Trasduzione del segnale

La comunicazione intercellulare: trasmettitori e recettori

La comunicazione tra cellule permette agli organismi di adattarsi in modo coordinato e continuo alle variazioni ‘ambientali’.

Le cellule comunicano mediante mediatori chimici di natura molto varia

Il mediatore viene prodotto e secreto da un tipo cellulare

La cellula cui è destinata la comunicazione, cellula ‘bersaglio’, ha recettori in grado di riconoscere il mediatore

Il legame del ligando al recettore attiva una serie di eventi denominati nel complesso trasduzione del segnale. Il trasferimento del segnale all’interno della cellula ha come risultato l’induzione di risposte cellulari specifiche e/o cambiamenti nell’espressione genica.

Trasduzione del segnale

Interazioni farmaco-recettore

Il binding di un ligando a un

recettore causa una risposta

positiva o negativa. Una risposta positiva può

essere o un immediato effetto fisiologico

(apertura di un canale ionico) oppure una serie di

eventi biochimici che generano una appropriata

risposta biologica.

Ligando e recettore

Cl

N

OO2N

O O

N+H

OH

OHCOO-

N(CH3)2N(CH3)2

NH2

Leg. idrofobico

Legame idrogeno

Legame ionico

Interaz. ione-dipolo

Complesso con trasferimento di carica

Legame dipolo-dipolo

Cascata di segnali

Ligando Recettore

Regolazione del

metabolismo

Modulazione

Regolazione dell’espressio

ne genica

Riorganizzazione del

citoscheletro

Amplificazione

Divergenza

Il segnale viene trasferito all’appropriato comparto cellulare

Trasdotto in forma riconoscibile Amplificato Distribuito a più di un bersaglio

intra-cellulare Modulato

In base alla localizzazione subcellulare si distinguono:

Recettori di membrana Recettori intracellulari

Trasduzione di segnali indotti da mediatori idrofilici:

Neurotrasmettitori

Fattori di crescita

Citochine

Trasduzione di segnali indotti da mediatori lipofilici:

Ormoni steroidei e tiroidei

Acido retinoico

Vitamina K

I RECETTORI

canali

Recettore di membrana

N

Acetilcolina (nicotinici) ATP/UTP (P2X) Glutammico/Aspartico (NMDAR, Kainato,AMPAR) Glicina Serotonina (5HT3)

1TM CITOCHINE FATTORI di CRESCITA Insulina, GH, PRL, EPO Attivina, AMH, TNF, Toll-like

7TM CHEMOCHINE PROSTAGLANDINE LEUCOTRIENI, TROMBOSSANI ORMONI PEPTIDICI (ACTH, ADH, Angiotensina, Bradichinina, adrenalina, calcitonina, glucagone, ossitocina, paratormone, TSH….)

Recettori Canale

complessi macroproteici transmembranari che formano un canale ionico (aperto dal legame con il

neurotrasmettitore o con farmaci agonisti) e consentono il passaggio di ioni lungo gradiente

A. Lo stimolo efficace modula una corrente ionica (corrente di recettore, cdr).

B. La cdr genera un potenziale di recettore (pdr) graduale simile ai potenziali postsinaptici.

C. Il pdr modula la scarica di potenziali d’azione nelle fibre nervose afferenti dirette al SNC.

Oligomeri formati da 3, 4 o 5 subunità che si organizzano a formare un poro canale per cationi o per anioni. La loro apertura può determinare depolarizzazione o iperpolarizzazione, rapidi cambiamenti delle concentrazioni ioniche intracellulari e del

potenziale elettrico transmembranario

Recettori Canale

I Recettori Accoppiati a Proteine G (GPCR) rappresentano una famiglia di > 1000 membri strutturalmente correlati. Queste proteine sono anche chiamate Recettori a 7 Domini Transmembrana.

Recettori accoppiati a proteine G (GPCR)

Unica catena polipeptidica che attraversa sette volte la membrana tre loops extracellulari e tre intra.

