”

1882: Strubin, riconobbe Hb come pigmento delle urine nei casi 1882: Strubin, riconobbe Hb come pigmento delle urine nei casi descrittidescritti

1928: 1928: EnnekingEnneking conia il nome di Emoglobinuria Parossistica Notturna conia il nome di Emoglobinuria Parossistica Notturna

1930: Ham osserva che i globuli rossi nella PNH sono sensibili alla lisi 1930: Ham osserva che i globuli rossi nella PNH sono sensibili alla lisi mediata dal complementomediata dal complemento

1956: deficit di AChE negli eritrociti di pz con PNH1956: deficit di AChE negli eritrociti di pz con PNH

1970-1990: identificazione delle proteine transmenbrana mancanti nei 1970-1990: identificazione delle proteine transmenbrana mancanti nei globuli rossi si pz con PNH con un ruolo nella lisi complemento-mediataglobuli rossi si pz con PNH con un ruolo nella lisi complemento-mediata

1993: 1993: KinoshitaKinoshita isola il gene PIG A come responsabile delle isola il gene PIG A come responsabile delle caratteristiche molecolari dell’EMOGLOBINURIA PAROSSISTICA caratteristiche molecolari dell’EMOGLOBINURIA PAROSSISTICA

NOTTURNANOTTURNA

… …PIG A e biosintesi delle GPI PIG A e biosintesi delle GPI anchor proteins…anchor proteins…

PIG APIG A

http://www.ncbi.nlm.nih.gov [5]

……le Conseguenze….le Conseguenze….

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CD59CD59

CD55 CD55

……CD 55 e CD 59…CD 55 e CD 59…

http://asheducationbook.hematologylibrary.org

Azione su C3-C5 convertasiAzione su C3-C5 convertasi

inibisce MACinibisce MAC

inibisce MACinibisce MAC

Azione su C3-C5 convertasiAzione su C3-C5 convertasi

Microvescicolazione complessi MAC e Microvescicolazione complessi MAC e lisi cellulelisi cellule

piastrine

Deficit u-PARDeficit u-PAR

INIBIZIONE ATTIVITA’ INIBIZIONE ATTIVITA’ FIBRINOLITICA e FIBRINOLITICA e INDOTTA INDOTTA ESPRESSIONE ESPRESSIONE ATTIVITA’ ATTIVITA’ PROTROMBINICAPROTROMBINICA

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……Caratteristiche Cliniche…Caratteristiche Cliniche…

•Emoglobinuria

•Trombosi

•Anemia

•Disfagia

•Dolori addominali

•Spasmi esofagei

•Impotenza maschile

http://www.hmds.org.uk

http://www.thecrookstoncollection.com

……Diagnosi…Diagnosi…

TEST DI HAMTEST DI HAM studia la sensibilità delle emazie al complemento in studia la sensibilità delle emazie al complemento in mezzo acido a ph 6.5 e a 37°Cmezzo acido a ph 6.5 e a 37°C

TEST AL SACCAROSIOTEST AL SACCAROSIO studia l’anomala sensibilità al complemento studia l’anomala sensibilità al complemento delle emazie in un mezzo a debole forza ionicadelle emazie in un mezzo a debole forza ionica

LIMITILIMITI

Non sensibileNon sensibile

No quantificativo No quantificativo

Falsi negativiFalsi negativi

Adattata da Pasquinelli F.”Diagnostiche e Tecniche di Laboratorio”

CITOFLUORIMETRIACITOFLUORIMETRIA

•Permette la quantificazionePermette la quantificazione

•Tecnica sensibile (minimo 0,003% cells GPI -AP-)Tecnica sensibile (minimo 0,003% cells GPI -AP-)

•Utilizzo di MoAb che riconoscono GPI anchor proteins (anti-CD55 Utilizzo di MoAb che riconoscono GPI anchor proteins (anti-CD55 e anti CD 59) e Moab verso marker specifici delle linee cellularie anti CD 59) e Moab verso marker specifici delle linee cellulari

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FLAERFLAER

(Fluorescently Labelled Inactive variant of the Protein Aerolysin)(Fluorescently Labelled Inactive variant of the Protein Aerolysin)

•Identifica, in base alla % cloni PNH, pazienti a rischio di trombosiIdentifica, in base alla % cloni PNH, pazienti a rischio di trombosi

•La % di granulociti è indice di dolori addominali, grado di emolisi, spasmi La % di granulociti è indice di dolori addominali, grado di emolisi, spasmi orofagei e disfunzioni erettili.orofagei e disfunzioni erettili.