Diversi sistemi effettori: Enzimi Canali ionici Proteine di trasporto

N

C

E1 E2 E3

α β γ

GDP

Amine biogene

Aminoacidi e ioni Lipidi

Peptidi e proteine

I trasduttori dei recettori di membrana: Le Proteine G

MONOMERICHE Ras, Rho, Rab, Arf, Ran ETEROTRIMERICHE

β γ α GDP

β γ α GDP

β γ α GDP Recettore

7TM

trasduttore

β γ α GDP GTP

β γ α GTP

β γ α GTP

effettore β γ α

GDP Pi

PROTEINE G eterotrimeriche: CICLO di FUNZIONAMENTO

gli effettori di α e βγ trasduzione dei recettori 7TM: PROTEINE G eterotrimeriche

b g a GDP

a12 GTP

Rho

regolazione della espressione genica

ai GTP

cAMP

-AC

as GTP

+AC

cAMP

aq GTP

DAG Ca2+ PKCs

+PLCb

nucleo Fattori di trascrizione

b g canali PI3K PLCb AC

RISPOSTE FISIOLOGICHE: Proliferazione, Differenziazione Sviluppo Sopravvivenza Angiogenesi Ipertrofia cancro

a GTP

L’adenilato ciclasi può essere condivisa da recettori diversi

Adenilato Ciclasi R1 R2

As

Gs Gi

Ai

GDP GTP

- GTP

GDP

cAMP ATP

+

Proteina

Proteina Pi

Reg C

C

Protein Kinasi A inattiva (PKA)

Reg

C

PKA attiva

C +

La trasduzione del segnale del cAMP

L’ADH trasduce il segnale tramite cAMP nelle cellule principali della porzione distale del tubulo e del dotto collettore renale

Un esempio di trasduzione tramite cAMP

PKC

PKC

L’attivazione delle PLCb e g porta alla sintesi di IP3 (che provoca rilascio di Ca2+) e di DAG; insieme attivano le PKC

R Gq

PIP2 PLCb DAG

Reticolo endoplasmatico Ca2+

IP3

CaM

La Ca2+/CaM si lega ad altre proteine variandone l’attività funzionale

La trasduzione del segnale affidata al Ca2+: le CaM

Forma estesa

Forma più compatta

Ca2+/CaM legata alla

proteina bersaglio

Ca2+

4 Ca2+ si legano alle Ca2+-binding proteins chiamate CALMODULINE, CaM

CaMKI

substrati

CaMKIV

MAPK

Fattori di trascrizione

nucleo

CaMKK

Ca2+

CaM

La trasduzione del Ca2+ : le CaMKs La via delle chinasi Ca2+-calmodulina-dipendente

La concentrazione di Ca2+ nel citosol è tenuta bassa dall’azione delle calcio-ATPasi del RE, mambrana plasmatica, scambiatori Na+/ Ca2+ e dei mitocondri. L’aumento delle concentrazioni nel citosol è dovuto all’apertura dei canali nella membrana e al rilascio attraverso i recettori canali IP3 o i recettori sensibili alla rianodina presenti nel RE.

Regolazione del Ca2+ nelle cellule

sono classificate in base alla loro struttura e regolazione

DAG/PMA Ca2+ ATP substrato

Dominio regolatorio Dominio catalitico

cPKC= convenzionali (a bI bII g)

DAG/PMA ATP substrato nPKC= nuove (d e q h)

ATP substrato

aPKC= atipiche (l z i)

le PKC: importanti protein chinasi della trasduzione

Attivazione di substrati citosolici e di fattori di trascrizione nucleari

Raf

Raf localizzato

sulla membrana

ERK (MAPK)

MEK (MAPKK)

PKC (MAPKKKK)

Pi

ATP

ADP

Ras attivato lega la chinasi RAF (una MAPKKK)

GTP Ras

Raf inattivo

e citosolico

Raf

PROTEINE MONOMERICHE

Spegnimento della subunità a della proteina G

La subunita α è dotata di una attività GTPasica intrinseca: idrolizza GTP a GDP e Pi e si riassocia alle subunità βγ per riformare la proteina G inattiva

Le proteine RGS (regolatrici della segnalazione della

proteina G)

Sono proteine che attivano la GTPasi Ruolo cruciale nello spegnimento di risposte mediate da proteine G Circa 25 proteine codificate nel genoma umano: ognuna interagisce con una serie di proteine G

GRK

α β γ

P P P

-arrestina β

La fosforilazione tramite GRK spesso non è sufficiente per inattivare completamente i

recettori; la completa inattivazione richiede un componente addizionale, l’arrestina

α β γ

1. disaccoppiamento recettore-proteine G in risposta alla fosforilazione del recettore tramite le GRK (G protein-

coupled receptor Kinase)

Relatore

Note di presentazione

La b-arrestina porta il recettore su vescicole rivestite di clatrina, interagendo con clatrina stessa e adattina, molecola che fa parte del macchinario delle vescicole.La dinamina che è una GTPase determina il distacco delle vescicole dalla membrana ed il recettore o è rapidamente riciclato o passa in endosomi e viene lentamente riclicato, o viene degradato.

U U

U U

Proteine Effettrici della Trasduzione

U U

U U

effettore

effettore “DOCKING”

U U

RECETTORI 1TM: OLIGOMERIZZAZIONE FUNZIONALE

R1 R2

insulina

Ras attivo

GTP

Recettore inattivo

P

P

P

P

Recettore attivo

SOS

GRB2

Funzionamento di recettori 1TM della tipologia tirosin-chinasici: la trasduzione del segnale tramite la via MAPK

Chinasi a cascata

La cascata raf Mek-1 Erk-1 è un esempio di MAP chinasi a cascata. È stato descritto un certo numero di queste cascate, e sebbene utilizzino chinasi specifiche, le catene di trasduzione sono molto simili…

raf

Erk1

Mek1

ATP

ADP

ATP

ADP

Mekk1

Jnk1

MKK4

ATP

ADP

ATP

ADP

MLK3

Jnk2

MKK7

ATP

ADP

ATP

ADP

MAP chinasi chinasi chinasi

MAP chinasi chinasi

MAP chinasi

Fattore di Crescita Stress Citochine

Chinasi Serina/treonina

Chinasi a specificità duale

Chinasi Serina/treonina

N.B. La modalità di attivazione della prima chinasi della cascata

varia e dipende dal segnale

Recettore classico per il fattore di crescita EGF. Unico segmento transmembrana, Con la porzione intracellulare ad attività tirosin-kinasica. In seguito ad attivazione, si ha dimerizzazione e fosforilazione incrociatadi residui tirosinici. Formazione di siti di legame con domini SH2 per proteine citosoliche

Recettori per l’adesione cellulare Trasmissione del segnale all’interno della cellula per la regolazione di funzioni quali

Movimento, proliferazione, sopravvivenza cellulare e trascrizione genica

Immunoglobuline (ICAM-1, ICAM-2, VCAM, CD31) Mediano le interazione tra linfociti e cellule endoteliali Caderine partecipano alla formazione delle “giunzioni aderenti” Selectine espresse sui leucociti e cellule endoteliali. Migrano dal sangue all’interstizio sottoendoteliale in presenza di infezione o danno tissutale. Integrine mediano l’adesione delle cellule alle proteine della matrice extracellulare

Integrine inducono la formazione di complessi multimolecolari

RECETTORI AD ATTIVITA’ ENZIMATICA Recettore per le citochine

I recettori delle citochine non presentano attività chinasica intrinseca ma, dopo attivazione, si associano a chinasi note come JAK (janus chinasi), che sono il

primo passo nella cascata chinasica.

Legame con la citochina- recettore che attrae una tirosinchinasi citosolica (Jak) che si associa e fosforila il dimero recettoriale. Fosforilazione STAT, traslocazione nel nucleo.