•Alta affinità e specificità per “l’ancora” delle GPI-APsAlta affinità e specificità per “l’ancora” delle GPI-APs

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……MOSAICISMO CELLULARE SOMATICO…MOSAICISMO CELLULARE SOMATICO…

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……MOISACISMO CELLULARE SOMATICO…MOISACISMO CELLULARE SOMATICO…

Osservato con test di sensibilità alla lisi complemento-mediata e Osservato con test di sensibilità alla lisi complemento-mediata e confermato con esperimenti di citofluorimetria e FLAERconfermato con esperimenti di citofluorimetria e FLAER

Pazienti con PNH possono presentare 3 popolazioni di GR:Pazienti con PNH possono presentare 3 popolazioni di GR:

PNH IPNH I normali, GPI-APs presenti normali, GPI-APs presenti

PNH IIPNH II deficit parziale di GPI-APs deficit parziale di GPI-APs

PNH IIIPNH III deficit totale deficit totale

La gravità della patologia è molto influenzata dalla percentuale di cellule La gravità della patologia è molto influenzata dalla percentuale di cellule appartenenti alle 3 popolazioni!!appartenenti alle 3 popolazioni!!

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???MOSAICISMO CELLULARE SOMATICO???????MOSAICISMO CELLULARE SOMATICO????

Xp22Xp22

Gene PIG A(6 esoni)Gene PIG A(6 esoni)

Esone 1Esone 1 molto corto, non è tradotto molto corto, non è tradotto

Esone 2Esone 2 codifica per gran parte del trascritto codifica per gran parte del trascritto

ProteinaProteina di 54 kD, 484 aa con una sequenza di 54 kD, 484 aa con una sequenza idrofobica di 27 aa nei pressi del C- terminaleidrofobica di 27 aa nei pressi del C- terminale

Modelli in vivo:Modelli in vivo:

KO Pig AKO Pig A letale a livello embrionale letale a livello embrionale

KO condizionaliKO condizionali emolisi intravascolare (conferma aspetti clinici) emolisi intravascolare (conferma aspetti clinici)

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[9]

Donne e uomini: stessa frequenza di PNH Donne e uomini: stessa frequenza di PNH

HSCHSC

XXXX

Inattivazione XInattivazione X

HSCHSC

XYXY

Mutazioni somatiche su PIG AMutazioni somatiche su PIG A

PNHPNH

… … Le Mutazioni …Le Mutazioni …

19951995 Bessler et al analizzano Bessler et al analizzano il cDNA di PIG A in quattro linee il cDNA di PIG A in quattro linee cellulari GPI-AP-cellulari GPI-AP-

La perdita del trascritto funzionante è La perdita del trascritto funzionante è dovuta a exon skipping dell’esone 2dovuta a exon skipping dell’esone 2

INSERZIONI E DELEZIONI:INSERZIONI E DELEZIONI:

•Mutazioni missenseMutazioni missense (cambio aa)(cambio aa)

•Mutazioni nonsenseMutazioni nonsense (stop (stop codon prematuro)codon prematuro)

•Mutazioni su siti di Mutazioni su siti di splicingsplicing (lunghezza mRNA (lunghezza mRNA e stabilità)e stabilità)

DELEZIONE DELEZIONE regione regione promoter (CAAT motifs), promoter (CAAT motifs), esone 1 e parte dell’introne esone 1 e parte dell’introne 1 determina una diminuita 1 determina una diminuita ma non assente ma non assente espressione delle GPI-APs espressione delle GPI-APs [10]

2005 Hu et al. osservano mutazioni a livello di PIG A 2005 Hu et al. osservano mutazioni a livello di PIG A anche in cellule di sanianche in cellule di sani

PoliclonaliPoliclonali

Avvengono su cellule che non Avvengono su cellule che non si autorinnovanosi autorinnovano

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Molti studi clinici individuano in pazienti con patologie ematologiche Molti studi clinici individuano in pazienti con patologie ematologiche una percentuale di cellule GPI-APs -una percentuale di cellule GPI-APs -

ANEMIA APLASTICAANEMIA APLASTICA

MIELODISPLASIEMIELODISPLASIE

PNHPNH

P.S: anche i sani hanno mutazioni somatiche in PIG AP.S: anche i sani hanno mutazioni somatiche in PIG A

HSCHSC

Antigene selfAntigene self

??? GPI-AP?????? GPI-AP???

Riconosciuto come non Riconosciuto come non selfself REAZIONE REAZIONE AUTOIMMUNITARIAAUTOIMMUNITARIA

HSCHSCPIG A mut

ESCAPE ALLA REAZIONE ESCAPE ALLA REAZIONE IMMUNITARIAIMMUNITARIA

Ma Ma

Deficit di GPI-APsDeficit di GPI-APs EMOLISI e EMOLISI e PNH!!!!PNH!!!!

… … DUE REQUISITI…DUE REQUISITI…

•Presenza di mutazioni a livello di PIG APresenza di mutazioni a livello di PIG A

•Presenza di un microambiente idoneo, da cui le cellule Presenza di un microambiente idoneo, da cui le cellule GPI-APs – possono trarre un vantaggio selettivo alla GPI-APs – possono trarre un vantaggio selettivo alla crescita ( escape alla reazione autoimmunitaria)crescita ( escape alla reazione autoimmunitaria)

•Nei pazienti con PNH le mutazioni a carico del gene PIG A Nei pazienti con PNH le mutazioni a carico del gene PIG A sono sono CLONALICLONALI ( colpiscono la stessa regione del gene) ( colpiscono la stessa regione del gene)

Il clone che trae Il clone che trae maggior vantaggio alla maggior vantaggio alla crescita dal crescita dal microambiente microambiente “autoimmune”, “autoimmune”, prolifera senza limiti prolifera senza limiti per ripristinare una per ripristinare una normale emopoiesi normale emopoiesi

Telomere Restriction Fragments Telomere Restriction Fragments di pz con PNH è molto più corto di pz con PNH è molto più corto rispetto ai sanirispetto ai sani evidenza di evidenza di una spiccata proliferazioneuna spiccata proliferazione

A livello periferico si riflette la A livello periferico si riflette la mancanza delle GPI-APsmancanza delle GPI-APs

IL CLONE PNH NON È UNO STATO PRELEUCEMICO!!!IL CLONE PNH NON È UNO STATO PRELEUCEMICO!!!