Attivazione espressione genica.

Recettori “decoy”

recettori che funzionano da trappole molecolari

Recettori per le citochine che possiedono la sequenza che deve riconoscere il ligando, ma non possiedono il dominio intracellulare che è importante per la trasduzione del segnale. Derivano dai recettori per le citochine o per meccanismo di proteolisi o di splicing alternativo e possono restare ancorati alla membrana o possono essere secreti all'esterno della cellula.

ABP (Acetilcolin Binding Protein) proteina di legame all'acetilcolina, omologa ai recettori tronchi che si comportano come trappole per i neurotrasmettitori. Regola la trasmissione colinergica andando a creare un equilibrio tra recettore vero, quello di membrana, e il recettore “falso”, quello trappola che può essere secreto nel vallo sinaptico. Tale recettore-trappola è ugualmente formato da 5 subunità ma la caratteristica è di non avere un canale, quindi non può trasdurre nessun segnale.

Recettori “decoy”

Recettori attivatori di apoptosi

Recettori per TNF

TNF-R1: espresso costitutivamente nella maggior parte dei tessuti e può essere attivato completamente sia dalla frazione di TNF legata alla membrana sia dalla forma trimerica solubile. TNF-R2: solo nelle cellule del sistema immunitario e risponde solo alla forma omotrimerica integrale del TNF.

DEATH DOMAIN

CRDs In seguito al legame con il ligando si formano trimeri, con conseguente cambiamento conformazionale.

1) dissociazione della proteina inibitoria SODD dal dominio intracellulare detto “di morte” (Death Domain DD).

2) la proteina adattatrice TRADD è in grado di legarsi al DD:

Attivazione di NF-kB

Attivazione della via della MAP chinasi

Induzione apoptosi

Recettori “Toll-like” recettori a singolo segmento transmembrana

quando attivati, scatenano una risposta di tipo infiammatorio

Le cascate di segnale dipendono dalla

tipologia del recettore e possono coinvolgere numerosi mediatori tra cui le

MAP-Kinasi e il fattore infiammatorio

NF-kB.

GC

ANFR

GTP cGMP

il cGMP attiva la PKG

PKG inattiva

PKG attiva

ERK

MEK

PKCs Pi Raf

ATP ADP

PROLIFERAZIONE

GTP

GDP

fosforilazione di Ser43 e inibizione

Recettori con attività Guanilato ciclasica Recettori ad attività enzimatica con struttura semplice.

Unica catena che attraversa la membrana una sola volta, con un dominio extracellulare che si lega ai ligandi e un dominio intracellulare che attiva la

guanilato-ciclasi con la formazione del secondo messaggero GMP-ciclico (cGMP).

Ossido di azoto e cGMP

Stores Intracellulari del Ca++

Ca2+

NO

Arginina

+ Citrullina NO Sintetasi

Ca++

Ca++ CaM

cGMP GTP

NO

Guanilato Ciclasi Solubile

sGC

Canali ionici Protein chinasi cGMP-Dipendente (PKG)

GMP PDE

Il legame dell’acetilcolina alle cellule endoteliali stimola la produzione Di NO, che diffonde nelle cellule della muscolatura liscia adiacente e Stimola la guanilato ciclasi con conseguente rilassamento muscolare

N

Recettore nucleare

1. Recettori per gli ormoni STEROIDEI aldosterone, cortisolo, estradiolo, progesterone, testosterone 2. Recettore per la vitamina D3 attivata: VDR (1,25-diOH-colecalciferolo) 3. J2R (15-deoxyD12,14-prostaglandina J2) 4. Recettori per i retinoidi RXR (9-cis-acido retinoico) RAR (all-trans-acido retinoico) 5. Recettori epatici LXR ((7a-) (20-) (22-) (24-) (27-)-OH-colesterolo 6. Recettori per gli ormoni tiroidei TR (T3, T4)

i Recettori Nucleari

Recettore Nucleare per gli steroidi

hsp90

DNA

in assenza di ormone interagiscono con le proteine hsp (heat shock proteins) che ne mascherano il sito di legame

per il DNA

i recettori nucleari per gli ormoni steroidei

Attivazione della trascrizione genica operata da recettori nucleari per gli ormoni steroidei (ER)