La PNH è una rara patologia acquisita caratterizzata da La PNH è una rara patologia acquisita caratterizzata da un’espansione clonale non maligna di una o più cellule staminali un’espansione clonale non maligna di una o più cellule staminali ematopoieticheematopoietiche

•Sono affetti da PNH 8000-10000 persone nel Nord America e Europa Sono affetti da PNH 8000-10000 persone nel Nord America e Europa Occidentale Occidentale

•Età di insorgenza: 30-40 anni (10% dei casi insorge a 21 anni o meno)Età di insorgenza: 30-40 anni (10% dei casi insorge a 21 anni o meno)

•50% dei pz muore per trombosi, infezioni (America – Europa 50% dei pz muore per trombosi, infezioni (America – Europa occidentale) o neoplasie ematologiche (Asia e paesi Orientali)occidentale) o neoplasie ematologiche (Asia e paesi Orientali)

•Sopravvivenza stimata 10 anniSopravvivenza stimata 10 anni

… … un po’ di dati…un po’ di dati…

•TerapiaTerapia mirata ad ogni singola caratteristica clinicamirata ad ogni singola caratteristica clinica

Classical PNHClassical PNH

PNH associata a bone marrow failurePNH associata a bone marrow failure

Subclinical PNH (nessun segno clinico di emolisi)Subclinical PNH (nessun segno clinico di emolisi)

……TERAPIA…TERAPIA…

CORTICOSTEROIDICORTICOSTEROIDI emolisi cronica emolisi cronica

ANDROGENI in possibile combinazione con STEROIDIANDROGENI in possibile combinazione con STEROIDIinibizione inibizione del complementodel complemento

SOMMINISTRAZIONE FERRO e FOLATI/TRASFUSIONI SOMMINISTRAZIONE FERRO e FOLATI/TRASFUSIONI anemia anemia

(attenzione alle patologie da sovraccarico di ferro e incompatibilità (attenzione alle patologie da sovraccarico di ferro e incompatibilità sistema ABO)sistema ABO)

WARFARINAWARFARINA trombosi trombosi

Ma il futuro è….Ma il futuro è….

ECULIZUMABECULIZUMAB(against complement C5)(against complement C5)

1. Parker C.J.,” The pathophysiology of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria”, Experimental Hematology 35, 523(2007)

2. Luzzatto L.,” Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria: an acquired genetic disease with somatic-cell mosaicism”, Current Opinion in Genetics & Development 16,317(2006)

3. Boccuni P. et al, “Glycosyl phosphatidylinositol (GPI)-anchored molecules and the pathogenesis of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria”, Critical Reviews in Oncology:Hematology 33, 25 (2000)

4. Dacie J.V., Lewis S.M.,”Paroxymal Nocturnal Haemoglobinuria: clinical manifestations, haematology, and nature of disease”, Ser.Haemat vol V,3 (1972)

5. Meletis J., Terpos E.,”Recent insights into the pathophysiology of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria”, Med Sci Monit, 9(7),161 (2003)

6. Savage W.,Bodsky R.A., “New insight into paroxymal nocturnal haemoglobinuria”, Haematology, 12(5),371(2007)

7. Moyo V.M. et al,” Natural history of paroxysmal nocturnal haemoglobinuria using modern diagnostic assays”, British Journal of Haematology, 126, 133 (2004)

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10. Bessler M. et al, “Paroxysmal nocturnal haemoglobinuria (PNH) is caused by somatic mutations in the PIG-A gene”, The EMBO Journal, vol. 13, 110(1994)

11. Hu R. et al, “PIG-A mutations in normal hematopoiesis”, Blood, n°10, vol105, 3848(2005)

……References…References…

11. Johnson R.J., Hillmen P.,” Paroxymal nocturnal haemoglobinuria: nature’gene therapy”, J Clin Pathol: Mol Pathol, 55,145 (2002)

12. Parker C. et al, “Diagnosis and management of paroxymal nocturnal haemoglobinuria”, Blood, n°12, volume 106, 3699 (2005)

13. Karadimitris A. et al,” Severe telomere shortening in patients with paroxysmal nocturnal hemoglobinuria affects both GPI and GPI hematopoiesis”, Blood, n°13, volume 102, 514 (2003)

14. Parker J. et al, “Eculizumab”, Nature Review-Drug Discovery, 6,515 (2007)