E2

hsp70 hsp70 ER hsp90

hsp50 ER

hsp90

hsp50

HAT

TATA ER ER

ER ER

hsp90 hsp50

hsp90 hsp50

hsp70 hsp70

Recettori Nucleari: Rimodellamento del nucleosoma tramite HISTONE ACETYLTRANSFERASES (HAT)

& HISTONE DEACETYLASES (HDAC) Le acetilasi istoniche trasferiscono gruppi acetilici agli istoni e allentano le

interazioni tra essi e il DNA, e tra nucleosomi e nucleosomi. Questo provoca scompattamento del nucleosoma e facilita l’accesso di attivatori della

trascrizione al promotore

HAT

Le deacetilasi istoniche rimuovono gruppi acetilici e ristabiliscono la compattezza del nucleosoma, limitando l’accesso dei fattori di trascrizione

HDAC

I recettori nucleari per gli ormoni non-steroidei non interagiscono con le proteine hsp, ma si trovano legati al DNA in assenza di ormone ed eterodimerizzano con RXR

RXR TR

TRE

RXR RAR

RaRE

RXR VDR

DRE

RXR RXR

RxRE

Recettori Nucleari funzionanti con RXR

HDAC

RXR RAR

Trascrizione Repressa

HAT

RXR RAR

+ ormone AC AC

AC AC

Trascrizione Attivata

Recettori Nucleari funzionanti con RXR

Un singolo segnale può attivare diverse vie

ras raf ras

GTP PLCg

DAG

PKC

Effetti multipli p.es. Differenziamento

Proliferazione

Cascata delle MAP chinasi

Il legame del fattore di crescita epidermica al suo recettore attiva la via delle MAP chinasi attraverso

ras

Il legame del fattore di crescita epidermica al suo recettore attiva la fosfolipasi C g (PLCg)

portando alla produzione di diacilglicerolo (DAG) e all’attivazione della protein chinasi C

(PKC)

Segnali multipli – ‘Crosstalk’ di recettori

Immaginate che una cellula riceva due segnali. Il segnale A inibisce la proliferazione, mentre il segnale B stimola la proliferazione…

A B

chinasi Il segnale A attiva una chinasi…

…che fosforila e inattiva il recettore per il segnale B -

risultato – nessuna proliferazione

Se il ‘crosstalk’ lavora solo in una direzione (da A a B) allora il segnale A sarà dominante Se il ‘crosstalk’ lavora in entrambe le direzioni, ciò che accadrà dipenderà da diversi fattori p.es.

Timing della percezione del segnale Densità relativa dei recettori Ampiezza relativa del segnale

Reti di signaling e comunicazione incrociata (cross-talk)

Una ipotetica rete di signaling. La rete consiste in sei recettori e tre protein kinasi citosoliche. Ciascun recettore attiva (frecce verdi) o inibisce (linea nera) la kinasi 1 o la 2 o entrambe con un meccanismo non specificato. Poichè i segnali convergono sulla kinasi 3 (la kinasi di output), questa rete si attiverà massimalmente solo quando saranno presenti combinazioni specifiche di stimoli extracellulari.

molecole della matrice fattori di crescita

kinasi 1 kinasi 2

kinasi 3

Regolazione multipla della glicogenolisi mediata da diversi secondi messaggeri

cAMP-dependent protein kinase (cAPK). glycogen phosphorylase kinase (GPK) GP=glycogen phosphorylase; GS=glycogen synthase.

Cellule del fegato

stimolazione b-adrenergica

Diminuzione della glicogeno-sintesi

Aumento della glicogeno-lisi